联合转染Livin和Survivin shRNA表达载体对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响

目的:分别构建Livin、Survivin基因短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,探究联合转染Livin和Survivin真核表达载体对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响。方法:分别设计并构建针对Livin、Sur-vivin基因shRNA真核表达载体pSD11-Livin和pSD11-Survivin,脂质体法单独或联合转染肝癌HepG2细胞,分空白对照组、质粒对照组、Survivin组、Livin组和共转染组。荧光定量PCR、Western blot分别检测Livin、Survivin mRNA及蛋白的相对表达量,MTT法检测细胞增殖的变化,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果:针对Livin、Survivin基因的shRNA真核表达载体构建成功。共转染组Livin、SurvivinmRNA相对表达量分别为0.120±0.022、0.325±0.125,与单独转染组相比显著降低(P<0.05);共转染组Livin、Survivin蛋白相对表达量分别为0.412±0.099、0.473±0.051,与单独转染组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。共转染组转染后48、60、72 h细胞生长抑制率均显著高于单独转染组(P<0.05),转染后48 h细胞凋亡率明显上升(P<0.05)。结论:针对Livin、Survivin基因的shRNA真核表达载体构建成功。联合转染pSD11-Livin和pSD11-Survivin更有效地降低了Livin和Survivin基因在HepG2细胞中的表达,更显著地抑制了肝癌细胞的增殖,促进了肝癌细胞的凋亡。     

靶向Survivin基因的短发卡RNA对U251细胞生长和凋亡的影响

目的观察Survivin基因特异性短发卡RNA（shRNA）对人脑胶质母细胞瘤U251细胞体外生长和细胞凋亡的影响。方法对U251细胞，稳定转染Survivin基因shRNA真核表达载体pWH1-SR的U251-SR细胞，以及稳定转染空载体pWH1的U251-P细胞。分别采用细胞计数法绘制生长曲线和平板克隆形成实验观察各组细胞的体外生长情况；采用流式细胞术（FCM）定量测定各组细胞的细胞周期和凋亡细胞数量；采用HE染色、Hoechst染色和原位末端标记（TUNEL）方法观察各组细胞形态学特征。结果与U251和U251-P细胞相比，U251-SR细胞生长明显减缓（P〈0．01），细胞克隆形成明显减少（P〈0．01）；U251-SR细胞G1期细胞增多，S期细胞减少，凋亡细胞增加至20．9％，并呈现典型的细胞凋亡形态学改变。结论靶向Survivin基因的特异性shRNA能够在体外明显抑制U251细胞的生长并诱导其发生大量凋亡。     

发夹结构RNA表达载体特异性抑制结肠癌LoVo细胞绿色荧光蛋白基因表达

目的 构建针对绿色荧光蛋白(GFP)基因的发夹结构RNA表达载体(SHi-pU6-GFP)，观察SHi-pU6-GFP对结肠癌LoVo细胞的GFP特异性抑制作用。方法 设计合成针对绿色荧光蛋白GFP基因的发夹RNA(shRNA)序列，构建SHi-pU6-GFP质粒。采用报告基因质粒pCX-GFP(5510bp)和含有鼠U6启动子pU6(3．3kb)质粒，应用Lipofectamine^TM 2000将pCX-GFP质粒和SHi-pU6-GFP质粒转染K562细胞和LoVo细胞。荧光显微镜观察转染效果和不同时间的转染效率。结果 质粒pU6和SHi-pU6-GFP经EcoRⅤ和XbaⅠ酶切电泳后，前者出现3．3kb和约300bp条带，而后者出现3．3kb和约350bp条带，与实验设计的针对GFP的shRNA长度相符。说明本实验已成功构建了针对绿色荧光蛋白GFP基因的SHi-pU6-GFP质粒。K562细胞和LcVo细胞中分别观察到转染pCX-EGFP质粒和SHi-pU6-GFP质粒前后发绿色荧光的细胞数目明显减少。结论 结肠癌LoVo细胞存在RNA干扰现象，可以进行相关RNA干扰抑制实验。     

短发夹状RNA抑制缺氧诱导因子1α在前列腺癌细胞中的表达

目的:构建产生缺氧诱导因子1α(HIF-1α)特异性短发夹状RNA(shRNA)的载体并检测其抑制作用,探讨该技术在前列腺癌治疗中的应用前景。方法:设计、合成针对HIF-1α的特异性shRNA模板序列,将其插入含有U6启动子的psilencerTM2.1-U6载体中,得到shRNA表达载体psilencer-HIF,在脂质体介导下转染前列腺癌细胞株PC-3M,应用绿色荧光蛋白质粒pEGFP共转染评价转染效率,RT-PCR及Western印迹检测其对HIF-1α表达的影响。结果:重组质粒psilencer-HIF经测序分析证实与设计的完全一致,共转染24 h后质粒转染效率为(89.26±4.72)%,其产生的shRNA在PC-3M细胞中能诱导RNA干扰(RNAi),转染后48 h HIF-1αmRNA和蛋白水平分别下降82.09%和81.61%(P<0.01);而阴性对照组HIF-1α表达水平无明显改变(P>0.05)。结论:成功构建了HIF-1α基因shRNA表达质粒,其可有效抑制前列腺癌细胞中的HIF-1α的表达,为前列腺癌的基因治疗提供了新思路。     

干扰多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1促进人胶质母细胞瘤U251细胞株侵袭性的机制

目的 探讨干扰多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1(LRIG1)基因表达促进人胶质母细胞瘤U251细胞株侵袭性的机制.方法 用携带U6启动子的LRIG1特异性短发夹RNA (shRNA)序列的质粒载体pGenesil2-LRIG1-shRNA (siRNA)及含非特异shRNA编码序列的对照质粒pGenesil2-negative shRNA(neg)转染U251细胞株,通过G418筛选,鉴定得到稳定转染细胞株.采用侵袭实验验证干扰LRIG1对U251侵袭性的影响,通过明胶酶谱实验检测基质金属蛋白激酶(MMP)-2、MMP-9的活性,Western blot法检测表皮生长因子(EGFR)及其下游丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B( P13K/AKT)信号通路蛋白的表达差异.结果 含U6启动子LRIG1 shRNA序列的质粒转染干扰组LRIG1 mRNA降低至对照组(35.3％～39.2％,P＜0.05).干扰LRIG1表达组U251细胞侵袭数[(159±15)～ (188±9)/视野],较空白对照组细胞侵袭数[(28±9)/视野]明显增多(P＜0.05);干扰LRIG1激活EGFR通路传导;干扰LRIG1后干扰组MMP-2较对照组活性增加(1.66±0.11～1.96±0.12,P＜0.01),MMP-9干扰组较对照组活性增加(4.82±0.27～4.47±0.29).结论 LRIG1表达下调后MMP-2、MMP-9活性增强,从而促进U251细胞的侵袭性,可能通过激活EGFR信号通路引起.     

小分子干扰RNA特异性抑制胃癌SGC7901细胞人端粒酶催化亚单位基因表达的研究

目的构建针对人端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit,hTERT)基因的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体pU6-hTERT-siRNAs,观察其对胃癌SGC7901细胞hTERT基因的特异性抑制作用。方法采用报告基因质粒pCX-GFP(5510bp)和含有鼠U6启动子pU6(3300bp)质粒,设计合成针对绿色荧光蛋白(GFP)基因的发夹RNA(shRNA)序列,构建SHi-pU6-GFP质粒。应用Lipofeetamine^TM 2000将pCX-GFP质粒和SHi-pU6-GFP质粒转染K562细胞、SGC7901细胞,并用荧光显微镜观察转染效果。设计合成针对hTERT的siRNAs,构建重组pU6-hTERT-siRNAs质粒。Lipofectamine^TM 2000介导pU6-hTERT-siRNAs质粒转染SGC7901细胞。分别应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)定性和定量检测hTERT基因表达情况。结果质粒pU6和SHi-pU6-GFP经EcoRV和XbaⅠ酶切电泳后,前者出现3300bp和约300bp条带,而后者出现3300bp和约350bp条带,与实验设计的针对GFP的shRNA长度相符。说明本实验已成功构建了针对绿色荧光蛋白GFP基因的SHi-pU6-GFP质粒。K562细胞和SGC7901细胞中分别观察到转染pCX-GFP质粒和SHi-pU6-GFP质粒前后发绿色荧光的细胞数目明显减少。定性、定量检测SGC7901细胞转染pU6-hTERT-siRNAs组hTERT基因表达抑制。结论针对hTERT基因设计的siRNAs表达质粒可以特异性抑制SGC7901细胞hTERT基因表达。     

RNAi靶向抑制suvivinn基因对膀胱癌EJ细胞凋亡和细胞周期的影响

用真核转录载体pSilencer 2.0.U6在膀胱癌细胞系EJ细胞内表达针对Survivin基因的短发卡状RNA(shRNA),以阻断细胞中Survivin基因的表达,观察Survivin基因沉默后对EJ细胞凋亡、细胞周期产生的影响.     

Survivin shRNA表达质粒的构建、转染和筛选

我们采取基因静寂策略,利用psi RNA-hH1neo载体,以Survivin mRNA为靶序列,构建在细胞内产生短发夹状RNA(shRNA)的重组质粒,观察其对胆囊癌细胞株GBC-SD的抑制作用.     

shRNA抑制SGC7901胃癌细胞绿色荧光蛋白基因的表达

目的：观察针对绿色荧光蛋白(GFP)基因的发夹结构RNA(small hairpin RNA，shRNA)表达载体(SHi—pU6-GFP)对SGC7901胃癌细胞中GFP的抑制作用。方法：设计针对GFP基因的shRNA序列．构建SHi—pU6-GFP质粒。采用质粒pCX—GFP(5510bp)和含有鼠U6启动子pU6（3．3kb)质粒，应用Lipofectamine^TM2000将pCX-GFP质粒和SHi—pU6-GFP质粒转染SGC7901细胞。荧光显微镜观察转染效果和不同时间的转染效率。结果：质粒SHi-pU6-GFP经酶切电泳后，出现3．3kh和约350bp条带，与实验设计的针对GFP的shRNA长度相符。说明本实验已成功构建了针对绿色荧光蛋白GFP基因的SHi—pU6-GFP质粒。SGC7901细胞中观察到转染pCX—EGFP质粒和SHi—pU6-GFP质粒前后发绿色荧光的细胞数目明显减少：结论：shRNA可以有效地抑制SGC7901细胞中GFP基因的表达。     

靶向Survivin的小分子干扰RNA对骨肉瘤细胞的体内外抑制作用

目的 观察靶向Survivin基因的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体对人骨肉瘤细胞MG-63的体内外抑制作用.方法 体外构建Survivin siRNA表达载体pSilence2.1-neo-Survivin,转染骨肉瘤细胞株MG-63、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学(SP)法检测转染前后Survivin mRNA及蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期分布,吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡,建立裸鼠移植瘤模型,记录瘤体形成时间及肿瘤生长.结果 转染后MG-63细胞Survivin基因mRNA水平和蛋白表达显著下降,转染后mRAN表达抑制率为85.08%,增殖指数为空白组的28.20%;细胞周期分析显示:shRNA组G0/G1期细胞明显增多,而G2/M期、S期细胞数目减少;吖啶橙染色显示转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变,转染组凋亡率为24.54%;稳定转染组细胞裸鼠体内致瘤能力降低,转染组成瘤时间为(13.2±2.0)d,空白组为(6.5±1.6)d,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01).4周时同空白组相比转染组瘤体体积小62.89%(P＜0.01),重量轻59.07%(P＜0.01).结论 靶向Survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制骨肉瘤细胞MG-63增殖,促进细胞凋亡;明显抑制人骨肉瘤细胞的致瘤活性及裸鼠移植瘤的生长.     

慢病毒介导的RNA干扰沉默Wip1基因对人脑胶质母细胞瘤细胞生长的影响

目的 构建人Wip1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默人胶质瘤U251细胞的Wip1基因并观察其对细胞生长的影响.方法 设计并合成3条Wip1基因特异性RNAi靶序列,构建到慢病毒pFU-GW-iRNA载体中.慢病毒包装转染HEK293T细胞,获得病毒上清并测定其滴度;感染U251细胞,实时定量聚合酶链反应(PCR)及Western blot鉴定RNA干扰效率;筛选出基因沉默效率最高的慢病毒感染U251细胞,CCK-8法检测细胞的增殖,Western blot检测RNA干扰后的bcl-2蛋白表达.结果 PCR扩增和测序表明成功构建Wip1慢病毒干扰载体,病毒载体包装获得的病毒上清滴度在3×10~8～8×10~8 TU/ml.可以有效地沉默U251细胞中Wip1基因的表达,构建的RNAi慢病毒载体感染U251细胞后Wip1基因的mRNA表达量同对照组比较分别为36.3%、32.9%、23.8%.稳定Wip1 RNA干扰后的U251细胞4 d后细胞增殖能力下降35.1%.结论 慢病毒介导的RNA干扰可以高效稳定地沉默基因表达,Wip1基因促进了U251细胞的增殖.     

腺病毒载体介导的Polo样激酶1短发夹环RNA对胶质瘤体内外增殖的抑制作用

目的探讨重组腺病毒载体介导的Polo样激酶1（PLK1）短发夹环RNA（shRNA）对人胶质瘤细胞株U251在体内外增殖的抑制作用。方法设计并合成针对PLK1的shRNA,并克隆至真核表达载体pEGFP—H1上,再将H1启动子和shRNA亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack上,通过在携带有pAdeasy-1质粒的BJ5183细菌内同源重组,生成针对PLK1的shRNA重组腺病毒载体pAD-H1／PLK1,经293细胞包装产生重组腺病毒AD-H1／PLK1,感染U251细胞。应用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）的方法检测U251细胞PLK1mRNA表达,流式细胞仪检测细胞凋亡以及细胞G2／M期转变情况,以噻唑蓝（MTT）比色法检测各组细胞的增殖活性。同时制备裸鼠U251细胞移植瘤模型并注射重组腺病毒,观察肿瘤生长情况。结果成功构建针对PLK1基因的RNA干扰腺病毒表达载体,与AD-H1组比较AD-H1／PLK1组在转染24h和48hU251细胞PLK1mRNA表达水平分别降低50．4％（P〈0．01）和71．9％（P〈0．01）。且感染AD-H1／PLK1病毒48h后的U251细胞凋亡率从8．3％升至65．6％（P〈0．01）,而G2／M期的细胞从21．5％增至51．4％（P〈0．01）,细胞的增殖能力则下降50％（P〈0．01）。体内实验表明重组腺病毒载体介导的PLK1shRNA也明显抑制肿瘤生长（P〈0．01）。结论腺病毒介导的RNA干扰技术可有效降低PLK1在胶质瘤细胞中的表达水平,抑制肿瘤细胞在体内外的增殖活性。     

靶向存活素基因短发卡RNA对人脑胶质母细胞瘤U251细胞在裸鼠体内生长的影响

目的观察靶向存活素基因的特异性短发卡RNA（shRNA）对人脑胶质母细胞瘤U251细胞裸鼠体内肿瘤生长和血管形成的影响。方法将U251细胞、稳定转染存活素基因shRNA真核表达载体pWH1-SR的U251细胞（U251-SR细胞）、稳定转染空载体pWH1的U251细胞（U251-P细胞）,分别接种于15只裸鼠背部皮下,每组5只,观测肿瘤生长情况。采用免疫组化SABC方法检测存活素、增殖细胞核抗原（PCNA）以及第八因子相关抗原（FⅧRAg）在各组肿瘤标本中的表达;采用TUNEL方法检测凋亡细胞,分别计算各组肿瘤标本的增殖指数（PI）、凋亡指数（AI）以及微血管密度（MVD）。结果与U251、U251-P组相比,U251-SR组裸鼠肿瘤形成时间延迟,肿瘤生长缓慢,肿瘤体积及重量均明显减小（P均〈0.01）;肿瘤标本存活素蛋白表达明显下调;PI和MVD明显减少,AI明显升高（P均〈0．01）。结论靶向存活素基因的shRNA能够在裸鼠体内明显抑制U251细胞的肿瘤生长和血管形成。     

Survivin基因干扰RNA对骨肉瘤MG-63细胞系增殖和凋亡的影响

[目的]观察Survivin基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响。[方法]体外构建Survivin shRNA表达载体pSilence2．1-neo-Survivin，转染骨肉瘤细胞系MG-63，筛选稳定表达的克隆，倒置显微镜观察各组细胞形态学变化，RT-PCR、Weston-blot方法检测转染后Survivin mRNA及蛋白的表达，噻唑蓝（MTT）法、克隆形成实验检测细胞的增殖情况，吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡情况。[结果]转染后MG-63细胞Survivin基因mRNA水平和蛋白表达显著下降，其抑制率分别为85．08％和81．14％；细胞增殖受到显著抑制，培养48h后与空白组比较，抑制率达63．4l％；吖啶橙染色显示转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变，转染组凋亡率为24．54％。[结论]靶向Survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制骨肉瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。     

稳定整合靶向EGFL7基因的shRNA载体的胶质瘤细胞系的建立

目的构建针对EGFL7基因的特异性RNA干扰载体,建立稳定转染该干扰载体的人胶质瘤细胞系。方法根据EGFL7基因的编码序列设计并合成针对EGFL7基因的特异性shRNA,将其克隆入pSilencer3.1-H1neo载体中,重组载体经脂质体LipofectamineTM2000介导转染胶质瘤细胞株U251;转染细胞经G418筛选,采用Westernblot方法在蛋白水平检测筛选出的G418抗性的克隆细胞。结果酶切鉴定和测序证实,成功构建了靶向EGFL7基因的shRNA真核表达载体pSilencer-shEGFL7,并获得了稳定表达靶向EGFL7基因的shRNA的胶质瘤细胞株。结论 EGFL7基因特异性RNA干扰载体能够显著抑制EGFL7基因在U251细胞中的表达,这为进一步研究EGFL7在胶质瘤细胞系U251中的生物学功能和作用机制奠定了基础。     

靶向细胞外信号调节激酶2短发夹式RNA对人食管癌Eca109细胞增殖的影响

目的 观察靶向细胞外信号调节激酶2(ERK2)短发夹式RNA(shRNA-ERK2)对人食管癌细胞株Eca109细胞增殖的影响.方法 构建重组质粒pGeneClipTM-shRNA-ERK2脂质体介导重组质粒转染人食管癌Eca109细胞,荧光倒置显微镜观察转染效率;噻唑蓝(MTT)比色法检测转染食管癌Eca109细胞后细胞的增殖能力;Western blot检测转染后食管癌Eca109细胞ERK2基因的表达和凋亡抑制基因Survivin的表达.结果 测序证实载体构建成功,荧光倒置显微镜观察转染后72 h转染效率50%～70%;转染重组质粒96 h后食管癌Eca109细胞生长抑制率最高为10.45%,与阴性对照组(非特异性序列对照)和空白对照组比较抑制效果明显(P＜0.05);转染重组质粒72 h和96 h后食管癌Eca109细胞株中ERK2和Survivin的表达与U0126对照组和阴性对照组比较均下降(P＜0.05).结论 重组质粒pGeneClipTM-shRNA-ERK2在食管癌Eca109细胞株中能发挥靶基因沉默作用,影响Survivin基因的表达,抑制食管癌细胞增殖.     

结直肠癌中缺氧诱导因子-1α与Survivin表达的关系

目的 探讨结肠癌LS174T细胞及结直肠腺癌组织中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达及与Survivin的关系.方法 构建靶向HIF-1α的质粒pSilence-2.1-U6-siRNA并鉴定,采用阳离子脂质体转染法将其转染LS174T细胞,低氧培养24h,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测siRNA对HIF-1α的抑制作用.Western blot检测Survivin蛋白表达.应用免疫组织化学方法检测69例人结直肠腺癌组织中HIF-1α、Survivin蛋白的表达.结果 LS174T细胞转染靶向HIF-1α的siRNA表达载体后,HIF-1α、Survivin表达显著下降.69例结直肠腺癌组织中,HIF-1α、Survivin蛋白的阳性表达率为66.7％ (46/69)和56.5％ (39/69).腺癌组HIF-1α蛋白阳性表达率显著高于腺瘤组(P＜0.01).Ⅲ期腺癌HIF-1α蛋白表达显著高于Ⅰ～Ⅱ患者(P＜0.05).结直肠腺癌中HIF-1α表达与Survivin显著正相关.结论 结直肠腺癌发展过程中HIF-1α与Survivin表达密切相关.