载VEGF_(165)多孔聚己内酯支架促进脂肪来源干细胞体内外成骨分化的实验研究

目的探讨载VEGF_(165)多孔聚己内酯[poly(ε-caprolactone),PCL]支架对脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)成骨分化的影响。方法采用溶剂置换法、粒子浸出法及热致相分离法制备载VEGF_(165)多孔PCL支架(记作Sf-g/VEGF),扫描电镜观察其形貌、测定药物释放率。取15只SD大鼠腹股沟脂肪,分离培养ADSCs并传代。取第3~4代细胞复合至Sf-g/VEGF,体外培养7 d后行茜素红染色、茜素红活性测试及实时荧光定量PCR检测体外成骨效果;以明胶修饰的多孔PCL支架(记作Sf-g)与ADSCs复合培养作为对照。取SPF级SD大鼠6只,于颅骨左、右侧各制备一直径为5 mm缺损,将其随机分为3组(n=4);阴性对照组不作任何处理,Sf-g组植入细胞-Sf-g支架复合体,Sf-g/VEGF组植入细胞-Sf-g/VEGF支架复合体。8周后取出含细胞-支架复合体的颅骨分别行Micro-CT扫描及HE染色,评估体内成骨效果。结果扫描电镜示Sf-g/VEGF支架呈多孔结构,VEGF释放曲线呈二阶段释放,120 h累积释放率为80%;提示成功制备Sf-g/VEGF。体外培养7 d后茜素红染色检查示Sf-g/VEGF组茜素红活性显著高于Sf-g组(t=10.761,P=0.000)。实时荧光定量PCR检测,Sf-g/VEGF组成骨特异性指标特异AT序列结合蛋白2(special AT-rich sequence protein 2,Satb2)、ALP、骨钙素(osteocalcin,OCN)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)m RNA相对表达量均较Sf-g组升高(P0.05)。体内植入后8周Micro-CT扫描及组织学观察显示,Sf-g组及Sf-g/VEGF组均可见骨缺损部分修复,且Sf-g/VEGF组更显著;Sf-g/VEGF组新生骨组织体积及面积均显著优于Sf-g组(P0.05)。结论载VEGF_(165)多孔PCL支架可显著提高ADSCs的体内、外成骨分化效果。     

仿生修饰结合三维打印技术构建的胶原-聚己内酯支架可促进兔临界骨缺损修复

目的 构建一种具有良好生物活性和机械性能的复合支架材料胶原-聚己内酯(Collagen-polycaprolactone,Col-PCL),通过体外及体内试验验证该支架材料的生物活性及成骨活性.方法 采用三维打印技术制备三维多孔PCL支架,将胶原凝胶充分填充于PCL支架的孔洞内,通过冷冻干燥、交联处理,获得胶原三维活化...     

3D打印胶原/羟基磷灰石支架对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用研究

目的探讨3D打印胶原/羟基磷灰石支架对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用。 方法分离SPF级雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞,实验分为：对照组、浸提组、诱导组及浸提诱导组,MTT法检测对照组,浸提组的细胞增殖情况,对比分析各组细胞的碱性磷酸酶（ALP）活性,对各组细胞诱导培养17天后进行茜素红染色,观察钙结节染色情况。 结果MTT结果显示,浸提组与对照组在不同时间点的OD值比较,差异无统计学意义（P>0.05）,ALP活性结果显示,不同时间点各组与对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.05）;不同时间点浸提诱导组与浸提组相比,差异均有统计学意义（P<0.05）;诱导组在48 h及72 h与浸提组相比,差异均有统计学意义（P<0.05）。茜素红染色结果显示,对照组细胞无钙结节点,浸提组及诱导组镜下肉眼可明显观察到红色区域染色,镜下观察可见钙结节点,浸提诱导组所产生的钙结节点的数量、大小以及染色的颜色深度均明显优于其他各组。 结论3D打印胶原/羟基磷灰石支架具有生物相容性好,可促进BMSCs向成骨分化,对细胞毒性低等特点,适宜用作骨缺损的治疗。     

骨形态发生蛋白复合明胶羟基磷灰石涂层多孔钛修复兔骨缺损的实验研究

目的 研究骨形态发生蛋白-2（BMP-2）复合明胶羟基磷灰石（HA）涂层多孔钛对兔股骨远端骨缺损的修复作用。方法 以多孔钛粉末为原料，制备三维多孔结构钛载体，然后运用碱热处理＋模拟体液等化学方法进行HA涂层，制备具有三维空间结构的HA涂层多孔钛复合材料。36只新西兰兔随机分为实验组及对照组，制备股骨远端圆柱状骨缺损模型，实验组植入复合BMP-2的HA涂层多孔钛材料，对照组单纯植入HA涂层多孔钛材料。分别于6、12、24周取材通过组织学和生物力学分析。结果组织学观察显示于各时间点实验组骨生成均不同程度优于对照组；生物力学测试显示在推出实验中所有样品的剪切应力都随时间增长而增大。其中在6周、12周实验组多孔钛在所有时间点均表现出了比对照组高得多的剪切力（P〈0．05），在24周实验组和对照组差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 BMP-2复合明胶HA涂层多孔钛较单纯HA涂层多孔钛植入早期具有更良好的生物相容性、骨传导性及骨诱导性，可成功修复兔股骨远端骨缺损。     

三维连通多孔钛修饰的人工股骨复合骨形态发生蛋白的实验研究

目的将人工股骨柄表面贴敷复合了骨形态发生蛋白的三维连通多孔钛,观察早期骨长入情况。方法将表面贴敷三维连通多孔钛的犬人工股骨柄直接或通过纤维蛋白胶与骨形态发生蛋白复合,植入犬股骨,植入后2、5周荧光标记,3、6周取材病理观察。结果植入后3周,骨已长入多孔材料一半,植入后6周,宿主骨与假体成为一体,骨长入多孔材料全层;第6周时成骨量明显高于第3周。结论具有三维连通多孔钛表面的假体与骨形态发生蛋白复合后能使骨长入加快,骨整合的程度提高,达到机械锁定和骨整合的双重固定,减少假体松动。     

软骨形态发生蛋白1诱导犬真皮成纤维细胞向软骨细胞表型分化的实验研究

目的探讨软骨形态发生蛋白1（Cartilage-derived morphogenetic protein-1,CDMP1）诱导体外培养的犬真皮成纤维细胞（Dermal fibroblasts,DFs）向软骨细胞表型分化的可行性。方法应用CDMP1细胞诱导液对体外扩增至第4代的犬DFs进行诱导培养,观察细胞的形态变化,以免疫荧光染色和RT-PCR检测细胞中软骨特异蛋白的表达情况。结果诱导培养6 d后,实验组部分DFs呈星形或多角形,免疫组化染色显示有软骨特异的II型胶原分泌,RT-PCR检测也表明有Ⅱ型胶原、aggrecan和SOX9表达。但是诱导培养10 d后,均转为阴性。结论 CDMP1可以诱导犬DFs向软骨细胞表型分化,有可能成为组织工程化纤维软骨的种子细胞。     

负载人骨形态发生蛋白-7基因的兔脂肪干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的 探讨人骨形态发生蛋白-7(hBMP-7)基因修饰对兔脂肪干细胞(ADSCs)成骨能力的影响. 方法 原代培养兔脂肪干细胞,免疫组织化学方法检测细胞表面抗原CD44、CD49d、CD106的表达,对细胞进行鉴定;阳离子脂质体介导hBMP-7基因转染ADSCs,绿色荧光蛋白表达观察转染效率、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测目的基因hBMP-7的表达;ALP定量测定,Western blot检测Ⅰ型胶原、骨钙素的表达,以评价转基因ADSCs向成骨细胞分化的情况. 结果 从兔脂肪组织中分离出来的ADSCs CD44、CD49d表达呈阳性,CD106表达呈阴性.RT-PCR检测筛选后的ADSCs稳定表达hBMP-7.转染后7、10、14 d ALP定量测定转染组明显高于未转染组,差异有统计学意义(P<0.05);成骨标志物Ⅰ型胶原、骨钙素的表达转染组明显高于未转染组.结论 从脂肪组织中分离出的ADSCs是一种较好的组织工程种子细胞.hBMP-7重组质粒转染ADSCs后表达目的蛋白,并诱导ADSCs向成骨细胞分化.     

负载重组人骨形态发生蛋白2的α型半水硫酸钙/纳米羟基磷灰石复合植骨材料的成骨性能研究

目的:评价负载重组人骨形态发生蛋白2(rh BMP-2)的α型半水硫酸钙/纳米羟基磷灰石(α-CSH/n HA)复合植骨材料的成骨性能。方法:制备可注射性α-CSH/n HA/rh BMP-2复合材料,取12只成年绵羊,分别经左侧椎弓根在L1~L6椎体上制作直径6mm、深15mm的6个洞形缺损,第一只绵羊的椎体缺损随机分为3组,其余羊的椎体都按此进行分组,即L2、L5为实验组,L1、L4为对照组,L3、L6为空白对照组。实验组植入α-CSH/n HA/rh BMP-2复合材料;对照组植入可注射性磷酸钙骨水泥(CPC);空白对照组不植入任何材料。术后4、8、12周各处死4只动物,取椎体标本分别行X线及micro-CT扫描,观察缺损修复情况;行生物力学检查,测定椎体压缩强度和压缩模量;行组织学观察比较新骨生成率。结果:术后4周时,实验组压缩强度及压缩模量与CPC组的差异无统计学意义(P0.05),实验组和对照组均显著性高于空白对照组(P0.05);术后8周和12周时实验组和对照组均显著性高于空白对照组(P0.05),实验组显著性高于对照组(P0.05)。影像学及组织学结果显示,术后4周时,实验组复合材料大部分已降解,密度稍低于正常骨,可见大量纤细短小、尚未塑形的新生骨小梁,边缘有大量成骨细胞环绕;对照组CPC材料呈高密度充满整个缺损,未见明显降解吸收征象,材料与骨的界限明显,缺损边缘有少量幼稚骨小梁形成;空白对照组缺损较大,边缘整齐,几乎看不到有新骨生成。术后8周时,实验组复合材料完全降解,缺损内新生骨小梁数量增多,增粗变长,且开始早期塑形;对照组材料开始部分降解,在边缘和中心降解区可见明显新骨形成,新生骨小梁数量较实验组少;空白对照组缺损修复不明显,边缘只可见少量新生骨小梁。术后12周时,实验组缺损完全被新生骨小梁充满,骨小梁趋于成熟,结构与正常骨小梁相似,密度与正常骨接近,很难与正常部位区分;对照组CPC大量降解,只残留一小团块状和零星的材料,缺损边缘修复明显,新生骨小梁长入残余材料内,将其分割成岛屿状;空白对照组缺损依然较大,呈低密度影清晰可见,新骨生成很少。结论:α-CSH/n HA/rh BMP-2复合材料在绵羊体内具有良好的成骨活性,是较好的微创植骨材料。     

骨形态发生蛋白2基因转染的兔骨髓间充质干细胞复合聚乳酸-聚己内酯支架体外构建载基因仿生骨的实验研究

[目的] 构建聚乳酸-聚己内酯(PLA/PCL)吸附骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)基因的聚乙二醇(PEG)纳米复合物形成生物可降解仿生骨材料,接种兔骨髓间充质干细胞(rabbit bone mes-enchymal stem cells,rBMSCs),检测BMP-2基因的转染情况及其对细胞增殖、分化的影响.[方法] 通过溶液共混法制备PLA/PCL载基因仿生骨,接种rBMSCs细胞于仿生骨之上,培养48 h;Real-time PCR检测转染后细胞BMP-2及骨钙素mRNA表达水平;应用Western Blot及免疫组化检测rBMSCs转染后BMP-2蛋白表达;免疫荧光检测rBMSCs细胞Ⅰ型胶原蛋白表达;ELISA检测转染后细胞培养上清中分泌BMP-2浓度,同时检测细胞内碱性磷酸酶活性,从而分析细胞分化情况;流式细胞检测转染BMP-2后细胞周期的变化.[结果] 以未转染细胞作为对照,免疫组化表明转染后细胞内BMP-2表达量明显上调(P＜0.05);Real-time PCR检测结果表明BMP-2与骨钙素mR-NA表达显著增加(P＜0.05);同时Western Blot结果同免疫组化结果相似,BMP-2也有明显上调(P＜0.01);免疫荧光检测Ⅰ型胶原表达量显著上升(P＜0.01);ELISA检测细胞培养上清中BMP-2分泌量也有增加(P＜0.05);碱性磷酸酶较对照组相比活性显著增强(P＜0.05),而流式细胞检测S期细胞无明显变化(P＞0.05).[结论] 载基因仿生骨具有稳定而安全的转染性能,其转染后对rBMSCs细胞的分化效果是明显的,而对于细胞周期变化的影响并不显著.     

3D打印β-磷酸三钙负载聚乳酸-羟基乙酸共聚物抗结核药物缓释微球细胞毒性及对BMSCs成骨分化影响的研究

目的研究3D打印技术制备的β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)支架负载聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactide-co-glycolide),PLGA]抗结核药物缓释微球的细胞毒性及对BMSCs成骨分化的影响。方法通过复乳溶剂挥发法制备异烟肼、利福平/PLGA缓释微球,3D打印技术制备β-TCP支架,用离心震荡法将微球负载于支架上制备复合材料。采用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,取第3代细胞分别与成骨诱导培养液(A组)、PLGA抗结核药物缓释微球浸提液(B组)、3D打印β-TCP支架浸提液(C组)、3D打印β-TCP负载PLGA抗结核药物缓释微球复合材料浸提液(D组)共培养。采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞毒性;茜素红染色观察钙沉积情况;实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,RTq PCR)检测成骨相关基因ALP、骨钙素(osteocalcin,OCN)和骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)的表达。结果 CCK-8法检测示,随培养时间延长A、B、C、D组吸光度(A)值逐渐增加;培养24、48、72 h时,A值按A、C、B、D组顺序递减,除B、D组间比较差异无统计学意义(P0.05)外,其余各组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。细胞毒性评价为0～2级,毒性实验合格。成骨诱导21 d茜素红染色示,各组均有红色矿化结节形成,但矿化结节数量C组D组A组B组。RT-q PCR检测示,随培养时间延长,A、B、C、D组OCN和BSP基因相对表达量均呈逐渐增加趋势;ALP基因相对表达量于7、14 d时呈增高趋势,21 d时有所降低。培养7、14、21 d时ALP、OCN和BSP基因相对表达量均为C组D组A组B组,各时间点各组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论 3D打印β-TCP负载PLGA抗结核药物缓释微球复合材料对BMSCs无明显细胞毒性,同时在一定程度上促进其向成骨细胞分化。     

人骨形态发生蛋白-4@MSNs调控Wnt/β-连环蛋白信号促进骨髓间充质干细胞成骨分化

目的探讨介孔二氧化硅(MSNs)纳米颗粒负载人骨形态发生蛋白-4(BMP-4)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响和作用机制。方法制备BMP-4@MSNs, 扫描电镜观察其形态和表征, 计算BMP-4的载药量、包封率和体外缓释率。细胞计数试剂盒(CCK-8)检测BMSCs增殖能力, 茜素红染色检测BMP-4@MSNs对BMSCs的成骨诱导能力, 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测BMSCs的相关成骨基因和蛋白表达。组内比较采用One-way ANOVA分析。结果合成的BMP4@MSNs直径大小为(140.4±1.683) nm, 载药量为29.4%, 包埋率为84.9%。BMP4@MSNs组细胞增殖高于MSNs组在第3天(1.13±0.07比1.35±0.16, t=3.545, P<0.05)、第5天(1.39±0.08比1.64±0.07, t=3.401, P<0.05)、第7天(1.65±0.10比2.11±0.20, t=5.069, P<0.05)。BMP4@MSNs组的成骨矿化结节茜素红染色深...