转化生长因子β1诱导永生化人前软骨干细胞向髓核样细胞分化的实验研究

  目的 研究转化生长因子β1 (TGF-β1) 诱导永生化人前软骨干细胞 (IPSCs) 向髓核样细胞分化的可行性。方法 将体外培养的IPSCs 接种于温敏型壳聚糖水凝胶 (C/GP) 三维支架上,加入含TGF-β1的诱导培养基,低氧条件下进行诱导培养,观察三维支架上IPSCs的生长及分化情况。7 d后行Alcian Blue染色,分析细胞外基质糖胺聚糖（GAG）合成情况,并收集细胞,提取RNA。RT-PCR检测诱导前后髓核样细胞标志基因Ⅱ型胶原（Collagen Ⅱ）和蛋白聚糖（Aggrecan）的表达情况,Western Blot 检测诱导前后细胞内β-catenin蛋白表达水平的变化。结果 IPSCs在三维支架上生长状态良好,诱导7 d 后,Alcian Blue染色表明,细胞外基质GAG的合成明显增多,实验组（诱导培养基）明显多于对照组（普通培养基）。RT-PCR证实Ⅱ型胶原和Aggrecan的基因表达水平明显增高,实验组明显高于对照组;Western Blot证实细胞内β-catenin蛋白表达水平明显上调,实验组明显高于对照组。结论 IPSCs经TGF-β1诱导可在体外定向分化为髓核样细胞,诱导分化后的细胞具有良好的分泌功能,能够有效地分泌细胞外基质成分。TGF-β1可能通过上调细胞内β-catenin的表达诱导IPSCs向髓核样细胞分化。     

TGF—β1基因修饰诱导脂肪干细胞成软骨分化的实验研究

[目的]本研究通过选择对软骨细胞ECM合成具有促进作用的TGF-β1转染脂肪干细胞(ADSCs),观察转染后目的基因的稳定表达和对软骨细胞外基质(ECM)的两种重要组分:Ⅱ型胶原(type Ⅱ collage,ColⅡ)和aggrecan的合成,为构建新型的组织工程软骨提供实验依据.[方法]TGF-β1基因转染脂肪干细胞及阳性细胞克隆株的筛选;RT-PCR检测TGF-β1、纤连蛋白(fibronectin,FiN)、ColⅡ、Aggrecan的表达;Western-blot检测TGF-β1.[结果]RT-PCR结果显示:实验组(TGF-β1稳定转染组)的TGF-β1、FN、Col Ⅱ、Aggrecan的表达较空染组和正常对照组均明显增多(P＜0.01);Western blot检测实验组(TGF-β1稳定转染组)TGF-β1蛋白的表达较空染组和正常对照组均明显增多(P＜0.01).[结论]成功分离培养脂肪干细胞;以脂质体介导法将TGF-β1目的基因成功转染ADSCs,转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多,表明转染TGF-β1基因可以促使ADSCs向软骨细胞方向分化,从而为软骨组织工程提供新的思路和方法.     

长链非编码RNA MEG3靶向下调miR-21对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡及炎症反应的影响

目的探究长链非编码RNA母系表达基因3(MEG3)靶向miR-21的作用对白细胞介素1β(IL-1β)诱导的软骨细胞凋亡及炎症反应的影响及其作用机制。方法将细胞分为cTRL组、IL-1β组、LV-MEG3组、miR-21 mimic组和LV-MEG3+mimic组,用IL-1β处理软骨细胞后,加入对应的慢病毒或miRNA mimic处理细胞。RT-PCR检测MEG3、miR-21、基质金属蛋白酶13(MMP-13)、II型胶原蛋白(Collagen II)、聚蛋白聚糖(Aggrecan)基因表达水平,Hoechst检测细胞凋亡,Western blot检测活化半胱天冬酶3(cl-Caspase-3)、cl-Caspase-9、MMP-13、Collagen II、Aggrecan蛋白表达水平和p65、信号传导及转录激活因子3(STAT3)磷酸化比率,试剂盒检测丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-10水平,免疫荧光检测p65的核定位情况。结果与cTRL组比较,IL-1β组miR-21表达,细胞凋亡率,MMP-13基因表达,cl-Caspase-3、cl-Caspase-9、MMP-13蛋白表达,MDA、LDH、TNF-α、IL-6水平,p65和STAT3磷酸化比率,p65核内信号水平升高,MEG3表达,Collagen II、Aggrecan基因和蛋白表达,SOD、GSH、IL-10水平降低;与IL-1β组比较,LV-MEG3组miR-21表达,细胞凋亡率,MMP-13基因表达,cl-Caspase-3、cl-Caspase-9、MMP-13蛋白表达,MDA、LDH、TNF-α、IL-6水平,p65和STAT3磷酸化比率,p65核内信号水平降低,MEG3表达水平,Collagen II、Aggrecan基因和蛋白表达水平,SOD、GSH、IL-10水平升高;miR-21 mimic组各项检测指标的变化与LV-MEG3组相反;与miR-21 mimic组比较,LV-MEG3+mimic组miR-21表达,细胞凋亡率,MMP-13基因表达,MMP-13、cl-Caspase-3、cl-Caspase-9蛋白表达,MDA、LDH、TNF-α、IL-6水平,p65和STAT3磷酸化比率,p65核内信号水平降低,MEG3表达水平,Collagen II、Aggrecan基因和蛋白表达,SOD、GSH、IL-10水平升高。结论MEG3可下调miR-21表达,从而抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡,缓解炎症反应,其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路激活有关。     

长链非编码RNA NEAT1调控miR-486/FOXO1轴参与椎间盘髓核细胞退变的机制研究

【摘要】 目的：明确长链非编码RNA核富集转录本1（lncRNA NEAT1）、miR-486、FOXO1之间的相互关系,探讨三者在椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IDD）组织中的表达及相关性,阐明NEAT1通过调控miR-486/FOXO1轴参与IDD进展的具体机制。方法：利用双荧光素酶报告基因、RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation,RIP）试验等明确NEAT1、miR-486与叉头框蛋白O1（forkhead box protein O1,FOXO1）的生物学关系;采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）、免疫印迹（Western blot）检测15例对照和30例IDD髓核组织中NEAT1、miR-486与FOXO1的表达,统计其与Pfirrmann分级的关系;采用白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）诱导法构建髓核细胞退变模型,NEAT1小干扰RNA（NEAT1 small interfering RNA,si-NEAT1）和过表达质粒转染髓核细胞构建细胞沉默或过表达模型;细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）和流式细胞术检测髓核细胞增殖和凋亡;RT-qPCR检测细胞NEAT1与miR-486表达;Western blot检测FOXO1及细胞外基质（extracellular matrix,ECM）中聚集蛋白聚糖（aggrecan）、二型胶原（collagen Ⅱ）、基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase, MMP-13）和含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样基质金属蛋白酶4（a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type l motifs 4,ADAMTS4）的表达。结果：NEAT1可通过碱基互补配对方式海绵吸附miR-486;miR-486靶向FOXO1的3′-非编码区（3′-UTR）抑制FOXO1蛋白表达。在IDD髓核组织中,NEAT1与FOXO1表达上调,与Pfirrmann分级呈显著正相关（P<0.001）;而miR-486表达下调,与Pfirrmann分级呈显著负相关（P<0.001）。分子细胞学实验证实,IL-1β诱导髓核细胞退变后,NEAT1的过表达进一步促进了髓核细胞凋亡（P<0.01）,加重了Aggrecan和Collagen Ⅱ的表达抑制（P<0.01）,增强了MMP-13和ADAMTS4的表达（P<0.01）;相比之下,NEAT1的沉默则逆转了髓核细胞凋亡（P<0.01）,有效恢复了Aggrecan和Collagen Ⅱ表达（P<0.01）,同时显著降低了MMP-13和ADAMTS4的表达（P<0.01）。结论：NEAT1调控miR-486/FOXO1分子轴并促进髓核细胞凋亡和ECM降解进而参与IDD病理机制过程。     

rAAV2-hTGF-β1转染犬MSCs诱导分化为软骨细胞的研究

目的 探讨rAAV2-hTGF-β1体外转染犬MSCs定向分化为软骨细胞的可行性.方法 应用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养犬MSCs,倒置显微镜及Giemsa染色观察细胞形态,流式细胞技术鉴定其表面标记物.取第三代MSCs,分别以感染复数(MOI)为1×105病毒基因数/细胞v.g./cell)、5×105v.g./cell的rAAV2-hTGF-β1进行转染.培养后定期取各组细胞进行相关检测.Western blot检测hTGF-β1的表达,ELISA法测定hTGF-β1的含量,RT-PCR检测Ⅱ型胶原、Aggrecan mRNA的表达,免疫细胞化学法检测Ⅱ型胶原的表达.结果 原代及传代培养的MSCs呈梭形外观,具有较强的增殖能力.细胞表面抗原CD29、CD44、CD105表达阳性,CD34、CD45表达阴性.rAAV2-hTGF-β1转染MSCs后,Western blot法检测到目的 蛋白hTGF-β1稳定表达:ELISA法检测转染组MSCs培养上清液中的hTGF-β1表达,且随时间的延长,各组hTGF-β1浓度逐渐增加,MOI 5×105组表达量明显高于MOI 1×105组(P<0.01);RT-PCR检测到各转染组Ⅱ型胶原、Aggrecan mRNA表达,免疫细胞化学法检测转染组细胞Ⅱ型胶原呈阳性表达,且高MOI值组表达强度明显高于低MOI值组.结论 rAAV2-hTGF-β1转染犬MSCs后可定向分化为软骨细胞,作为软骨组织工程的种子细胞是可行的.     

红景天苷通过JAK2/STAT3通路抑制退变髓核细胞的炎症反应和凋亡

目的观察红景天苷对退变髓核细胞凋亡和炎症反应的影响,并探究其与JAK2/STAT3信号通路的关系。方法通过氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)培养建立退变髓核细胞模型,退变细胞分别予浓度为10μg/mL、30μg/mL和50μg/mL的红景天苷培养液。后续实验选择30μg/mL浓度进行,分为Control组、OGD组、红景天苷组、AG490(JAK2/STAT3信号通路抑制剂)组和红景天苷联合AG490干预组。RT-PCR法检测髓核细胞蛋白聚糖(Aggrecan)和Ⅱ型胶原(Col2a1)表达水平;Western blot检测红景天苷对髓核细胞p-JAK2和p-STAT3蛋白水平的影响;ELISA检测上清液中炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平,流式细胞术检测髓核细胞的凋亡。结果与Control组相比,OGD组Aggrecan和Col2a1 mRNA表达明显降低,炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高,p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平明显上调。与OGD组相比,红景天苷组显著抑制细胞凋亡以及炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6的释放,同时,我们发现,AG490组和红景天苷联合AG490干预组上述指标均明显降低,其中红景天苷联合AG490干预组各检测指标较AG490组略低。红景天苷联合AG490干预明显改善髓核细胞的凋亡和炎症反应,并抑制JAK2和STAT3的磷酸化水平。结论红景天苷可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路的活化而减轻退变髓核细胞炎症因子的产生和细胞凋亡。     

NOB1基因对膀胱癌细胞凋亡的影响及其机制研究

目的探讨干扰NOB1基因对膀胱癌细胞凋亡和Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法将膀胱癌T24细胞分为对照组(CON组),不进行转染、siRNA阴性对照组(siRNA-CON)、NOB1-siRNA组。分别采用RT-PCR和Western blot检测转染后三组细胞中NOB1 mRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测细胞活力;流式细胞技术检测细胞凋亡情况;Western blot检测β-catenin和c-Myc蛋白表达水平。用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535处理NOB1-siRNA组细胞,设置为NOB1-siRNA-FH535组,检测细胞活力、细胞凋亡情况和β-catenin、c-Myc蛋白表达水平。结果NOB1-siRNA组NOB1 mRNA和蛋白表达水平均低于siRNA-CON组和CON组,差异有统计学意义(P<0.05)。NOB1-siRNA组细胞活力低于siRNA-CON组和CON组,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞检测结果显示,NOB1-siRNA组细胞凋亡率高于siRNA-CON组和CON组,差异有统计学意义(P<0.05)。NOB1-siRNA组β-catenin和c-Myc蛋白表达水平均低于siRNA-CON组和CON组,差异有统计学意义(P<0.05)。NOB1-siRNA-FH535组细胞活力低于NOB1-siRNA组(P<0.05)。流式细胞技术检测结果显示,NOB1-siRNA-FH535组细胞凋亡率高于NOB1-siRNA组(P<0.05)。Western blot检测结果显示,NOB1-siRNA-FH535组β-catenin及c-Myc蛋白表达水平低于NOB1-siRNA组(P<0.05)。结论干扰NOB1表达可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活而促进膀胱癌细胞的凋亡。     

人转化生长因子β1重组腺病毒转染传代髓核细胞对细胞外基质合成的影响

目的探讨人转化生长因子融（transforming growthfactorβ，TGF-β1）对传代羊髓核细胞的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）和DNA合成调节因子的作用。方法取1岁龄成年山羊腰椎间盘，体外分离培养羊髓核细胞，传至第3代后以携人TGF-β1（humanTGF-β1，hTGF-β1）或lacZ基因的复制缺陷型腺病毒（Ad／hTGF—β1及Ad／lacZ）感染，分别为实验组和阴性对照组；未加病毒液的细胞为空白对照组；原代髓核细胞为原代组。然后继续单层或藻酸钙凝胶三维（3-D）培养10d。对两种系统培养的细胞分别行DNA荧光定量、Westernblot分析和蛋白多糖（glycosaminoglycan，GAG）定量检测。结果DNA荧光定量显示，单层培养时实验组细胞的DNA合成显著高于两对照组（P〈0．05），藻酸钙凝胶3-D培养各组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）。Western blot检测hTGF—β1、Ⅱ型胶原、Ⅰ型胶原和Aggrecan的表达显示，两种培养系统中，实验组hTGF—β1、Ⅱ型胶原和Aggrecan的表达均显著高于两对照组（P〈0．05），Ⅰ型胶原的表达显著低于两对照组（P〈0．05），实验组Ⅱ型胶原／Ⅰ型胶原比值较两对照组显著增高（P〈0．05）。GAG定量结果显示，两种培养系统中实验组细胞的GAG合成均显著高于两对照组（P〈0．05）。结论hTGF-β1在很大程度上可起到维持髓核细胞表型，并在细胞传代后仍发挥表型的调节作用。通过基因工程方法使髓核细胞表达hTGF—β1，有望遏制、甚至逆转椎间盘退变；而以Ad／hTGF—β1感染过的髓核细胞，在藻酸钙凝胶3-D培养系统中培养则表现出原始表型。     

ROCKⅠ/Ⅱ在转化生长因子β1诱导的主动脉平滑肌细胞表型转化中的作用

目的:探讨ROCKⅠ/Ⅱ在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人主动脉平滑肌细胞(HA-VSMC)表型转化中的作用。方法:将HA-VSMC分别转染ROCKI和ROCKII的si RNA后荧光显微镜观察转染情况,并用Western blot方法检测不同处理的HA-VSMC(ROCKI si RNA转染、ROCKII si RNA转染、+TGF-β1、ROCKI si RNA转染+TGF-β1、ROCKII si RNA转染+TGF-β1)中ROCKI和ROCKII蛋白的表达;分别用Western blot和RT-PCR方法检测不同处理的HA-VSMC(+TGF-β1、ROCKI si RNA转染+TGF-β1、ROCKII si RNA转染+TGF-β1、ROCK非特异性抑制剂Y-27632预处理+TGF-β1)中细胞收缩表型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌22α(SM22α)与合成表型标志物骨桥蛋白(OPN)的蛋白与m RNA表达,均以无处理的HA-VSMC为空白对照。结果:免疫荧光观察与Western blot检测表明两种si RNA均成功转染;TGF-β1处理后,HA-VSMC中ROCKI蛋白表达明显升高(P0.05),但ROCKII蛋白表达无明显变化(P0.05),ROCKI si RNA转染后TGF-β1上调ROCKI的作用被明显抑制(P0.05)。与空白对照组HA-VSMC比较,TGF-β1处理后的HA-VSMC中α-SMA、SM22α的蛋白和m RNA表达明显降低,而OPN蛋白与m RNA表达明显升高(均P0.05),ROCKI si RNA转染或Y-27632预处理后,TGF-β1的上述作用均明显减弱(均P0.05),ROCKII si RNA转染对TGF-β1的上述作用均无明显影响(均P0.05)。结论:TGF-β1可诱导HA-VSMC由收缩表型向合成型表型转化,ROCKI表达的升高可能在这一转化中起主要作用。     

sox-9通过Wnt3a/β-catenin通路促进大鼠骨髓间充质干细胞分化

目的探讨sox-9对骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖能力和分化能力的影响。方法分离并鉴定BMSCs,对细胞进行sox-9过表达和敲降处理。将细胞分为对照组、过表达对照组、干扰对照组、sox-9过表达组、sox-9干扰组。CCK8法检测细胞增殖活性;免疫组化观察细胞的Ⅱ型胶原蛋白(CollageⅡ)和聚蛋白聚糖(Aggrecan)表达水平; Western blot检测细胞sox-9、Wnt3a、β-连环蛋白(β-catenin)表达水平。结果各组细胞增殖能力无显著差异(P0.05); sox-9过表达组的Collage Ⅱ和Aggrecan表达显著升高,而Wnt3a和β-catenin的表达显著降低(P0.05)。结论sox-9可能是调控间质干细胞向软骨细胞分化能力的关键因子,通过抑制Wnt3a/β-catenin信号途径,促进其向软骨细胞分化。     

晚期糖基化终末产物通过Wnt/β-catenin信号通路调控足细胞自噬和迁移

目的探讨晚期糖基化终末产物(AGEs)诱导Wnt/β-catenin信号通路活化对足细胞自噬和迁移的影响。方法将小鼠永生化肾足细胞系分为牛血清白蛋白组(100mg/L BSA)、糖基化终末产物组(100 mg/L BSA-AGEs)和糖基化终末产物+DKK-1组(100mg/L BSA-AGEs+100 DKK-1 mg/L),以未加干涉的正常足细胞为对照组。Western blot检测足细胞β-catenin蛋白、自噬膜蛋白微管相关蛋白轻链3-II(LC3-Ⅱ)以及自噬底物p62蛋白表达水平,免疫荧光观察足细胞自噬情况,ELISA检测细胞上清液中Nephrin蛋白含量,划痕试验检测足细胞迁移能力。用AGEs和AGEs+RAGE(糖基化终末产物受体)中和抗体处理足细胞系,Western blot检测足细胞β-catenin蛋白的表达。结果与对照组相比,AGEs组p-β-catenin、p62表达升高(P0.05),LC3-Ⅱ表达降低(P0.05)。AGEs+DKK-1组p-β-catenin、p62蛋白表达较AGEs组降低,LC3-Ⅱ表达升高(P0.05),但与对照组比较差异无显著性(P0.05)。BSA组各指标与对照组均无显著性差异(P0.05)。免疫荧光检测发现AGEs组足细胞中LC3荧光强度较对照组明显减弱,AGEs+DKK-1组较AGEs组LC3荧光强度增强,BSA组与对照组比较差异无显著性(P0.05)。AGEs组细胞培养上清中Nephrin含量较对照组明显降低(P0.05),AGEs+DKK-1组较AGEs组升高(P0.05),但仍低于对照组(P0.05),BSA组与对照组差异无显著性(P0.05)。与对照组相比,AGEs组足细胞迁移能力降低(P0.05),AGEs+DKK-1组、BSA组与对照组比较,差异无显著性(P0.05)。AGEs+RAGE中和抗体处理的足细胞β-catenin蛋白水平较AGEs组显著降低(P0.05)。结论 AGEs通过RAGE激活Wnt/β-catenin信号通路,抑制足细胞自噬和迁移能力,可能是糖尿病患者足细胞损伤机制之一,在糖尿病肾病的发生和进展中发挥重要调控作用。     

蜂毒肽对IL-1β诱导的大鼠腰椎终板软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响研究

目的观察蜂毒肽(Melittin)对IL-1β诱导的大鼠终板软骨细胞(endplate chondrocytes,EPCs)Ⅱ型胶原表达的影响。方法取4周龄SD大鼠进行腰椎EPCs培养,并行形态学观察、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫荧光染色鉴定。取第3代EPCs,采用MTT法确定IL-1β及Melittin对细胞干预的最适浓度。然后将第3代EPCs随机分为4组:A组为正常组,不加任何药物;B组加入最适浓度的IL-1β;C组加入最适浓度的Melittin;D组加入最适浓度的IL-1β及Melittin;干预48 h后采用Western blot法检测Ⅱ型胶原表达。结果倒置显微镜观察示,第1代细胞多呈多角形,第5代后细胞增殖能力逐渐减弱,细胞形态向梭形转变。细胞质中的酸性黏液物质(如蛋白多糖)被甲苯胺蓝染成深蓝色。免疫荧光染色标记Ⅱ型胶原后,可见细胞骨架部分呈阳性表达(呈绿色荧光)。MTT法检测示,在干预24、48 h后,IL-1β及Melittin对EPCs均有抑制作用,并呈剂量依赖性,最终确定IL-1β及Melittin干预的最适浓度分别为10 ng/mL和1.0μg/mL。Western blot法检测示,与A组比较,B组IL-1β干预后Ⅱ型胶原表达明显减少,C组Melittin干预后Ⅱ型胶原表达明显增加,但D组与A组比较无明显差异。A、B、C、D组Ⅱ型胶原相对表达量分别为0.991±0.024、0.474±0.127、1.913±0.350、1.159±0.297,除A、D组间比较差异无统计学意义(P0.05)外,其余组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论研究表明Melittin具有保护终板软骨作用,为其用于防治脊柱退变性疾病提供了相关实验依据。     

T细胞免疫球蛋白及黏蛋白家族-3对干扰素-γ活化的小鼠肝Kupffer细胞分泌炎性细胞因子的调节作用及机制

目的探讨T细胞免疫球蛋白及黏蛋白家族-3(Tim3)对IFN-γ活化的小鼠Kupffer细胞的调节作用并探讨其相关机制。方法将真核表达质粒pc DNA3.1-Tim3转染小鼠肝Kupffer细胞,以Real-time PCR和Western blot检测Tim3在小鼠肝Kupffer细胞的表达。通过ELISA检测质粒pc DNA3.1-Tim3、Tim3阻断型抗体对IFN-γ活化的小鼠肝Kupffer细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)产生的影响,Western blot检测JAK2/STATl蛋白表达。结果 Real-time PCR检测结果显示,IFN-γ能够显著提高小鼠肝脏Kupffer细胞中Tim3 m RNA的表达水平(P0.05);pc DNA3.1-Tim3组的TNF-α、IL-6和IL-1β分泌较对照组显著下降(P0.01);ELISA结果显示,Tim3阻断型抗体组与对照组相比,TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌增加(P0.01);Western blot检测显示,与对照组相比,Tim3阻断型抗体预处理的小鼠Kupffer细胞JAK2及STAT1蛋白的表达上调(P0.05)。结论Tim3通过调控Jak2/Stat1蛋白表达参与了Kupffer细胞活化的调节。     

白藜芦醇激活PI3K/Akt信号通路对软骨细胞细胞外基质合成的影响

[目的]通过白藜芦醇刺激体外培养的小鼠膝关节软骨细胞,探讨白藜芦醇通过PI3K/Akt信号通路对软骨细胞细胞外基质合成的影响。[方法]体外分离培养小鼠膝关节软骨细胞,采用HE染色、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察鉴定软骨细胞。根据作用药物的不同分为3组:空白对照组、白藜芦醇组(100μmol/L白藜芦醇)和LY294002组(100μmol/L白藜芦醇+25μmol/L LY294002)。采用RT-PCR检测软骨细胞中Akt1,Aggrecan、Collagen II的m RNA表达水平。[结果]荧光显微镜下可见软骨细胞胞核呈蓝色荧光,胞质呈红色荧光。显示Ⅱ型胶原染色阳性细胞数占90%以上,证实所培养细胞为软骨细胞。RT-PCR检测结果显示白藜芦醇组Akt1、Aggrecan、Collagen II m RNA表达量较空白组明显升高(P<0.05)。LY294002组Akt1、Aggrecan、Collagen II m RNA表达量较白藜芦醇组下降,但仍高于空白组(P<0.05)。[结论]白藜芦醇可以通过激活PI3K/Akt信号通路,增加软骨细胞细胞外基质合成,起到保护关节软骨的作用。     

河蚌提取物葡聚糖对软骨细胞Wnt通路的调控作用研究

目的 ：探讨河蚌肉提取物葡聚糖HBP-A（anodonta glucan HBP-A）对体外软骨细胞Wnt通路的调控作用。方法：体外培养大鼠软骨细胞,添加IL-1β（10 ng/ml）诱导分化,分为空白组,IL-1β组,IL-1β＋IWP-2（5μM,Wnt通路抑制剂）组,IL-1β＋HBP-A（0.3 mg/ml）组,IL-1β＋IWP-2＋HBP-A共5组培养,提取各组细胞RNA和蛋白,采用Rt-PCR检测各组细胞Wnt-3a、β-catenin（24、48、72 h）及MMP-13（72 h）的基因表达;采用Western-blot检测β-catenin、MMP-13、Sox-9和Coll-Ⅱ蛋白的表达水平（48 h）。结果：细胞经IL-1β诱导分化,Wnt-3a基因表达升高,β-catenin以及MMP-13基因和蛋白表达升高,Sox-9和Coll-Ⅱ蛋白表达下调。添加HBP-A干预可以抑制IL-1β诱导下软骨细胞Wnt-3a基因的高表达、β-catenin以及MMP-13基因和蛋白的高表达,上调Sox-9和Ⅱ型胶原蛋白的表达。IWP-2和HBP-A合用时,Wnt-3a、β-catenin基因以及β-catenin蛋白表达最低,Sox-9蛋白表达最高。结论：HBP-A可通过降低Wnt/β-catenin信号通路表达,延缓软骨细胞分化,并且可与Wnt抑制剂协同调节Wnt-3a、β-catenin和Sox-9因子的表达。     

兔骨关节炎模型中Wnt/β-catenin信号通路研究

目的:探讨兔骨关节炎软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路的表达情况及其在骨关节炎中的作用。方法:采用改良伸直位固定法制作兔骨关节炎模型,分阶段酶消化法分离正常软骨细胞和骨关节炎软骨细胞。采用ELISA法检测正常软骨细胞和骨关节炎软骨细胞中β连环蛋白(β-catenin)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶-4(ADAMTS-4)、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、白细胞介素(IL)-1β、IL-18和IL-33的水平。结果:与正常对照组比较,骨关节炎组β-catenin、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4的蛋白水平均明显升高,Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因的蛋白水平均明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。与正常对照组比较,骨关节炎组IL-1β、IL-18和IL-33蛋白水平差异无统计学意义(P0.05)。结论:兔骨关节炎中Wnt/β-catenin信号通路明显激活,介导软骨细胞外基质分解代谢、促进软骨破坏,而炎性因子IL-1β、IL-18和IL-33可能在此过程中并未起到关键作用。     

羧甲基壳聚糖对体外培养大鼠椎间盘髓核细胞增殖、细胞周期及细胞外基质分泌的影响

目的 观察羧甲基壳聚糖(CMCS)对体外培养大鼠椎间盘髓核细胞细胞周期进程、细胞周期蛋白表达及分泌细胞外基质的影响.方法 使用酶消化法提取大鼠椎间盘髓核细胞并进行体外培养,Ⅱ型胶原免疫组织化学鉴定髓核细胞.将髓核细胞分为:对照组、不同浓度CMCS处理组(100、200、500 mg/L),作用24 h后通过碘化丙锭(PI)染色流式细胞技术检测细胞周期进程.通过荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)及Western blot法检测不同浓度(100、200、500 mg/L) CMCS对髓核细胞内增殖相关蛋白增殖细胞核抗原(PCNA)及细胞周期蛋白(Cyclin)D表达的影响,并通过FQ-PCR法检测不同浓度(100、200、500 mg/L) CMCS对髓核细胞分泌细胞外基质Ⅱ型胶原的影响.结果 培养的细胞经Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定显示其表达阳性,表明为髓核细胞;通过FQ-PCR及Western blot检测增殖相关蛋白PCNA可见通过100、200、500 mg/L CMCS作用后髓核细胞表达PCNA与对照组比较分别增加12.3％、18.2％、54.2％与25.1％、52.7％、66.9％ (P ＜0.05);经流式细胞仪检测发现经100、200、500 mg/L CMCS处理的髓核细胞处于S期细胞比例是对照组的1.58、2.34与2.61倍(P＜0.05);Cyclin D表达分别是对照组的1.26、2.15、2.64倍与1.53、1.69、1.83倍(P ＜0.05);FQ-PCR及Western blot检测结果表明100、200、500 mg/L CMCS分别促进髓核细胞分泌Ⅱ型胶原表达是对照组的1.67、2.24、2.79倍与1.48、1.65、1.77倍(P＜0.05).结论 CMCS对体外培养髓核细胞增殖相关蛋白PCNA表达具有促进作用,可促进细胞周期进程及细胞周期蛋白表达,对髓核细胞分泌细胞外基质具有促进作用.     

姜黄素对白细胞介素1β诱导兔骨关节炎标志物的作用

目的探讨姜黄素对白细胞介素1β(IL-1β)体外诱导兔关节软骨细胞分泌基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、环氧化酶-2(COX-2)、Ⅱ型胶原的影响及可能涉及的信号通路转导。方法分离兔软骨细胞进行体外培养及鉴定,用IL-1β不同时间点刺激软骨细胞,Western Blot检测MMP-13、COX-2的表达。将IL-1β分别与不同浓度的姜黄素共育于兔关节软骨细胞不同时间点,Western Blot检测MMP-13和Ⅱ型胶原的表达,以期获得最佳的作用浓度和时间。使用姜黄素和(或)特异性的p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB203580共培养IL-1β刺激的软骨细胞,RT-q PCR检测细胞MMP-13、COX-2、Ⅱ型胶原;Western Blot检测p38、p-p38的表达。结果体外分离培养软骨细胞并鉴定,IL-1β上调软骨细胞的MMP-13、COX-2的表达,姜黄素能够抑制p38的磷酸化,p-p38表达有统计学意义(t=11.22,P0.01);姜黄素下调IL-1β刺激软骨细胞的MMP-13、COX-2的表达,同时上调Ⅱ型胶原的表达,与IL-1β组相比差异有统计学意义(tMMP=15.79,tCOX=10.27,tⅡ胶原=5.00,P值均小于0.01)。结论姜黄素能够通过减少p38的磷酸化抑制p38 MAPK途径,显著抑制IL-1β刺激兔软骨细胞分泌MMP-13和COX-2,减少软骨基质的降解,增加Ⅱ型胶原的含量,延缓软骨退变,并对软骨细胞具有一定的保护功能。     

转化生长因子-β1诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞转化的研究

目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)向髓核样细胞分化的可能性.方法 密度梯度法分离培养兔BMSCs,取BMSCs(P3).实验组:含TGF-β1的诱导培养基,对照组:不含TGF-β1诱导培养基,体外培养两周.阿尔新蓝法(Alcian blue)检测培养基内葡糖胺聚糖(GAG)含量.培养第14天,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测髓核样细胞Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)及聚集蛋白多糖(Aggrecan) mRNA基因表达.免疫组织化学法测定CollagenⅡ的含量变化.结果 GAG检测结果显示,第7、10、13天实验组GAG含量均显著高于对照组(P＜0.01).实验组CollagenⅡ免疫组织化学染色阳性,表达量较对照组高.Real-time PCR结果证实:实验组CollagenⅡ和Aggrecan mRNA表达水平较对照组显著增高(P＜0.01).结论 TGF-β1能明显增加BMSCs向髓核样细胞分化的诱导生物活性,促进BMSCs向髓核样细胞定向分化.