Lipofectamine 2000和jetPRIME~（TM）对A549细胞转染效率及毒性的比较研究

目的评价及比较两种转染试剂Lipofectamine 2000和jetPRIMETM对A549细胞的转染效率及毒性。方法分别利用Lipofectamine 2000和jetPRIMETM将pEGFP-N1质粒转染A549细胞,转染24h后荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的表达,计算转染效率,四甲基偶氮唑盐比色法[3-（4.5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]检测两种转染试剂对A549细胞的毒性。结果质粒与Lipofectamine 2000比例（μg/μl）在1∶2至1∶3.5之间变化时,Lipofectamine 2000转染效率变化不明显,细胞毒性随着Li-pofectamine 2000用量增多而增大,质粒与Lipofectamine 2000比例（μg/μl）为1∶2.5时转染率最高,达（50.6±4.9）%,细胞存活率为（89.2±9.1）%;质粒与jetPRIMETM比例（μg/μl）在1∶1至1∶4之间变化时,jetPRIMETM转染效率变化明显,而细胞毒性变化不明显,质粒与jetPRIMETM比例（μg/μl）为1∶2时转染率最高,为（30.6±2.8）%,细胞存活率为（100.6±4.8）%;两者最大转染率及相应的细胞存活率均有统计学差异（P〈0.01,P〈0.05）。结论 Lipofectamine 2000转染A549细胞的效率高于jetPRIMETM,细胞毒性亦强于jetPRIMETM。     

mTOR基因转染对NIH3T3成纤维细胞增生的影响

目的 探讨mTOR基因转染对NIH3T3成纤维细胞增生的影响.方法 运用电穿孔法将pcDNA3-mTOR质粒转染NIH3T3成纤维细胞,经G418筛选抗性克隆,RT-PCR和Western印迹分析检测转染组和对照组细胞mTOR mRNA与蛋白的表达,MTT方法检测细胞增生.结果 转染组细胞mTOR mRNA和蛋白质的表达显著增强(P＜0.01);MTT法检测转染组光吸收值显著大于对照组(P＜0.01);结论 mTOR基因转染成纤维细胞可获稳定表达,并明显促进成纤维细胞增生.     

稳定表达神经营养素-3的NIH3T3细胞建立及鉴定

目的：建立稳定表达NT3的NIH3T3细胞株，通过体外共培养实验观察其对耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响．方法：以阳离子脂质体作为载体，将携带有外源性基因NT3的重组真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3转染小鼠成纤维细胞，进行RT-PCR，Western-blot分析及免疫组化鉴定，并与耳蜗螺旋神经节细胞进行共培养实验．结果：得到抗G-418的阳性细胞克隆；RT-PCR的产物约为744 bp；Western-blot可见一清晰的蛋白条带，与NT3的蛋白分子量相符合．NT3免疫组化染色结果显示转染NT3-cDNA的NIH3T3细胞胞质呈棕黄色着色．NT3转染组细胞与耳蜗螺旋神经节细胞共培养2wk后，与对照组相比，耳蜗螺旋神经节细胞无明显减少．结论：成功建立了稳定表达NT3的NIH3T3细胞株；该细胞对耳蜗螺旋神经节细胞有很好的营养支持作用．     

桂皮醛对NIH3T3细胞增殖和细胞周期的影响

目的观察肉桂主要成分桂皮醛对NIH3T3细胞增殖的影响。方法采用MTT法观察不同浓度桂皮醛对NIH3T3细胞增殖的影响,并采用流式细胞仪检测桂皮醛对NIH3T3细胞周期的影响。结果桂皮醛作用NIH3T3细胞48 h后,细胞增殖速度较对照组明显增加,增殖率为15%(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,桂皮醛作用24 h后NIH3T3细胞S期比例上升了3%(P<0.05),G2/M期比例无明显升高,细胞增殖指数(PrI)增加了3.5%(P<0.01)。结论桂皮醛可促进NIH3T3的增殖,这种促增殖作用可能是通过调节细胞周期使更多细胞进入S期而实现的。     

人成纤维细胞稳定转染的方法比较

目的采用3种不同的方法将质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞,从中寻找最佳的稳定转染的方法。方法分别采用阳离子聚合物转染、阳离子脂质体转染和电转染方法,将能表达G418抗性蛋白和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞。24h后,荧光显微镜下观察EGFP表达,流式细胞术测定瞬时转染率;通过G418筛选得到稳定转染的细胞。结果电转染有最高的瞬时转染效率(56.8%),稳定转染得到的阳性克隆最多,且从细胞筛选到扩增至得到阳性大克隆所用的时间也最少(约20d);用阳离子聚合物瞬时转染率低(1.7%),稳定筛选同样可以得到阳性大克隆,但是数量很少且从细胞筛选到扩增至阳性大克隆所用的时间也最多(约30d);阳离子脂质体转染效果居中,瞬时转染率为39.9%,从细胞筛选到扩增至得到阳性大克隆所用的时间约25d。结论用电转染法将质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞是最佳的转染方法。     

三种转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo真核表达载体转染鸡胚成纤维细胞的比较研究

目的：采用不同转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo质粒转染鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1,以获得最优化的方法。 方法：分别采用不同剂量（1.25 μl、2.0 μl、2.5 μl）的Lipofec-tamin2000、Gbfectene-Elite及HilyMax转染试剂介导1 μg质粒进行转染,观察其转染效率,测定其转染细胞存活率。 结果：HilyMax组的转染效率为（86.85%±2.32%）,较Lipofectamin2000组（48.33%±3.24%）、Gbfectene-Elite组（37.35%±5.41%）高（F=18.882,P<0.05）;其中,HilyMax 2.5 μl组的转染效率最高为（90.53%±1.15%）。Lipofectamin2000组的细胞存活率（65.76%±5.78%）明显低于HilyMax组（89.54%±0.86%）、Gbfectene-Elite组（82.45%±3.56%）（F＝90.676,P＜0.05）。 结论：HilyMax对于鸡胚成纤维细胞具有最好的转染效率和最低的细胞毒性,推荐使用2.5 μl HilyMax：1 μg质粒进行鸡胚成纤维细胞的转染。     

腺病毒对内皮及成纤维细胞和血管环转染及基因表达的研究

目的：比较腺病毒对不同血管内皮及成纤维细胞的转染和对人冠状动脉搭桥动脉静脉血管的转导，为携带目的基因的腺病毒治疗血管狭窄提供更好的转染途径。方法：腺病毒Ad5CMVLacZ体外转染血管内皮细胞（HUVEC）和成纤维细胞（PA317）并间接转导入胸廓内动脉和大隐静脉血管环，运用β-半乳糖苷酶活性X－gal组织化学染色，观察转染情况，并进行动态分析。结果：腺病毒载体能使外源性基因有效地转入HUVEC、PA317及两种血管环并获得蛋白表达；两种血管环在转染10d后仍有β-半乳糖苷酶蛋白的表达，且大隐静脉有新内膜形成和中膜的增厚。结论：从细胞水平上证明腺病毒载体能将治疗性目的基因导入各种血管细胞及动静脉血管并获得表达，提示血管内膜和外膜都是腺病毒有效转染的途径；临床上无论动脉或静脉的血管狭窄都可能通过用腺病毒作为载体进行基因治疗和预防。     

苦参素对NIH/3T3成纤维细胞增殖及细胞外基质合成的影响

目的 观察苦参素对NIH／3T3成纤维细胞增殖及其细胞外基质(ECM)合成的影响,探讨苦参素抗肝纤维化的可能作用机制。方法 采用噻唑蓝比色法、流式细胞技术检测苦参素对NIH／3T3成纤维细胞增殖及细胞周期的影响,采用放射免疫方法检测苦参素对其合成透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)等ECM的影响。结果 苦参素可抑制NIH／3T3成纤维细胞的增殖,减少S期细胞,降低细胞增殖指数,抑制ECM的合成,并呈剂量依赖关系。结论 苦参素可能通过影响成纤维细胞的增殖、抑制成纤维细胞的分裂和ECM的合成发挥其抗肝纤维化作用。     

乙醇对NIH 3T3成纤维细胞成脂分化的影响

目的观察乙醇对NIH 3T3成纤维细胞分化为脂肪细胞的作用,及其对成脂转录因子PPARγ表达的影响.方法以不同浓度乙醇作为诱导剂处理NIH 3T3成纤维细胞14 d,苏丹Ⅳ染色,采用电子计算机图像分析软件Image Pro Plus 4.1,确定脂肪细胞百分比.采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,检测细胞PPARγ mRNA的表达.结果以递增浓度(0.03 mol/L、0.06 mol/L、0.09 mol/L、0.15 mol/L、0.21 mol/L)乙醇处理NIH 3T3成纤维细胞14 d,在0.06 mol/L、0.09 mol/L、0.15 mol/L、0.21 mol/L乙醇组中,脂肪细胞百分比和PPARγ mRNA表达均比对照组明显增高,差异均有统计学意义(P<0.001).0.03 mol/L乙醇组与对照组间的脂肪细胞百分比和PPARγ mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05).结论乙醇能够直接诱导NIH 3T3成纤维细胞大量分化为脂肪细胞,这可能是乙醇性骨坏死时骨髓内脂肪增多的原因之一.     

rhBMP-2诱导的相关信号转导分子在NIH3T3细胞中的表达

目的 :观察NIH3T3细胞中BMP信号转导因子的表达 .方法 :用免疫组化和原位杂交方法检测NIH3T3细胞中BMP ,BMPⅠ ,Ⅱ型受体和Smad1,4 ,5的表达 ,在细胞培养液中加入 5 0 μg·L-1rhBMP 2 ,检测细胞的碱性磷酸酶 (ALP)活性和骨钙素 (OC)含量观察细胞是否有成骨趋向 .结果 :细胞中有BMPⅠ ,Ⅱ型受体和Smad1,4 ,5的表达 ;没有BMP的表达 ;加入 5 0 μg·L-1rhBMP 2后 ,ALP活性和OC含量均增高 .结论 :rhBMP 2作用于NIH3T3细胞后 ,细胞有成骨趋向 .NIH3T3细胞是rhBMP 2的靶细胞 ,细胞中有BMPs信号转导因子的表达     

磷酸钙沉淀法在HPV-18 DNA转染NIH 3T3细胞中的应用

以 HPV-18 DNA 为供体、小牛胸脉 DNA 为载体,NIH 3T3细胞为受体细胞,应用磷酸钙沉淀法将供体 DNA 引入细胞内,得到了清晰的 NIH 3T3细胞形态学转化灶。     

构建人补体衰变加速因子真核载体并转染NIH/3T3成纤维细胞

目的：构建人补体衰变加速因子（DAF）真核表达载体pSecTag2／HygroB-DAF，并利用壳聚糖组装成纳米微粒复合体，转染小鼠NH／3T3成纤维细胞。方法：应用PCR方法，从DAF—pGEM—T Easy Vector克隆相关的DNA序列，插入具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2／HygroB中，构建pSecTag2／HygroB—DAF真核表达质粒，并进行酶切鉴定及序列测定；利用壳聚糖包裹质粒，转染小鼠NIH／3T3细胞，并对转染细胞用抗DAF进行免疫组化染色。结果：DAF基因大小为1049bp，与基因序列数据库中记载的人DAF cDNA序列结果完全一致；利用壳聚糖-DAF纳米微粒转染NIH／3T3细胞24h后，免疫组化染色显示细胞质弥漫染色阳性。结论：成功构建了人DAF真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NH／3T3细胞。     

hIGF-1基因转染对成纤维细胞增殖的影响

目的：探讨人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)基因转染对成纤维细胞增殖的影响。方法：用脂质体转染法将pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染鼠成纤维细胞NIH3T3,经G418筛选抗性NIH3T3细胞并继续培养4周,进行原位杂交和免疫细胞化学检测hIGF-1的表达,MTT方法和流式细胞仪检测NIH3T3细胞增殖能力。结果：转染pcDNA3.1-hIGF-1后的NIH3T3细胞内有大量hIGF-1 mRNA和蛋白质的表达;MTT检测显示转染pcDNA3.1-hIGF-1的NIH3T3细胞光吸收值增大,与未转染的NIH3T3细胞组比较,差异具有显著性(P<0.01);流式细胞仪检测显示转染组细胞,S期比例增加（59.3%）,G₁期比例减少（27.2%）。结论：pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染成纤维细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进成纤维细胞的增殖。     

两种常用转染试剂转染siRNA至HL-60细胞转染效率的比较

目的比较两种常用转染试剂转染小干扰RNA(siRNA)至悬浮细胞的转染效率及对细胞毒性的影响。方法以羧基荧光素(FAM)标记的siRNA为报告基因,以lipofectamine 2000和siPORT NeoFX为转染试剂,用流式细胞仪检测转染效率,倒置显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞存活率。结果 siRNA>100 nmol/L时,lipofectamine 2000的转染效率高于siPORT NeoFX(P<0.05);si RNA<100 nmol/L时,前者低于后者(P<0.05)。siRNA终浓度及转染试剂用量相同时,lipofectamine 2000组HL-60细胞存活率与SiPORT NeoFX组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论在使用高浓度si RNA时,lipofectamine2000对HL-60细胞有较高的转染效率和较小细胞毒性。     

U937单核细胞几种不同转染方法的比较

 目的 采用不同质粒转染方法介导重组pIRES2-EGFP-TFPI-2质粒转染U937单核细胞,以获得较高转染效率的方法。方法 分别采用电穿孔法、Effectene转染试剂、Lipofectamine 2000转染试剂、电穿孔+Effectene转染试剂、电穿孔+Lipofectamine 2000转染试剂及HilyMax转染试剂等不同方法介导质粒进行转染,测定不同方法的转染效率、目的基因mRNA表达水平及其对细胞活力的影响。结果 电穿孔+Effectene转染试剂组、电穿孔+Lipofectamine 2000组及HilyMax组的转染效率和目的基因mRNA表达较高,且HilyMax组对细胞活力影响较小。结论 将重组pIRES2-EGFP-TFPI-2质粒体外成功转染入U937单核细胞中,通过优化转染方法提高转染效率、降低对细胞活力的影响,为基因治疗提供了实验基础。     

人精子顶体膜相关蛋白32真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的:研究人精子顶体膜相关蛋白32(hSAMP32)mRNA在体外细胞NIH3T3中的表达。方法:利用RTPCR及亚克隆技术构建pcDNA3.1( )hSAMP32质粒,实验组以脂质体介导基因转染法将pcDNA3.1( )hSAMP32真核表达载体导入NIH3T3细胞中,同时设置空白和阴性对照组(转染空载体pcDNA3.1( ))。原位杂交检测hSAMP32mRNA在3组细胞中的表达。结果:①RTPCR扩增产物与预期的目的基因hSAMP32长度一致。亚克隆酶切鉴定可见目的片段。②实验组阳性细胞胞浆中可见hSAMP32mRNA的表达,镜下可见蓝紫色阳性颗粒,空白和阴性对照组未见蓝紫色阳性颗粒。结论:脂质体介导基因转染法能够将pcDNA3.1hSAMP32真核表达载体高效导入NIH3T3细胞中,实现了hSAMP32基因的体外表达。     

阳离子脂质体介导的基因转染真核细胞的研究

目的研究高效的阳离子转染NIH3T3的方法.方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,利用流式细胞仪比较三种脂质体转染效果,用不同的细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间优化转染条件.结果转染效率 LipofectAMINE2000＞GenePORTs＞LipofectAMINE.在细胞融合度为60% ～ 70%,脂质体/DNA为3 μL/μg,脂质体的量为3 μL,转染时间为5 h时,转染效率最高.转染结束后表达时间可以达一个月.结论 LipofectAMINE2000转染效率最佳,并优化了其最佳转染条件.     

重组载体pLNCX/iNOS的构建及其在NIH3T3细胞中滴度的测定

目的 :构建重组质粒pLNCX/iNOS。方法 :用PCR技术从pCMV/iNOS质粒中扩增出iNOS全长cDNA ,与逆转录病毒pLNCX构建重组质粒pLNCX/iNOS ;通过脂质体介导把重组质粒转染入包装细胞PA3 17中 ,经G418筛选出抗性克隆。通过NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果 :经过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定重组质粒构建正确。G418筛选出 16个抗性克隆 ,能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒。NIH3T3细胞测定病毒滴度为 2 .1×10 4CFU·ml-1。结论 :逆转录病毒载体pLNCX可有效地介导iNOS的转染