H_2O_2下调miR-21对MC3T3-E1细胞成骨分化影响的研究北大核心CSCD

目的探讨H_2O_2诱导的miR-21下调对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用及机制。方法取MC3T3-E1细胞系,培养传至第7代进行实验。取MC3T3-E1细胞,以不同浓度H_2O_2(0、40、80、160、320μmol/L)培养,经实时荧光定量PCR检测miR-21表达、MTS法检测细胞活性,选择H_2O_2最合适实验浓度。取MC3T3-E1细胞分为空白对照组(A组)、H_2O_2组(B组)、成骨诱导组(C组)、H_2O_2+成骨诱导组(D组),对应培养后实时荧光定量PCR检测miR-21表达以及成骨标志基因Runx2、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠalpha 1,Col1a1)表达,Western blot检测磷酸酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)蛋白表达,茜素红染色观察细胞外钙基质沉积情况,分析H_2O_2对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。然后再取MC3T3-E1细胞,分为H_2O_2组(A1组)、H_2O_2+成骨诱导组(B1组)、H_2O_2+ miR-21抑制剂+成骨诱导组(C1组)、H_2O_2+ miR-21抑制剂阴性对照+成骨诱导组(D1组);以及H_2O_2组(A2组)、H_2O_2+成骨诱导组(B2组)、H_2O_2+ siRNA-PTEN阴性对照+成骨诱导组(C2组)、H_2O_2+siRNA-PTEN+成骨诱导组(D2组);对应培养后检测成骨标志基因(Runx2、OPN、Col1a1)表达以及细胞外钙基质沉积情况,分析下调miR-21或沉默PTEN对细胞成骨分化的影响。结果结合实时荧光定量PCR检测以及MTS法结果,选择160μmol/L H_2O_2进行实验。第1、2周B组miR-21相对表达量低于A组(P<0.05),D组低于C组(P<0.05);第2周C组PTEN蛋白相对表达量均低于A、D组(P<0.05);第1、2周D组Runx2、OPN及Col1a1 mRNA相对表达量均低于C组(P<0.05),茜素红染色显示D组钙基质沉积少于C组。C1组PTEN蛋白相对表达量高于D1组(P<0.05);第1、2周B1、D1组Runx2、OPN mRNA相对表达量均高于C1组(P<0.05),第2周B1、D1组Col1a1 mRNA均高于C1组(P<0.05);茜素红染色显示C1组钙基质沉积少于B1、D1组。第1周D2组OPN、Col1a1 mRNA相对表达量高于B2、C2组(P<0.05),第3周茜素红染色显示D2组钙基质沉积明显多于B2、C2组。结论 H_2O_2抑制MC3T3-E1成骨分化可能与miR-21下调有关。     

miR-429在低氧环境中对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

目的 探讨在低氧环境中,miR-429对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法 在体内、外用氯化钴(CoCl₂)模拟低氧环境,采用免疫蛋白印迹(western blot, WB)检测低氧诱导因子(hypoxia inducible factor, HIF)-1α的表达验证低氧情况,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(real time-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)观察骨折部位及细胞组织中miR-429的表达情况,同时检测MC3T3-E1细胞在低氧状态下的增殖与凋亡情况;通过慢病毒转染技术在MC3T3-E1细胞中过表达miR-429作为实验组,对照组为转染空载质粒细胞,采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性检测、茜素红染色、WB等方法观察细胞中ALP活性、矿物质含量以及多种成骨标志物蛋白表达情况,对比两组MC3T3-E1细胞的成骨分化;在骨折模型局部注射过表达miR-429的慢病毒载体,通过Micro-CT及qRT-PCR观察骨折愈合情况。结果 在低氧环境MC3T3-...     

miR-137靶向作用RUNX2调控MC3T3-E1细胞成骨分化

目的探讨miR-137对RUNX2的靶向作用及其对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法通过软件预测miR-137与成骨标志基因RUNX2的结合位点。检测MC3T3-E1细胞诱导成骨分化过程中miR-137的表达变化。转染miR-137 mimics或miR-137 inhibitor后,再诱导MC3T3-E1细胞成骨分化,检测成骨分化标志物(RUNX2、ALP、OPN、OCN及OSX)表达变化。结果经软件预测,miR-137与靶基因RUNX2有结合位点。MC3T3-E1细胞成骨分化过程中,miR-137表达下调。转染miR-137mimics的MC3T3-E1细胞成骨标志基因表达受到抑制,而转染miR-137 inhibitor组成骨标志基因呈不同程度表达上调。结论miR-137通过靶向作用RUNX2基因调控MC3T3-E1细胞成骨分化。     

Foxc2基因对MC3T3-E1细胞成骨能力影响的实验研究

目的 探讨Foxc2基因对MC3T3-E1细胞成骨能力的影响,并初筛其下游的靶基因.方法 将多个成骨诱导因子作用于MC3T3-E1细胞,明确Foxc2的表达.采用慢病毒plenti-Foxc2及plenti-EGFP转染MC3T3-E1细胞,构建MC3T3-E1Foxc2+及MC3T3-E1EGFP.检测细胞增殖、细胞...     

缓释前列腺素E2对MC3T3-E1细胞成骨基因表达的影响

目的探讨载前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)的乳酸-羟基乙酸共聚物微球(PLGA-PGE2-MSs)对成骨样细胞株MC3T3-E1成骨因子表达的影响。方法采用膜乳化-溶剂挥发法制备粒径均匀的PGE2-PLGA微球。以无添加物培养基(n=6)、空白微球(n=6)为对照组;PGE2(n=6)及缓释PLGA-PGE2-MSs(n=6)为实验组。PGE2浓度为0.0125、0.0500、0.2000、0.8000μmol/L的各实验组与成骨样细胞株MC3T3-E1孵育5、7、9、11 d;采用RT-PCR检测不同时间成骨因子的表达水平。结果微球对照组与空白对照组各时间点比较差异无统计学意义(P0.05);不同浓度的PGE2、PLGA-PGE2-MSs组与空白对照组同一时间点比较,均能促进RUNX2、ALP、OPN基因表达水平(P0.05);相同PGE2浓度水平的两个实验组同一时间点比较,PLGA-PGE2-MSs组促进基因表达水平高于PGE2组(P0.05)。结论 PLGA-PGE2-MSs具有明显的缓释作用;在本研究设定的浓度区间内,PGE2、PLGA-PGE2-MSs均可促进MC3T3-E1细胞增殖、分化、基质成熟等不同阶段代表性基因RUNX2、ALP、OPN的表达水平。     

黄芪多糖对MC3T3-E1细胞增殖及成骨分化的影响

目的 分析黄芪多糖（AP）对小鼠成骨细胞系MC3T3-E1的成骨分化作用机制。 方法 MC3T3-E1细胞经成骨诱导后分别加入浓度为0、5、10 μmol/L 的AP进行干预,持续1、3、5、7 d后使用MTT法观察AP对细胞增殖的影响;干预14 d后,通过ALP及茜素红染色观察AP的促成骨分化作用;成骨相关mRNA表达水平经实时荧光定量PCR测定,其中包括Runt相关转录因子2(Runx2)、β-连环蛋白(β-catenin)、骨钙素（osteocalcin）、I型胶原蛋白（collagen I）;并使用Western blot法检测β-catenin、osteocalcin、Runx2蛋白表达水平,以及免疫荧光检测β-catenin的核易位情况。 结果 加入5、10 μmol/L 的AP后可有效促进MC3T3-E1增殖,且药物浓度越高效果越明显;同时AP亦可提高ALP、茜素红染色的阳性率,以及β-catenin、osteocalcin、Runx2、collagen I mRNA的表达水平（P<0.05）;Western blot结果也显示AP可有效促进β-catenin、osteocalcin、Runx2蛋白表达（P<0.05）,以及促进β-catenin入核。 结论 AP可促进MC3T3-E1细胞增殖及成骨分化,机制可能涉及促进相关成骨标志物表达以及β-catenin入核。     

辛伐他汀对成骨样细胞MC3T3-E1增殖功能的影响

目的 从细胞、蛋白及基因水平探讨辛伐他汀对成骨样细胞MC3T3-E1增殖的影响.方法 辛伐他汀选取10-6、10-7、10-8和10-9mol/L4个浓度组,同时设溶剂对照组.含血清细胞培养条件下,连续细胞计数8 d,描绘生长曲线;无血清培养条件下,分别于24、48及72 h进行细胞计数、四唑盐比色试验(MTY)、蛋白质含量测定和DNA含量荧光测定.结果 含血清细胞培养条件下,辛伐他汀各浓度组与溶剂对照组的生长曲线相比较,无明显差异;无血清培养条件下,辛伐他汀各浓度组与溶剂对照组24、48及72 h时细胞计数、MTY比色试验及DNA含量荧光测定各组间未见明显差异;蛋白质含量测定24及72 h时各组问无明显差异,然而48 h时10-6mol/L辛伐他汀组蛋白含量明显高于对照组并差异有显著性(P＜0.05).结论 辛伐他汀促进了成骨样细胞MC3T3-E1细胞的蛋白合成功能,但对其增殖无明显影响.     

miR-381-3p通过靶向ERK1/2/ETS1信号通路影响MC3T3-E1细胞成骨分化

目的 探讨miR-381-3p对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响和作用机制。方法 慢病毒转染细胞后实验分为NC mimic miR-381-3p组、mimic miR-381-3p组、NC inhibitor miR-381-3p组和inhibitor miR-381-3p组;运用实时荧光定量PCR(qR T-PCR)法检测不同组miR-381-3p的表达水平以验证转染效率;诱导MC3T3-E1细胞成骨分化后,检测各组细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性水平;茜素红染色法检测各组细胞的成骨矿化能力; qR T-PCR测定各组细胞中ALP、Runx2、PPARγ和ETS1 mR NA表达水平;蛋白免疫印迹法测定各组细胞中collagenⅠ、ALP、Runx2、PPARγ、ETS1、P-ERK1/2水平;并用MAPK/ERK通路抑制剂(PD98059)干预各组细胞后进行目的蛋白检测。结果 与NC mimic miR-381-3p组、mimic miR-381-3p组及NC inhibitor miR-381-3p组比较,inhibitor miR-381-3p组中细胞中ALP、Runx2、ET...     

健骨胶囊对成骨样细胞MC3T3-E1增殖及分化作用机制

目的 探讨国医大师刘柏龄“健骨胶囊”对MC3T3-E1成骨细胞分化及增殖的影响。方法 制备健骨胶囊水提物,采用CCK-8法和细胞迁移实验检测健骨胶囊提取物对MC3T3-E1细胞增殖和细胞迁移的影响;茜素红染色检测MC3T3-E1细胞的矿化能力;实时荧光定量PCR检测成骨分化基因Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2、RASSF1A等mRNA表达水平;蛋白质印迹法Western blot检测Col1a1、Bcl2的蛋白表达水平。结果 通过实验结果比对得出,健骨胶囊提取物能促进MC3T3-E1细胞增殖、使细胞迁移率提高;同时健骨胶囊提取物组能明显提高MC3T3-E1细胞钙化能力(P＜0.01),促进Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2的mRNA表达(P＜0.05),上调Col1a1、Bcl2蛋白量的表达。结论 健骨胶囊能促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖及细胞迁移能力,并通过上调成骨基因的表达水平如Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2等,提高MC3T3-E1细胞的成骨能力。     

不同浓度rhBMP-2对MC3T3-E1细胞增殖、ALP活性及成骨分化的影响

目的研究不同浓度rh BMP-2对MC3T3-E1细胞增殖、ALP活性及成骨分化的影响规律。方法 MC3T3-E1细胞接种到培养板24 h后,试验组分别加入1.25、2.5、5、10μg/ml的rh BMP-2进行药物干预,对照组加入全培。试验组应用CCK-8法检测细胞增殖活性,PNPP法检测细胞ALP活性,RT-PCR法检测成骨标志蛋白m RNA的表达情况。结果rh BMP-2浓度为2.5μg/ml时开始促进细胞的增殖(P0.05),rh BMP-2浓度为5μg/ml时促进作用达到峰值(P0.05)。rh BMP-2浓度为2.5μg/ml时ALP活性显著提高(P0.05);rh BMP-2浓度为5μg/ml和10μg/ml时,ALP活性较浓度为2.5μg/ml时继续升高,但差异无统计学意义(P0.05)。ALP、COL1-α以及转录因子RUNX-2的m RNA含量均在加入浓度5μg/ml rh BMP-2后明显升高(P0.05),继续加大rh BMP-2浓度,m RNA含量没有明显增加。结论在研究范围内,rh BMP-2对MC3T3-E1的影响呈浓度依赖性。     

MicroRNA-196a靶向调节HDAC9对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

目的 探究微小RNA（miR）-196a靶向调节组蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法 将MC3T3-E1细胞分为对照组（Cont）组、诱导组、miR-196a-mimics-NC组、miR-196a-mimics组、miR-196a-inhibitor-NC组、miR-196a-inhibitor组、miR-196a-mimics+pCMV-HDAC9-NC组、miR-196a-mimics+pCMV-HDAC9组,根据分组转染后进行成骨诱导。定量荧光PCR检测MC3T3-E1细胞中miR-196a、HDAC9表达量;试剂盒检测碱性磷酸酶（ALP）活性;茜素红染色观察矿化程度;Western blot检测HDAC9、ALP、Runt相关转录因子2（Runx2）、胶原蛋白I（COL1）、骨桥蛋白（OPN）、Histone H3、Histone H3（acetyl K9、K14和K23）表达量。结果 与Cont组相比,诱导组MC3T3-E1细胞中miR-196a表达、ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表达、ALP活性、矿化程度及Histone H3 K9、K14、K23位点乙酰化水平增高（P＜0.05）,HDAC9 mRNA和蛋白表达降低（P＜0.05）。转染miR-196a-mimics可明显增加miR-196a表达,降低HDAC9表达,并增加ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表达、ALP活性、矿化程度及Histone H3乙酰化,转染miR-196a-inhibitor则作用相反。miR-196a可靶向下调HDAC9表达,过表达HDAC9可部分逆转miR-196a mimics对MC3T3-E1细胞成骨分化的促进效应。结论 miR-196a可靶向下调HDAC9表达,增加组蛋白乙酰化水平,促进MC3T3-E1细胞成骨分化。     

脉冲电磁场对MC3T3-E1细胞增殖与分化的影响

目的研究不同强度50Hz脉冲电磁场(Pulse electromagnetic fields,PEMFs)对小鼠成骨细胞系MC3T3-E1增殖与分化的影响。方法 MC3T3-E1传代培养后分成七组,分别采用0.0 m T、0.6 m T、1.2 m T、1.8 m T、2.4 m T、3.0 m T和3.6 m T 50 Hz脉冲电磁场处理,90 min/d。MTT法检测细胞增殖情况,成骨性分化检测处理3 d、6 d、9 d、12 d后ALP活性和首次处理12 h后BMP-2、Runx-2、OPG基因表达情况。结果 6种强度的脉冲电磁场均促进细胞增殖,其中0.6 m T的促增殖效应最强(P<0.01)。在成骨性诱导培养条件下,细胞内ALP活性随电磁场处理时间的延长而逐渐增加,第9 d达到峰值,之后开始回落。0.6 m T、3.0 m T和3.6 m T均能提高ALP活性,其中0.6 m T始终处于最高水平(P<0.01)。三种基因的表达水平在首次处理12 h,在0.6 m T、1.2 m T、3 m T和3.6 m T组均显著提高,但仍然是0.6 m T的增强效应最为明显。结论 0.6 m T 50 Hz脉冲电磁场具有最佳的促进MC3T3-E1细胞增殖和成骨性分化活性,这可能为采用脉冲电磁场治疗骨质疏松症提供了理想的治疗参数。     

自噬对糖皮质激素作用下MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响

背景:目前,糖皮质激素(GCs)作用下成骨细胞自噬与其增殖能力的关系尚存争议.目的:探讨自噬对GCs作用下MC3T3-E1成骨细胞增殖能力的影响.方法:不同浓度(0、10-8 M、10-6 M、10-4 M)的地塞米松(DXMS)分别作用于MC3T3-E1成骨细胞,CCK-8检测不同时间(12 h、24 h、48 h)...     

通过p38MAPK信号通路探讨仙灵骨葆胶囊对MC3T3-E1成骨分化的影响

目的 探讨仙灵骨葆胶囊含药血清对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）增殖分化的影响及与p38MAPK信号通路的关系。方法 用仙灵骨葆胶囊含药血清干预MC3T3-E1,CCK8法筛选最佳干预时间及浓度,试剂盒检测各组细胞ALP活性。将细胞分为A、B、C、D 4组,分别加入10%含药血清、10%空白血清、10%含药血清+SB203580、10%空白血清+SB203580,利用免疫印迹法（Western blot）检测p38丝裂原活化蛋白激酶（p38）、磷酸化p38（p-p38）、成骨相关转录因子2（Runx2）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）的蛋白表达量,荧光定量PCR检测p38、Runx2和BMP-2 mRNA的表达水平。结果 与空白血清组相比,不同浓度的仙灵骨葆胶囊含药血清均能促进MC3T3-E1的增殖分化,提高ALP的活性,其中10%含药血清干预36 h的作用最为明显（P＜0.05）;与B组比较,A组p38、p-p38、Runx2、BMP-2蛋白及p38、Runx2、BMP-2 mRNA的表达明显增高（P＜0.05）;加入信号通路阻断剂SB203580后,C组与D组上述指标的表达明显降低（P＜0.05）;与C组相比,D组p38、p-p38、Runx2、BMP-2蛋白及p38、Runx2、BMP-2 mRNA表达更低（P＜0.05）。结论 仙灵骨葆胶囊含药血清能促进MC3T3-E1的分化生长,其作用机制可能与激活p38MAPK信号通路、上调成骨相关因子Runx2、BMP-2的表达有关。     

氟离子植入猪骨源羟基磷灰石对 MC3T3-E1 细胞黏附、增殖与成骨分化的影响

目的 检测氟离子植入猪骨来源羟基磷灰石（PHA）对小鼠前成骨细胞（MC3T3-E1）黏附、 增殖及成骨分化的影响。方法 取猪骨松质用高温烧结的方法制备PHA,使用氟化钠浸泡结合二次高温 烧结进行氟离子植入,制备获得氟化猪骨源羟基磷灰石（FPHA）骨块,进行研磨获得颗粒材料后制备 压片,采用PHA颗粒制备的压片为对照组,采用FPHA颗粒制备的压片为实验组。在压片材料表面接种 小鼠MC3T3-E1前成骨细胞株,通过扫描电镜SEM观察不同时间细胞黏附形态,CCK-8法检测细胞增 殖情况,RT-PCR法检测细胞成骨相关基因碱性磷酸酶ALP、骨钙素BGLAP、骨桥蛋白OPN mRNA 的表达情况。结果 扫描电镜SEM观察可见,PHA与FPHA组细胞黏附生长良好;两组细胞接种1、7d 后OD值比较,差异无统计学意义（P＞0.05）;FPHA组接种3、5 d后OD值高于PHA组,差异有统计学 意义（P＜0.05）;RT-PCR结果显示,FPHA组细胞接种3、7 d后ALP、BGLAP mRNA表达水平均高于 PHA组,且两组细胞接种7 d后材料表面细胞ALP与BGLAP mRNA表达水平均高于细胞接种3 d后,差异 有统计学意义（P＜0.05）。结论 PHA与FPHA材料均具有良好的细胞相容性,氟离子植入猪骨羟基磷灰 石可促进小鼠前成骨细胞早期增殖与成骨分化。     

THSD4基因在小鼠间充质干细胞及MC3T3-E1细胞成骨分化中的作用

目的 探讨THSD4基因对小鼠间充质干细胞和MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法 提取绝经后骨质疏松症患者的骨髓间充质干细胞进行基因测序分析,与骨关节炎患者的骨髓间充质干细胞进行比较,分析基因表达差异。通过提取不同分化阶段的小鼠骨髓间充质干细胞（M-BMSC）及MC3T3-E1细胞的mRNA来检测THSD4 基因以及成骨分化的标志性基因（ALP、Runx2、Osx）的表达水平。通过构建慢病毒表达载体来实现对M-BMSC及MC3T3-E1细胞中THSD4的敲减及过表达,并观察其对M-BMSC及MC3T3-E1细胞成骨分化能力的影响。结果 THSD4基因在绝经后骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞中明显下调,且通过KEGG以及GO富集分析发现THSD4基因可能与PI3K-AKT信号通路及Wnt信号通路相关。随着成骨诱导分化时间的延长,THSD4 mRNA和成骨分化标志性基因（ALP、Runx2、Osx）mRNA在MC3T3-E1以及M-BMSC中表达量均逐渐增加。过表达THSD4可以增强MC3T3-E1细胞和M-BMSC的成骨分化能力,而敲减THSD4则减弱了MC3T3-E1细胞和M-BMSC的成骨分化能力。结论 THSD4基因在绝经后骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞中明显下调,且THSD4基因可以增强MC3T3-E1细胞以及M-BMSC的成骨分化能力。