Hedgehog通路抑制剂逆转人胰腺癌SW1990细胞获得性耐药的实验研究

目的 探讨人胰腺癌SW1990耐药细胞株中Hedgehog通路成员(Shh、SMO、Gli1、ABCB1、ABCG2)表达的变化及应用Hedgehog信号通路抑制剂对其耐药性的影响.方法 建立人胰腺癌SW1990耐吉西他滨细胞株(SW1990/GZ).采用Hedgehog信号通路抑制剂环巴明作用耐药细胞,应用实时PCR、蛋白质印迹法检测用药前后细胞Shh、SMO、Gli1、ABCB1、ABCG2 mRNA和蛋白的表达及CD44+ CD24+、CD133+细胞亚群比例.以100 μmol/L吉西他滨作用环巴明处理后的SW1990/GZ细胞,应用Annexin V加PI双染法检测细胞凋亡率.结果 SW1990/GZ细胞中CD44+ CD24+细胞比例从亲代的(29.45±1.99)％增加到(93.16±2.46)％、CD133+细胞比例从(59.37±1.69)％增加到(95.88±1.47)％(P＜0.01);ABCB1、ABCG2、Shh、Gli1 mRNA的表达分别增加(274.90±31.44)、(3.48±0.33)、(12.07±1.71)、(4.15±0.42)倍(P＜0.01),并检测出SMO mRNA表达.蛋白表达结果与mRNA表达一致.2μmol/L环巴明作用SW1990/GZ细胞1周后,CD44+CD24+比例下降到(36.68±2.44)％、CD133+细胞比例下降到(62.76±1.28)％(P＜0.05).2、5μmol/L环巴明处理SW1990/GZ细胞后再用100 μmol/L吉西他滨处理细胞,细胞的凋亡加死亡率分别为(53.68±5.24)％和(69.99±3.16)％,显著高于对照组的(4.55±0.87)％(P＜0.01).结论 人胰腺癌SW1990耐药细胞株中高富集肿瘤干细胞,高表达Hedgehog信号通路成员SMO及Gli1.抑制耐药株的Hedgehog通路,可以降低其肿瘤干细胞比例,下调SMO及Gli1表达,部分恢复对吉西他滨的敏感性.     

阿司匹林对HT-29、SW480结肠癌细胞株CD133表达的影响

目的:观察阿司匹林对人结肠癌肿瘤干细胞标志物CD133表达的影响,探讨其对结肠癌干细胞的作用.方法:流式细胞仪检测结肠癌细胞株HT-29和SW480在不同浓度阿司匹林(0、2.5、5.0、10.0mmol/L)作用下CD133的表达变化.结果:流式细胞仪检测结果显示CD133+细胞在HT-29细胞株中的比例为88.37%±1.00%,在SW480细胞系中的比例为65.22%±1.50%.用阿司匹林干预后,随着阿司匹林浓度的增加,CD133在结肠癌细胞系HT-29和SW480中的表达呈下降趋势,差异有统计学意义(45.41±1.09,55.31±1.07vs73.45±1.04;28.28±0.30,42.27±0.78vs58.96±0.09,均P<0.05).结论:阿司匹林能抑制结肠癌细胞株HT-29和SW480中CD133的表达,呈剂量依赖性.     

阿霉素干预与肾上腺皮质癌干细胞标志物的表达

目的 探讨阿霉素(ADM)干预下人肾上腺皮质癌裸鼠模型干细胞标志CD133、ABCG2的表达及意义.方法 SW-13细胞系建立裸鼠皮下移植瘤模型,ADM体内干预后原代培养获得ADM组细胞株,未予干预直接原代培养获得对照组细胞株.用单细胞成克隆技术检测细胞的增殖能力,免疫组化法和流式细胞法检测肿瘤干细胞标志物CD133、ABCG2的表达.结果 ADM组细胞株的克隆形成率高于对照组(P＜0.05);流式细胞法和免疫组化法提示ABCG2在两组细胞中均有阳性表达,ADM组细胞株的流式细胞表达率高于对照组细胞株(P＜0.05);以上两种方法均表明CD133在两组中阴性表达.结论 ADM组细胞具有一定的肿瘤干细胞特征,ABCG2参与肾上腺皮质癌细胞耐药机制,可能为分子靶向治疗的潜在靶点.     

羟基喜树碱富集结肠肿瘤干细胞样群体的初步研究

背景:肿瘤干细胞是临床上肿瘤耐药的主要机制,识别并靶向肿瘤干细胞为肿瘤治疗的研究带来了新的思路。目的:探讨在体外以化疗药物富集结肠肿瘤干细胞样群体的可行性。方法:应用前期实验中以药物浓度递增诱导法建立的羟基喜树碱(HCPT)耐药人结肠癌细胞株SW1116/HCPT,免疫荧光标记干细胞表面抗原CD133,Hoechst33342/PI双染流式细胞仪检测、分选侧群(SP)细胞,实时PCR检测干细胞相关和多药耐药相关基因表达。结果:亲代细胞株SW1116中CD133阳性群体和SP群体分别仅占2%和1%,耐药细胞株SW1116/HCPT中则高达7%和61%,多药耐药基因MDR1抑制剂维拉帕米可使两组SP群体均下降至接近0水平。SW1116/HCPT细胞SP群体中干细胞相关基因CD133、Nanog和多药耐药相关基因MDR1、MRP1、MRP2、MRP6 mRNA表达水平较非SP群体显著上调(P0.05)。结论:HCPT药物浓度递增诱导法可成功富集结肠肿瘤干细胞样群体,其SP亚群中存在于细胞相关和多药耐药相关基因高表达。     

胃癌MKN-28肿瘤细胞系SP细胞亚群初步分析

目的:分析胃癌细胞株MKN-28中是否包含肿瘤干细胞相关的SP(side population)细胞亚群.方法:采用免疫荧光方法检测干细胞标记ABcG2在胃癌细胞株MKN-28的表达;制备MKN-28细胞悬液,经Hoechst33342染色,流式细胞仪分析SP亚群.结果:ABCG2在胃癌细胞系MKN-28中有少量表达,ABCG2阳性细胞约占1.7%.SP亚群占MKN-28细胞的0.25%,维拉帕米阻断后减少为0.05%.结论:人胃癌细胞株MKN-28中存在SP细胞亚群,提示胃癌干细胞的存在.     

EEF1A2基因对胰腺癌细胞生长和增殖的影响

目的 探讨EEF1 A2转基因对胰腺癌细胞SW1990生长和增殖的作用.方法 应用腺病毒载体将EEF1A2基因转染人胰腺癌细胞SW1990,采用MTT法检测细胞的增殖,软琼脂克隆形成试验检测细胞的生长,应用流式细胞仪检测细胞周期的变化.结果 带EEF1 A2的腺病毒感染SW1990细胞后,EEF1 A2 mRNA表达增加,72 h的A750值为1.2996±0.2091,培养6 d的细胞数为81250±1767,14 d的克隆形成率为82%,均较空载体腺病毒组和PBS组显著增加(P<0.05);G1期细胞比例为28.5%,S期细胞比例为60.9%,前者较空载体腺病毒组和PBS组显著减少,后者较空载体腺病毒组和PBS组显著增加(P<0.05).结论 EEF1 A2基因可以显著促进人胰腺癌细胞SW1990的生长和增殖.     

胰腺癌肿瘤干细胞的悬浮培养法

目的 建立无血清悬浮培养分离人胰腺癌细胞系PANC1干细胞球的方法.方法 采用无血清悬浮法培养PANC1细胞,显微镜下观察干细胞球形成率;流式细胞仪检测细胞CD133表达和细胞周期;以含10%FBS培养基诱导干细胞球细胞分化,荧光显微镜下观察细胞形态及CK18的表达;干细胞球细胞接种NOD/SCID小鼠皮下,观察其成瘤能力.结果 在无血清悬浮培养条件下存活的PANC1细胞形成干细胞球,体外连续传代培养20代始终保持4%0～5%0的干细胞球形成率.干细胞球细胞CD133表达率(5.91±0.7)%,G0/G1期细胞占(80.99±2.60)%,与原代PANC1细胞的(1.44±0.52)%和(69.01±5.03)%相差显著(P＜0.05).将于细胞球细胞置含血清培养基中培养.细胞逐渐恢复原代细胞形态,并表达上皮标志蛋白CK18,2×103的干细胞即在NOD/SCID小鼠皮下成瘤.结论 无血清悬浮法培养PANC1细胞可分离出肿瘤干细胞,其具有自我更新、多向分化和成瘤能力.     

放化疗抵抗的胰腺癌细胞中干细胞标志物的表达

目的 观察放化疗抵抗的胰腺癌细胞的Bcl-2、survivin及干细胞标志物Oct-4、ABCG2蛋白表达的变化,探讨这部分肿瘤细胞耐受放化疗的原因.方法 采用同步放化疗干预人胰腺癌细胞系SW1990、BxPC3、pc3、jr305,获得放化疗抵抗的胰腺癌细胞,以不行放化疗处理的细胞作为对照.采用Western blotting检测它们的Bcl-2、survivin、Oct-4和ABCG2蛋白的表达变化.结果 放化疗抵抗的SW1990、BxPC3、pc3、jt305胰腺癌细胞Bcl-2蛋白表达量分别为0.7955±0.0326、0.5718±0.0212、0.6137±0.0382和0.8733±0.0461;survivin蛋白表达量分别为0.8207±0.0490、0.6973±0.021 1、0.7967±0.0346和0.8013±0.0398;Oct-4蛋白表达量分别为0.8728±0.0177、0.7861±0.0139、0.4794±0.0932和0.4216±0.1043;ABCG2蛋白表达量分别为0.7810±0.1370、0.4957±0.1126、0.6102±0.1358和0.4670±0.1274.对照组相应细胞系的4种蛋白表达量分别为0.4723±0.018、0.2954±0.0103、0.3587±0.0201和0.2718±0.0136;0.4717±0.0274、0.3587±0.0113、0.3891±0.0147和0.3326±0.0124;0.6053±0.0142、0.4236±0.0086、0.2385±0.0671和0.1985±0.0582;0.3156±0.0582、0.2360±0.0423、0.2813±0.0512和0.1808±0.0370.放化疗后胰腺癌细胞的4种蛋白表达量均显著增加(P＜0.05).结论 放化疗抵抗的胰腺癌细胞中可能富含肿瘤干细胞.     

Galectin-3在人胰腺癌细胞株SW1990增殖浸润中的作用

目的 研究Galectin-3(GAL-3)在人胰腺癌细胞株SW1990增殖、浸润中的作用.方法 体外培养人胰腺癌细胞株SW1990和人胰腺星状细胞(PSC),收集细胞培养上清液.ELISA、RT-PCR和Western blot检测PSC和SW1990细胞GAL-3的表达.四唑氮蓝还原法(MTT)和流式细胞仪检测不同培养液对SW1990细胞和PSC的增殖的影响.体外侵袭试剂盒检测PSC上清液和GAL-3抗体对SW1990细胞浸润的影响.结果 SW1990细胞表达GAL-3,PSC培养上清能增强其GAL-3的表达.SW1990上清液通过GAL-3促进PSC增殖,不同的培养上清液影响PSC细胞的S期比例.PSC培养上清促进SW1990细胞的增殖和浸润,加入GAL-3单抗后,这种促进作用被部分抑制,不同的培养上清液影响SW1990细胞的S期和G2+M期的比例.结论 GAL-3参与SW1990的增殖和浸润.     

无血清悬浮法培养结肠癌HT29细胞系及肿瘤干细胞样亚群筛选

目的:研究无血清培养基悬浮培养人结肠癌细胞系HT29,筛选并鉴定HT29结肠癌细胞系中肿瘤干细胞相关亚群。方法:通过无血清培养基筛选结肠癌细胞系肿瘤干细胞相关亚群。应用克隆形成实验、表面标志检测、双苯酰亚胺(Hoechst)33342染色检测来确定培养细胞中肿瘤干细胞比例及其培养后的肿瘤干细胞含量变化。结果:结肠癌细胞系HT29中约50%的肿瘤细胞在无血清培养基中能够存活、增殖,形成自由飘浮的细胞球。细胞球可连续传代,若重新接种于含血清培养基中可重新贴壁分化,分化后细胞与培养储存的HT29细胞形态无明显差异。流式细胞仪检测表面标志,HT29细胞系中CD44+细胞含量为(44.18±2.18)%,而细胞球中CD44+细胞含量为(83.41±11.21)%;双苯酰亚胺33342染色检测提示HT29中侧群(sidepopulation,SP)细胞含量为(3.82±0.08)%,而细胞球中含量明显增高。结论:结肠癌细胞系HT29可在含生长因子的无血清培养基中悬浮生长,并维持细胞系。该细胞系中含有一定比例的具有增殖和自我更新能力的结肠癌干细胞样细胞亚群。表面标志以及双苯酰亚胺33342检测差异提示细胞球中仅部分细胞具有干细胞的功能。     

沙利度胺对人胰腺癌细胞株SW1990体外增殖及凋亡的影响

目的 观察沙利度胺(THD)体外抑制人胰腺癌细胞株SW1990增殖及诱导其凋亡的作用.方法 应用不同浓度的THD(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400μg/ml)处理胰腺癌SW1990细胞24、48、72 h,用MTT法测定细胞的生长抑制率,流式细胞仪分析细胞周期,Annexin V/PI检测细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测细胞Bcl-2、Bax蛋白的表达.结果 THD呈浓度和时间依赖性抑制胰腺癌细胞SW1990的生长.200μg/ml的THD干预使SW1990细胞G0/G1期比例从(41.15±2.23)％上升到(58.83 ±2.33)％;细胞凋亡率从2.6％增加到28.0％;细胞Bax蛋白表达量从0.17±0.03上调到0.33±0.04,Bcl-2蛋白表达量从0.35±0.02下调到0.17±0.01,Bcl-2/Bax比值从2.17±0.44下降到0.52±0.07.结论 THD可以抑制SW1990细胞增殖,其机制可能与上调Bax蛋白表达、下调Bcl-2蛋白表达,促进细胞凋亡,将细胞周期阻滞于G0/G1期有关.     

TMPRSS4基因沉默对胰腺癌SW1990细胞生长及侵袭的影响

目的 观察TMPRSS4基因沉默对人胰腺癌SW1990细胞体外生长增殖和侵袭的影响.方法 体外合成4个靶向TMPRSS4基因和阴性对照的真核表达载体,瞬时转染到SW1990细胞,实时定量PCR法检测转染细胞的TMPRSS4 mRNA表达.以干扰效率最高的真核表达载体转染SW1990细胞,G418筛选出稳定的TMPRSS4基因沉默的细胞株,蛋白质印迹法检测稳定细胞株TMPRSS4蛋白抑制效率,CCK-8法检测细胞生长抑制率,Transwell小室检测细胞侵袭能力.结果 成功构建了稳定下调TMPRSS4表达的细胞株SW1990/psi-TMPRSS4,细胞转染效率为82.9%.与亲本SW1990细胞比较,TMPRSS4 mRNA和蛋白水平分别下调了80.1%、60%.SW1990/psi-TMPRSS4组穿膜细胞数为(118.6±13.4)个,显著低于阴性对照组的(157.4±12.9)个和亲本细胞组的(157.0±9.5)个(P值均<0.01).SW1990/psi-TMPRSS4组细胞的侵袭抑制率为24.5%.但各组细胞增殖无明显变化.结论 成功筛选出稳定下调TMPRSS4表达的细胞株.下调TMPRSS4表达能有效抑制胰腺癌SW1990细胞的侵袭能力,但对细胞增殖无影响.     

5-氟尿嘧啶作用人肝癌细胞系SMMC-7721后残存细胞中肿瘤干细胞比例增加

目的主要探讨5-氟尿嘧啶(5-FU)作用肝癌细胞系SMMC-7721后残余细胞中NCAM/CD56、ICAM-1/CD54、EpCAM、CD133及ABCG2阳性细胞表达率的变化。方法检测不同浓度5-FU作用于SMMC-7721细胞系前后细胞增殖能力的变化,流式细胞仪检测残存细胞的细胞周期分布以及5种表面标志物阳性细胞表达率的变化。结果不同浓度5-FU均可抑制SMMC-7721增殖。使用10μg/mL的5-FU浓度作用48 h进一步研究,SMMC-7721细胞周期各期细胞比例均较对照组有影响,且G0/G1、S和G2/M期5-FU作用前后差异有统计学意义(P<0.05),G0/G1期阻滞明显。5-FU处理使SMMC-7721 5种细胞表面标志物阳性细胞比例均明显升高,差异均具有统计学意义(P<0.05),阳性细胞比例均明显升高。结论上述实验提示肝癌干细胞逃避5-FU单药物的杀伤可能是临床上肝癌化疗失败和肿瘤复发的重要原因,同时,此实验方法可以作为肝癌干细胞富集的科研模型。     

Persistence of side population cells with high drug efflux capacity in pancreatic cancer

AIM： To investigate the persistence of side population （SP） cells in pancreatic cancer and their role and mechanism in the drug resistance. METHODS： The presentation of side population cells in pancreatic cancer cell line PANC-1 and its proportion change when cultured with Gemcitabine, was detected by Hoechst 33342 staining and FACS analysis. The expression of ABCB1 and ABCG2 was detected by real- time PCR in either SP cells or non-SP cells. RESULTS： SP cells do exist in PANC-1, with a median of 3.3% and a range of 2.1-8.7%. After cultured with Gemcitabine for 3 d, the proportion of SP cells increased significantly （3.8% ± 1.9%, 10.7% ± 3.7%, t = 4.616, P = 0.001 〈 0.05）. ABCB1 and ABCG2 expressed at higher concentrations in SP as compared with non-SP cells （ABCB1： 1.15 ± 0.72, 5.82 ± 1.16, t = 10.839, P = 0.000 〈 0.05; ABCG2： 1.16 ± 0.75, 5.48 ± 0.94, t = 11.305, P = 0.000 〈 0.05）, which may contribute to the efflux of fluorescent staining and drug resistance. CONCLUSION： SP cells with inherently high resistance to chemotherapeutic agents do exist in pancreatic cancers, which may be candidate cancer stem cells contributing to the relapse of the tumor.     

Detection of tumor stem cell markers in pancreatic carcinoma cell lines

IntroductionT he cell population of most tumors is hetero- geneous with regard to its proliferation capacity, apoptosis-resistance mechanisms, and ability to reconstitute the tumor upon xeno-transplantation. This phenomenon arises as the result of accumulation of multiple genetic and epigenetic changes. Current evidence suggests that only a few cells within the tumor, the cancer stem cells, possess unlimited proliferative capacity and give rise to tumors that phenotypically resemble their init…     

侧群细胞在胃癌细胞株中的分布及其致瘤特性

目的 研究侧群细胞的致瘤特性及其在胃癌细胞株和胃癌组织中的分布.方法 用荧光激活细胞分选法分析SGC-7901、MKN28和BGC-823三种胃癌细胞株中的侧群细胞.取36只裸鼠,分为6组,将SOC-7901分离出的侧群细胞和非侧群细胞分别以每只500、5000、50 000的数量接种到裸鼠皮下,8周后观察成瘤情况.实时定量PCR检测胃癌组织和胃癌细胞株中三磷酸腺苷结合转运蛋白超家族成员G2(ABCG2)mRNA的表达,免疫组化法检测胃癌组织中ABCG2蛋白的表达.结果 SGC-7901细胞株中侧群细胞比例为1.0%,BGC-823为1.3%,MKN28则为阴性.从SGC-7901中分离的侧群细胞最少可成瘤细胞数是500/只,非侧群细胞为50000/只.胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823的ABCG2 mRNA相对量高于MKN28(分别为0.162、0.096和0.005).ABCG2 mRNA和蛋白在胃癌和胃炎组织中有不同程度的表达.结论 胃癌细胞株侧群细胞的致瘤能力明显强于非侧群细胞.在胃癌组织和部分胃炎组织中检测到ABCG2的表达,在胃癌细胞株中侧群细胞比例高的细胞株ABCG2表达高.     

褪黑素对胰腺癌细胞株SW1990体外增殖及凋亡的影响

目的 探讨褪黑素(MT)体外抑制胰腺癌细胞株SW1990增殖及诱导其凋亡的作用.方法 以不同浓度的MT(0.1、0.5、1.0、2.5及5.0 mmol/L)处理体外培养的胰腺癌细胞株SW1990细胞24、48、72 h.用MTT法测定细胞增殖,以Annexin V/PI检测细胞凋亡,流式细胞仪分析细胞周期及Western blotting检测细胞Bcl-2、Bax蛋白表达.结果 MT呈浓度和时间依赖性抑制SW1990细胞的增殖.0.1～5.0 mmol/L MT作用48 h后,细胞的增殖抑制率为7.4%～85.8%.1.0～5.0 mmoL/L MT作用48 h后,G0/G1期比例为72.6%～85.3%,细胞凋亡率为21.5%～41.7%,同时Bcl-2蛋白表达下调,Bcl-2/Bax比值下降.结论 MT可以抑制SW1990细胞增殖,其机制可能与上调Bax表达,下调Bcl-2表达,促进细胞凋亡,将细胞周期阻止于G0/G1期有关.