胰腺癌CFPAC1细胞增殖诱导配体基因shRNA慢病毒表达载体的构建

目的 构建针对人胰腺癌细胞株CFPAC1增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的shRNA慢病毒表达载体.方法 应用基因工程技术,筛选出针对APRIL基因的RNAi靶序列,与pGCL-GFP载体连接,构建慢病毒表达载体LV-shAPRIL;将连接产物转化到DHSα感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定.再用LV-shAPRIL、pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒.重组慢病毒感染CFPAC1细胞,实时定量PCR和Western blotting检测CFPAC1细胞APRIL mRNA和蛋白的表达.结果 PCR和测序结果与构建的慢病毒载体的预期结果一致,经包装产生的病毒滴度为5×107TU/ml.构建的慢病毒载体感染CFPAC1细胞后第4天、第4周和第8周,APRIL mRNA表达量较空载体慢病毒感染组分别下降了73%、70%和71%;APRIL蛋白表达量分别下降了66%、63%和62%(P＜0.05).而各时间段未感染慢病毒的细胞组与空载体组相比无明显差异(P＞0.05).结论 成功构建了APRIL基因的shRNA慢病毒表达载体LV-shAPRIL.     

RPL31-siRNA对人胰腺癌BxPC-3细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用

目的:研究siRNA沉默糖体蛋白L31(ribosomal protein L31,RPL31)对人胰腺癌BxPC-3细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用,探讨RPL31基因在胰腺癌中可能的作用机制.方法:设计合成靶向人RPL31基因的siRNA及阴性对照siRNA;建立人胰腺癌BxPC-3细胞的Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型,按照移植瘤体积随机化分为3组:溶剂对照组、阴性对照组及RPL31-siRNA干预组;使用RNAi-Mate转染试剂将RPL31-siRNA进行移植瘤瘤内注射,观察各组裸鼠体内瘤体生长速度,绘制肿瘤生长曲线;采用实时定量PCR及Western blot的方法检测移植瘤组织RPL31基因的表达;免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测裸鼠皮下移植瘤Ki-67及CD31的表达;原位末端标记技术(TUNEL)检测移植瘤组织的细胞凋亡.结果:与溶剂对照组和阴性对照组相比,RPL31-siRNA注射组裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,移植瘤体积明显缩小,差异具有统计学意义(P<0.05);移植瘤组织中RPL31基因的mRNA水平和蛋白水平表达下调;另外,RPL31-siRNA注射组裸鼠移植瘤中Ki-67表达下调(55.78%±4.63%、51.37%±5.05%vs11.08%±1.31%),CD31的表达下调(56.53%±6.03%、44.84%±5.24%vs9.67%±1.39%);RPL31-siRNA注射组裸鼠移植瘤细胞凋亡增加(2.92%±0.54%、3.85%±0.87%vs39.58%±4.02%).结论:RPL31-siRNA可以下调胰腺癌BxPC-3细胞裸鼠皮下移植瘤中RPL31基因的表达,抑制移植瘤的生长,并且还可以抑制移植瘤中Ki-67及CD31的表达,诱导移植瘤细胞的凋亡.以RPL31为靶点的基因治疗有潜在临床应用前景.     

PUMA基因转染对胰腺癌细胞生长的影响

目的 探讨PUMA基因转染抑制胰腺肿瘤生长的体内外效果.方法 利用脂质体转染法将表达PUMA的质粒转染导入胰腺癌细胞株PC-3中,G418筛选出阳性克隆,Western和RT-PCR法检测PUMA转染后PC-3 PUMA的表达,流式细胞仪检测转染后细胞凋亡率;分别将转染PUMA的PC-3细胞(实验组)和未转染的PC-3细胞移植到裸鼠体内,比较裸鼠移植肿瘤的大小和重量以及PUMA表达.结果 PUMA表达质粒转染的PC-3细胞(PC-3/PUMA)稳定表达PUMA,其细胞凋亡率为(5.50 ± 0.90)%,明显高于未转染组的(1.073 ± 0.248)%和空载体转染组的(1.08 ± 0.35)%(P ＜0.05);裸鼠接种4周后PC-3/PUMA细胞成瘤率为70%,PC-3细胞和空载体PC-3细胞成瘤率为100%(P ＞ 0.05),PC-3/PUMA细胞形成的肿瘤体积比PC-3细胞和空载体PC-3细胞明显减小(P ＜0.05),并且形成的肿瘤组织中PUMA高表达.结论 胰腺癌细胞中缺失PUMA基因表达,PUMA转染胰腺癌细胞后表达PUMA,并能促进细胞凋亡.     

静默人类真核延伸因子1A2对胰腺癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的 探讨静默人类真核延伸因子1A2(EEF1A2)对胰腺癌细胞体内生长的影响及其可能的机制.方法 建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,均分为空白组、阴性对照组、EEF1A2组,移植瘤内分别注射PBS、阴性对照siRNA和特异性EEF1A2 siRNA.测定各组移植瘤的体积和质量;应用免疫组织化学的方法检测各组移植瘤组织中EEF1A2和抗增殖细胞核抗原抗体(PCNA)的表达;应用TUNEL法检测各组移植瘤组织中细胞凋亡率.结果 在裸鼠移植瘤模型中,从给药后第17天开始,EEF1A2组移植瘤体积增长明显滞后于阴性对照组和空白组(P值均＜0.05).治疗结束后切取肿瘤称重,EEF1A2组肿瘤质量为(0.27±0.06)g,显著低于阴性对照组和空白组[(0.39±0.08)g和(0.43±0.07)g,P＜0.05].EEF1A2主要表达于胰腺癌细胞胞质,其中在阴性对照组和空白组中,阳性细胞分布比较密集,阳性率分别为(72.58±25.47)％和(76.75±23.19)％,而EEF1A2组阳性细胞分布较稀疏,阳性率为(34.78±21.36)％,差异有统计学意义(P＜0.01).EEF1A2组的PCNA蛋白表达也显著低于空白组和阴性对照组(P＜0.01),而原位末端转移酶标记技术(TUNEL)的结果显示EEF1A2组中细胞凋亡率高于空白组和阴性对照组(P＜0.01).结论 EEF1A2在体内能被有效静默,EEF1A2静默后能明显抑制胰腺癌细胞的生长,可能与其抑制细胞增殖和促进细胞凋亡有关.     

Slug-siRNA干扰Slug基因表达对胰腺癌的抑制作用

目的: 研究携带Slug-siRNA的rAAV对裸鼠体内胰腺癌的作用.方法: 建立人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,2wk后随机将建模成功的裸鼠分为3组,每组6只. 构建携带Slug-siRNA的rAAV载体,采用瘤体内多点注射的方法,阴性对照组裸鼠按1×109 puf(50 μL)标准注射rAAV-EGFP,空白对照组裸鼠注射等量生理盐水,实验组裸鼠按1×109 puf(50 μL)标准注射rAAV2-EGFP-slugsiRNA,只注射1次. 观察裸鼠的一般情况,摄食,活动能力,每周用电子天平秤体质量,绘制裸鼠生长曲线. 治疗6 wk后二氧化碳吸入法处死裸鼠,切取肿瘤称质量;免疫组织化学SP法检测slug蛋白的表达,TUNEL检测皮下移植瘤细胞凋亡,透射电镜检测细胞超微结构.结果: 3组裸鼠分别接受不同的处理后,在开始的2 wk皮下移植瘤的生长无明显差别,2 wk以后,实验组裸鼠皮下移植瘤的体积增长明显滞后于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义( P<0.05). 治疗6 wk后,实验组裸鼠皮下移植瘤的质量明显轻于阴性对照组和空白对照组差异有统计学意义(3.26±0.48 g vs7.56±1.25 g,7.50±1.23 g,均P<0.05). 实验组裸鼠皮下移植瘤的AI值明显高于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(0.27±0.06vs 0.024±0.01,0.025±0.01,均P<0.05);实验组的抑瘤率明显高于阴性对照组,差异有统计学差异(71.4% vs 0.04%,P<0.01). 透射电镜下,实验组肿瘤细胞可见细胞器结构模糊,核固缩,染色质边集等现象. 免疫组织化学检测示实验组Slug表达明显减少.结论: Slug基因被有效沉默,Slug基因沉默后促进细胞凋亡,抑制胰腺癌实体瘤增殖和生长.     

短发夹RNA对胰腺癌细胞PANC-1突变型K-ras基因表达的影响

目的:研究短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人胰腺癌细胞PANC-1中突变型K-ras基因表达的抑制作用.方法:构建特异性针对胰腺癌PANC-1细胞突变型K-ras基因的重组质粒pGensil-1-P1,阴性对照质粒pGensil-1-HK并采用脂质体介导的方法转染胰腺癌细胞.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测K-ras基因mRNA和蛋白的表达,CCK-8方法测量细胞生长曲线.并建立人胰腺癌细胞PANC-1裸鼠皮下移植瘤模型,分别注射Pgenesil-1-P1、Pgenesil-1-HK质粒,动态观察并处死裸鼠计算肿瘤体积.结果:测序证实质粒表达载体构建成功,短发夹RNA(shRNA)使胰腺癌细胞PANC-1突变型K-ras基因的mRNA较未治疗组、阴性对照组相比明显减少(P=0.01);未治疗组、阴性对照组及治疗组的K-ras蛋白表达率分别为100%,99.0%±0.73%,39.9%±2.1%,前两组K-ras蛋白表达差异无统计学意义,治疗组较未治疗组K-ras蛋白表达下调了约60.1%;细胞生长受到明显抑制(P=0.02);经重组质粒治疗14 d后,裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,相较于对照组瘤体明显缩小(P=0.03).结论:shRNA对特异性转染组的胰腺癌细胞的突变K-ras基因表达有抑制作用,使细胞以及裸鼠移植瘤的生长受到抑制.     

下调S100A6基因对裸鼠肺腺癌移植瘤生长和凋亡的影响

目的探讨下调靶向基因S100A6对在体肺腺癌移植瘤生长和凋亡的影响。方法 18只健康Balb/c雄性裸鼠随机分为空载体对照组、阴性对照组及S100A6基因RNA干扰组三组,每组6只动物;分别应用不携带目的基因的空载质粒、未转染任何质粒以及含有S100A6基因RNA干扰慢病毒质粒的A549肺腺癌细胞接种于裸鼠皮下,构建移植瘤动物模型;观察不同组移植瘤组织生长情况;采用Real-Time PCR、免疫组织化学及Western-blot等技术检测S100A6 mRNA和蛋白的表达,TUNEL法检测细胞凋亡。结果成功构建了裸鼠肺腺癌皮下移植瘤模型;病理学特征显示,阴性对照组和空载体对照组可见到成巢的肿瘤细胞,癌细胞核大,而干扰组肿瘤细胞较稀疏,间质组织明显;接种细胞2周时,阴性对照组、空载体对照组和RNA干扰组肿瘤组织体积和质量差异具有统计学意义(P0.05);S100A6基因和蛋白表达在三组之间差异具有统计学意义(P0.05);各组裸鼠移植瘤凋亡细胞呈现不同程度的棕褐色肿瘤细胞核,三组肿瘤细胞凋亡率的差异具有统计学意义(P0.05)。结论下调肿瘤瘤组织S100A6蛋白表达,可抑制肿瘤生长,诱导细胞凋亡,为进一步开发肺腺癌分子靶点提供了新途径。     

携带人Endostatin基因的腺病毒治疗胰腺癌移植瘤

目的 观察携带人Endostatin基因的重组腺病毒载体Ad-hEnd对裸鼠胰腺癌移植瘤的治疗作用.方法 将胰腺癌细胞株SW1990细胞皮下注射建立裸鼠移植瘤模型,随机分为Ad-hEnd组、报告基因LacZ重组腺病毒组(Ad-LacZ组)和对照组,每组8只.重组腺病毒200 μl瘤内注射,隔日1次,共4次.观察移植瘤的生长情况,免疫组化染色检测血管内皮生长因子(VEGF)的表达和微血管密度(MVD),原位缺口末端标记法(TUNEL)检测肿瘤细胞凋亡.结果 移植瘤成瘤率100%.治疗后4周,Ad-hEnd组、Ad-LacZ组和对照组移植瘤体积分别为(921.9±279.7)mm3、(2804.4±553.5)mm3和(3040.6±487.6)mm3;瘤重分别为(1.19±0.18)g、(2.38±0.42)g和(2.41±0.47)g;VEGF表达阳性率分别为(36.3±7.1)%、(81.2±6.6)%和(79.4±6.2)%;MVD分别为12±4、27±5和25±6;细胞凋亡率分别为(31.2±5.4)%、(9.4±4.9)%和(8.5±3.7)%.与Ad-LacZ组和对照组比较,Ad-hEnd组以上各项指标均有显著性差异(P＜0.01);Ad-LacZ组和对照组之间的差异无统计学意义.结论 重组腺病毒介导的hEndostatin基因可抑制胰腺癌的生长和血管生成,促进肿瘤细胞凋亡,可用于胰腺癌抗血管生成的基因治疗.     

Tiam1基因沉默对胰腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响

目的研究沉默T淋巴瘤侵袭转移诱导因子(Tiam)1基因对胰腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响,并探讨其可能的分子机制。方法通过RNA干扰(RNAi)技术沉默胰腺癌BxPC-3细胞中Tiam1的表达,Western印迹实验检测其沉默效果;将转染处理过的胰腺癌细胞接种于裸鼠皮下,建立胰腺癌皮下移植瘤模型;观察肿瘤生长情况并绘制肿瘤生长曲线,裸鼠处死后,取瘤称重;苏木素-伊红(HE)染色法观察移植瘤组织病理学结构;免疫组织化学染色法(IHC)检测移植瘤组织增殖相关蛋白Ki-67,转移相关蛋白E-钙黏蛋白(cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Slug的表达。结果 RNAi技术可有效沉默胰腺癌BxPC细胞中Tiam1的表达,并成功构建胰腺癌裸鼠移植瘤模型;与对照组比较,si-Tiam1组裸鼠肿瘤体积与质量均明显降低(P<0.05);HE染色结果显示,与对照组比较,si-Tiam1组中肿瘤组织出现细胞皱缩、片状坏死等病理性改变;IHC结果显示,与对照组相比,si-Tiam1组移植瘤组织中Ki-67、Vimentin、Slug的表达明显降低,而E-cadherin的表达明显升高。结论沉默Tiam1能有效抑制胰腺癌裸鼠移植瘤的生长,其机制可能与Ki-67、Vimentin、Slug表达的降低及E-cadherin的表达增强有关,提示Tiam1有可能成为胰腺癌基因治疗的新靶标。     

survivin ASODN对人胰腺癌PANC细胞移植瘤生长的影响及机制探讨

目的观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)转染对人胰腺癌PANC细胞裸鼠移植瘤生长及瘤组织中survivin、PTEN、CEACAM-1表达的影响,并探讨其作用机制。方法构建28只人胰腺癌PANC细胞裸鼠移植瘤模型,随机分为对照组、正义寡核苷酸(SODN)组、ASODN组、脂质体组,各7只,分别于瘤周及瘤体注射50μL的PBS、SODN、ASODN、脂质体+无血清DMEM。注射结束后2 d,切取瘤体,测算肿瘤生长抑制率和生长指数,免疫组化法检测瘤组织中的survivin、PTEN、CEACAM-1蛋白,TUNEL染色镜下观察细胞凋亡情况,半定量RT-PCR检测瘤组织中的survivin mRNA、PTEN mRNA、CEACAM-1 mRNA。结果与其他三组相比,ASODN组肿瘤生长抑制率高、生长指数低、细胞凋亡指数高(P均<0.05),其瘤组织中survivin和CEACAM-1表达下降、PTEN表达上升(P均<0.05)。结论 survivin ASODN可有效抑制人胰腺癌裸鼠移植瘤的生长并诱导肿瘤细胞凋亡,其机制可能与抑制survivin和CEACAM-1的表达、促进PTEN的表达有关。     

小干扰RNA靶向突变K-Ras基因对人胰腺癌细胞TGFβ1表达的影响

背景与目的研究显示ras基因活化可促使肿瘤细胞分泌多种细胞因子,而ras基因与TGFβ1基因表达之间的关系还未可知。本研究利用小干扰RNA敲除突变k-ras基因,探讨突变k-ras基因对TGFβ1表达及分泌的影响。方法小干扰RNA瞬时转染靶向突变k-ras后,应用real-time PCR和Western blot方法检测胰腺癌细胞株CFPAC-1、Aspc-1中ras mRNA和蛋白的表达;应用real-time PCR和流式细胞仪检测对胰腺癌细胞TGFβ1表达的影响;应用ELISA方法检测转染前后胰腺癌细胞上清液中TGFβ1浓度。结果①以人已知基因无影响的序列阴性对照组为基准计算k-ras mRNA的相对表达量,实验组胰腺癌细胞CFPAC-1和ASPC-1转染后k-ras mRNA表达明显减低,k-ras mRNA表达在转染后48h为最低,抑制率达(75.33±5.50)%。Western blot检测各组质粒转染的细胞ras蛋白表达,结果显示实验组ras蛋白量较转染试剂对照组、已知基因无影响的序列阴性对照组明显降低。②Real-timePCR结果显示实验组CFPAC-1和ASPC-1细胞转染后,TGFβ1mRNA表达量(CFPAC-10.68±0.08;Aspc-10.59±0.09)明显降低(P0.05)。而流式细胞仪结果显示TGFβ1蛋白表达降低(CFPAC-1组0.30±0.08,ASPC-1组0.33±0.10,P0.05)。③ELISA法检测实验组CFPAC-1上清液TGFβ1浓度为(1906.87±50.75)ng/ml,较阴性对照组(2072.79±96.98)ng/ml有所降低(P=0.036);实验组Aspc-1细胞上清液TGFβ1浓度(851.47±41.08)ng/ml,较阴性对照组(950.93±31.34)ng/ml有所降低(P0.05)。结论人胰腺癌细胞CFPAC-1、Aspc-1中TGFβ1mRNA和蛋白的表达与ras基因相关。TGFβ1可能是ras基因活化后驱动胰腺癌发生及演变的重要物质。本研究为k-ras突变的胰腺癌治疗提供有益的信息。     

斑蝥素对胰腺癌细胞系PANC1、CFPAC-1的凋亡诱导作用及机制研究

目的 研究斑蝥素对胰腺癌细胞系PANC1、CFPAC-1的凋亡诱导作用及机制。方法 用斑蝥素处理PANC1、CFPAC-1细胞。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;酶化学法检测caspase活性;RT-PCR及蛋白质印迹法检测凋亡相关基因的表达。结果 斑蝥素呈剂量依赖性明显抑制胰腺癌细胞系PANC1、CFPAC-1增殖及诱导细胞凋亡。10μmol/L斑蝥素处理细胞72 h,PANC1、CFPAC-1细胞的增殖抑制率最高,分别达(52.95 +6.34)％和(71.21 +6.30)％。处理24h,PANC1细胞的早期和晚期凋亡细胞分别从7.35％增加到24.89％、6.36％增加到17.73％;CFPAC-1细胞从6.39％增加到24.70％、9.21％增加到12.58％(P值均＜0.01)。PANC1细胞的caspase 8和caspase9活性分别为对照组的(155.8±11.5)％和(194.6±14.7)％;CFPAC-1细胞分别为对照组的(182.5±24.3)％和(215.8±12.2)％(P值均＜0.01)。促凋亡基因TNF-α、TRAILR1、TRAILR2、Bad、Bak和Bid表达增加,抗凋亡基因Bcl-2表达减少。结论 斑蝥素通过激活Caspase、上调促凋亡基因及下调抗凋亡基因的表达从而诱导胰腺癌细胞凋亡。     

转移消失蛋白B基因表达对MHCC97H细胞侵袭和转移潜能的影响

目的 观察慢病毒载体携带靶向人源性MTSS1(转移消失蛋白B基因,MIM-B基因)小干扰RNA对人肝癌细胞株MHCC97H细胞侵袭和转移潜能的影响.方法 构建靶向MTSS1基因的慢病毒载体-siMTSS1,转染MHCC97H细胞.实时荧光定量PCR和Western blot用于测定MIM-B mRNA和蛋白表达;侵袭实验用于评估侵袭潜能;明胶酶谱用于检测基质金属蛋白酶2(MMP2)活性.以MHCC97H构建裸鼠原位移植瘤模型,第14天将24只成模裸鼠随机分成空白对照组、空载体组及治疗组(每组8只),在超声引导下瘤周及瘤内多点注射硼酸盐缓冲液、Lenti-GFP及Lenti-siMTSS1,第35天检测肺转移情况.采用SPSS13.0统计软件对计量资料进行方差分析.结果 成功构建慢病毒载体携带的针对MTSS1基因小干扰RNA,Lenti-siMTSS1感染效率为97.0%,显著抑制MIM-B蛋白表达,下调MMP2活性.体外实验结果显示空白对照组、空载体组和干扰组细胞穿膜数分别为37.9±4.4、37.4±5.3和26.6±4.6(F=26.695,P＜0.01).体内实验结果显示空白对照组、空载体组及治疗组肺转移结节数分别为6.5±2.6、6.4±2.7和3.8±1.3(F=3.637,P＜0.05);肿瘤组织MIM-B mRNA相对表达量分别为0.39±0.19、0.38±0.10和0.16±0.11(F=11.644,P＜0.01).结论 慢病毒介导小干扰RNA抑制MIM-B mRNA和蛋白表达进而抑制HCC侵袭、转移潜能可能与下调MMP2活性相关,为肝癌患者提供一条新的分子靶向治疗思路.     

STAT3基因沉默对胰腺癌细胞株的增殖及对吉西他滨敏感性的影响

目的 探讨信号转导与转录激活因子3（STAT3）基因沉默对吉西他滨介导的胰腺癌细胞株增殖和凋亡及对吉西他滨治疗敏感性的影响.方法 以STAT3荧光素慢病毒及对照的海肾萤光素酶慢病毒感染6株胰腺癌细胞株（BxPC3、L3.6pl、CFPAC-1、MPanc-96,PANC1、MiaPaCa-2）及人胰腺癌导管上皮细胞株（HPDE）,检测各细胞STAT3及磷酸化STAT3（pSTAT3）蛋白的表达.应用RNA干扰技术沉默6株胰腺癌细胞株STAT3基因表达,应用蛋白质印迹法检测细胞STAT3蛋白表达,MTS法检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果 6株胰腺癌细胞株STAT3及pSTAT3蛋白表达量均显著高于HPDE细胞,但胰腺癌细胞的表达量与其对吉西他滨耐药性及敏感性无明显相关.转染靶向STAT3的siRNA（siSTAT3）的BxPC3、MiaPaCa-2、PANC1、L3.6pl、CFPAC-1、MPanc-96细胞STAT3蛋白表达量分别为0.40±0.04、0.09±0.01、0.38±0.02、0.27 ±0.06、0.10±0.02、0.24±0.04,较转染阴性对照siRNA（siNC）细胞的表达量2.27±0.21、1.83 ±0.12、2.27±0.17、2.23±0.21、0.33±0.05、1.24±0.19均显著下降（P值均＜0.05）.但对细胞的增殖及凋亡无明显影响.STAT3基因沉默可以增加所有6株细胞对吉西他滨的敏感性,吉西他滨的杀伤效应增加了10％～15％.结论 STAT3表达水平同胰腺癌的化疗药物耐药性无明显相关性,沉默STAT3基因表达可增加细胞对吉西他滨耐治疗的敏感性.     

基质金属蛋白酶9反义寡核苷酸治疗人肺腺癌细胞裸鼠移植瘤的实验研究

目的 探讨以基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)为靶点反义基因治疗人 肺腺癌移植瘤的可行性.方法 常规体外培养A549细胞,采用皮下注射法建立移植瘤裸鼠动物模型.裸鼠成瘤后,随机分为4组.以脂质体(liposome,Lip)包裹的MMP-9反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)直接移植瘤内注射,观察肿瘤生长情况,计算抑瘤率和肿瘤生长指数,并观察对心、肝、肾组织有无毒副作用.结果 MMP-9 ASODN/Lip组肿瘤生长指数为3.20±0.14,明显低于其他三组(MMP-9 SODN/Lip组为5.93±0.20,Lip组为5.874±0.02,对照组为6.40±0.33)(P＜0.01);MMP-9 ASODN/Lip组的瘤重为(1.25±0.03)g,明显低于其他三组[MMP-9 SODN/Lip组为(2.15±0.07)g,Lip组为(2.31±0.04)g,对照组为(2.43±0.04)g](P＜0.01);MMP-9 ASODN/Lip组抑瘤率为(33.41±1.18)%,心、肝、肾组织结构基本正常.结论 MMP-9 ASODN可以抑制人肺腺癌移植瘤的生长,对心、肝、肾组织无明显不良反应;特异性靶向MMP-9 ASODN可能成为肺癌的辅助治疗方法.     

光动力疗法对胰腺癌移植瘤的疗效及其时-效关系

目的 探讨光动力疗法(PDT)对人胰腺癌裸鼠移植瘤的疗效及其时-效关系.方法 将人胰腺癌细胞SW1990皮下种植后形成的瘤块剪成1 mm3组织块再移植至36只裸鼠皮下,待皮下移植瘤直径达0.8～1 cm时按随机分组法分为3组:荷瘤对照组、光敏剂组(腹腔内注射Photosan 2 mg/kg体重)、光动力组(腹腔内注射Photosan 2 mg/kg体重,48 h后予激光照射),每组12只.每周2次测量肿瘤大小,3周后取瘤称瘤重,计算瘤体积及抑瘤率.结果 PDT组治疗后第6天瘤体积为(0.24±0.15)cm3,显著小于荷瘤对照组的(0.43±0.18)cm3和光敏剂组的(0.39±0.15)cm3(P＜0.05),并随着时间延长,差异更加显著.但治疗后15 d起,PDT组移植瘤体积又开始增大.治疗21 d后,PDT组瘤重为(0.69±0.23)g,显著小于荷瘤对照组的(1.65 ±0.21)g和光敏剂组的(1.62±0.12)g(P＜0.05).PDT组抑瘤率为58.18%,显著高于光敏剂组的1.80%(P＜0.05).结论 PDT对胰腺癌具有显著的抑制作用,起效快,但单用疗效维持时间不长.     

二甲双胍对人胰腺癌细胞株CFPAC-1增殖与凋亡的影响

目的观察二甲双胍对人胰腺癌细胞株CFPAC-1增殖、凋亡的影响,探讨其相关分子机制。方法应用1、2．5、5、10、20、40、60mmol／L二甲双胍处理人胰腺癌CFPAC-1细胞24、48、72h,以未处理的细胞作为对照组。采用CCK-8法检测细胞的增殖抑制率,流式细胞仪分析细胞周期,AnnexinV／PI双染法检测细胞凋亡,蛋白质印迹法检测磷酸化AMPK（p-AMPK）、FAS、cyclinD1、Bcl-xl、Bax、caspase-3、survivin蛋白的表达。结果二甲双胍呈浓度及时间依赖性抑制CFPAC-1细胞的增殖。40mmol／L二甲双胍处理细胞48h后,G0／G1细胞比例显著增多[（65．93±0.27）％比（42．89±1．02）％],G2／M期、s期细胞比例显著减少[（22．01±2．95）％比（38．28±4．93）％,（13．58±0．43）％比（20．12±3．38）％],差异均有统计学意义（P值均〈0．05）;细胞凋亡率从对照组的（3．01±0．49）％增加到（32．97±3．19）％（P〈0．05）;p-AMPK、Bax、caspase-3表达增强,FAS、cyclinD1、Bcl-xl、survivin表达减弱。结论二甲双胍可以显著抑制CFPAC-1细胞增殖,促进细胞凋亡,其机制可能通过激活AMPK信号通路,下调FAS、cyclinD1、survivin表达及Bcl-xl／Bax比值,上调caspase-3表达所致。     

RNA干扰DNA甲基转移酶1对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察以DNA甲基转移酶1(DNA methy transferas 1,DNMT1)基因为靶基因的RNA干扰对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖及凋亡的影响.方法 设计、合成针对DNMT1基因的siRNA和阴性对照siRNA(N-siRNA).实验分为空白对照组、脂质体组(仅予脂质体)、N-siRNA组(转染30 nmol N-siRNA)、siRNA组(转染30 nmol siRNA).siRNA转染48 h后,实时PCR法检测DNMT1 mRNA水平;WST-8法检测细胞增殖;流式细胞技术检测细胞凋亡.结果 siRNA组DNMT1 mRNA的抑制率为(86.0±4.3)%,明显高于N-siRNA组的(40.1±2.2)%和空白对照组的0(P＜0.01);细胞存活率为(47.6±5.6)%,明显低于N-siRNA组的(68.1±4.1)%和空白对照组的100%(P＜0.01);细胞凋亡率为(14.94±2.89)%,明显高于空白对照组的(7.51±1.12)%、脂质体组的(7.06±0.39)%、N-siRNA组的(8.84±1.44)%(均P＜0.01).结论 siRNA能特异、有效地抑制人胰腺癌PaTu8988细胞DNMT1mRNA的表达,同时抑制细胞增殖、促进细胞凋亡.