人类真核延伸因子1A2对胰腺癌细胞侵袭、转移能力的影响

目的 探讨外源性人类真核延伸因子(EEF)1A2基因导入人胰腺癌SW1990细胞株后.细胞侵袭转移能力的改变.方法 应用腺病毒载体将EEF1A2基因导入人胰腺癌SW1990细胞中,采用划痕实验、Transwell小室、细胞粘附实验检测转染前后细胞运动、侵袭、转移及粘附能力的改变.结果 Ad5/F35-EEF1A2转染后继续培养48 h的SW1990细胞,可见预期大小的特异性条带.实验组24 h后细胞迁移率为(74.43±2.12)%,与阴性对照组和空白对照组比较差异有统计学意义[(44.08±5.92)%和(48.09±3.54)%,P＜0.05].实验组48 h后穿膜细胞数为(65.42±8.24)个,与阴性对照组和空白对照组相比差异有统计学意义[(20.10±5.82)个和(23.25±5.23)个,P＜0.05].实验组48 h后穿膜细胞数为(61.30±5.68)个,与阴性对照组和空白对照组相比差异有统计学意义[(32.04±3.60)个和(32.33±2.51)个,P＜0.05],且对Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型胶原、纤维结合蛋白、粘蛋白的粘附力增强(P＜0.05).结论 腺病毒介导的EEF1A2高表达能明显增强胰腺癌SW1990细胞的运动、侵袭、转移及粘附能力.提示EEF1A2可能通过改变胰腺癌细胞的生物学特性影响胰腺癌的发生发展.     

真核翻译延长因子1A2对人胰腺癌裸鼠移植瘤生长和血管形成作用的研究

人类真核翻译延伸因子1A2（EEF1A2）是一种管家基因，可能作为一种新的潜在癌基因。参与肿瘤的发生、发展。目的：探讨EEFIA2对人胰腺癌裸鼠移植瘤生长和血管形成的作用。方法：以聚合酶链反应（PCR）扩增目的基因片段，应用基因重组技术构建Ad5／F35。EEF1A2重组腺病毒载体。15只裸鼠建立人胰腺癌移植瘤模型．随机分为对照组、绿色荧光蛋白（GFP）组和EEF1A2组，分别注射PBS0．1ml、Ad5／F35-GFP0．1ml（1×10^8PFU）和Ad5／F35-EEF1A20．1ml（1×10^8 PFU）。测定各组肿瘤体积和质量，应用免疫组化方法检测各组增殖细胞核抗原（PCNA）和CD31的表达。结果：成功构建了表达EEF1A2的重组腺病毒载体。与对照组和GFP组相比，EEF1A2组裸鼠肿瘤体积和质量显著增加（P〈O．05），PCNA和CD31表达显著增高（P〈O．05）。结论：EEF1A2可显著促进人胰腺癌裸鼠移植瘤生长，细胞增殖和肿瘤血管形成可能是其重要作用机制。     

PUMA基因转染对胰腺癌细胞生长的影响

目的探讨PUMA基因转染抑制胰腺肿瘤生长的体内外效果。方法利用脂质体转染法将表达PUMA的质粒转染导入胰腺癌细胞株PC-3中,G418筛选出阳性克隆,Western和RT-PCR法检测PUMA转染后PC-3PUMA的表达,流式细胞仪检测转染后细胞凋亡率;分别将转染PUMA的PC-3细胞(实验组)和未转染的PC-3细胞移植到裸鼠体内,比较裸鼠移植肿瘤的大小和重量以及PUMA表达。结果PUMA表达质粒转染的PC-3细胞(PC-3/PUMA)稳定表达PUMA,其细胞凋亡率为(5.50±0.90)%,明显高于未转染组的(1.073±0.248)%和空载体转染组的(1.08±0.35)%(P<0.05);裸鼠接种4周后PC-3/PUMA细胞成瘤率为70%,PC-3细胞和空载体PC-3细胞成瘤率为100%(P>0.05),PC-3/PUMA细胞形成的肿瘤体积比PC-3细胞和空载体PC-3细胞明显减小(P<0.05),并且形成的肿瘤组织中PUMA高表达。结论胰腺癌细胞中缺失PUMA基因表达,PUMA转染胰腺癌细胞后表达PUMA,并能促进细胞凋亡。     

S100A6基因沉默对胰腺癌细胞侵袭的影响

目的 探讨S100A6基因沉默对胰腺癌细胞侵袭的影响和可能机制。方法 将不同浓度(3.125、6.25、12.5 nmol/L)的靶向S100A6的小干扰RNA( S100A6-siRNA)转染人胰腺癌BxPC3细胞,分别采用荧光实时定量PCR和蛋白质印迹法检测S100A6 mRNA和蛋白的表达,采用Transwell小室检测癌细胞侵袭能力,明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)活性。结果 S100A6-siRNA转染组细胞的S100A6 mRNA和蛋白表达呈浓度、时间依赖性明显下调,穿膜细胞数呈浓度依赖性明显减少。12.5 nmol/L的S100A6-siRNA转染组细胞转染后48 h的S100A6 mRNA表达从对照组的(100±0.3)％降到(15.3±0.2)％(P＜0.01);S100A6蛋白的表达从(83.2±0.18)％降到(13.5±0.12)％(P＜0.01);穿膜细胞数从(44.5±2.2)个降到(7.6±1.5)个(P＜0.05)。同时,S100A6-siRNA转染组细胞的MMP-9活性明显下调。结论 抑制S100A6基因表达可抑制胰腺癌细胞侵袭转移,其机制可能与下调MMP-9活性有关。     

PUMA基因转染对胰腺癌细胞生长的影响

目的 探讨PUMA基因转染抑制胰腺肿瘤生长的体内外效果.方法 利用脂质体转染法将表达PUMA的质粒转染导入胰腺癌细胞株PC-3中,G418筛选出阳性克隆,Western和RT-PCR法检测PUMA转染后PC-3 PUMA的表达,流式细胞仪检测转染后细胞凋亡率;分别将转染PUMA的PC-3细胞(实验组)和未转染的PC-3细胞移植到裸鼠体内,比较裸鼠移植肿瘤的大小和重量以及PUMA表达.结果 PUMA表达质粒转染的PC-3细胞(PC-3/PUMA)稳定表达PUMA,其细胞凋亡率为(5.50 ± 0.90)%,明显高于未转染组的(1.073 ± 0.248)%和空载体转染组的(1.08 ± 0.35)%(P ＜0.05);裸鼠接种4周后PC-3/PUMA细胞成瘤率为70%,PC-3细胞和空载体PC-3细胞成瘤率为100%(P ＞ 0.05),PC-3/PUMA细胞形成的肿瘤体积比PC-3细胞和空载体PC-3细胞明显减小(P ＜0.05),并且形成的肿瘤组织中PUMA高表达.结论 胰腺癌细胞中缺失PUMA基因表达,PUMA转染胰腺癌细胞后表达PUMA,并能促进细胞凋亡.     

靶向封闭EEF1A2对胰腺癌细胞凋亡的作用及其机制研究

目的 观察靶向封闭EEF1A2基因对胰腺癌细胞株凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 体外转录制备2对EEF1A2 siRNA,应用脂质体技术转染胰腺癌细胞株BxPC-3,半定量RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染前后EEF1A2基因表达的变化.运用膜联蛋白V/碘化丙啶法检测细胞凋亡率;蛋白质印迹法检测细胞中caspase-3、caspase-8、caspase-9、聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)细胞色素C和Bid等凋亡相关蛋白表达变化.结果 2对EEF1A2 siRNA均能有效降低BxPC-3细胞中EEF1A2的表达,其中第2对siRNA静默效果更佳,EEF1A2在mRNA和蛋白质水平的表达抑制率均达75%左右.抑制BxPC-3细胞中EEF1A2的表达后,细胞的早期凋亡率为15.28%±3.65%,显著高于阴性对照组的10.11%±3.05%和空白组的9.41%±4.14%,同时伴随出现caspase-3、caspase-8、caspase-9、PARP和Bid的蛋白活化增强和细胞色素C表达增加.结论 抑制EEF1A2表达能明显诱导胰腺癌细胞BxPC-3的凋亡,而死亡受体途径和线粒体途径的激活可能均参与凋亡的发生.     

沉默SIRT1基因表达对胰腺癌细胞PANC1增殖和凋亡的影响

目的 应用RNA干扰技术沉默胰腺癌PANC1细胞的SIRT1基因表达,观察其对细胞增殖和凋亡的影响.方法 构建靶向SIRT1基因表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒pGC-shRNA,转染胰腺癌细胞PANC1.设对照shRNA(shRNA-C)转染组和未转染对照组.实时定量PCR和免疫细胞化学法检测转染后细胞SIRT1 mRNA及蛋白的表达;MTT法检测细胞的增殖率;ELASA法检测细胞caspase-3和caspase-9活性;Western bloting检测细胞Bax、Bcl-2蛋白表达.结果 与未转染组相比,shRNA组转染后48 h,PANC1细胞SIRT1 mRNA及蛋白表达的抑制率分别为(76.2%±10.4)%和(80.1±11.6)%;细胞增殖抑制率为(45.1±6.5)%;caspase-3和caspase-9酶活性显著增高;Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调.结论 应用RNA干扰技术能有效沉默PANC1细胞SIRT1基因的表达,其机制可能与caspasa酶活性升高及Bax表达上调、Bcl-2表达下调有关.     

TFPI-2基因对胰腺癌Panc-1细胞增殖和侵袭能力的影响

目的探讨外源性人组织因子途径抑制物（TFPI）-2基因表达对胰腺癌Panc-1细胞增殖和侵袭转移能力的影响。方法将人TFPI-2基因转染胰腺癌Panc-1细胞。用RT-PCR、Western blot技术检测目的基因的表达,用细胞生长试验、流式细胞仪分析技术以及Boyden小室法检测Panc-1细胞转染前后细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和细胞体外侵袭能力的变化。结果TFPI-2基因能在Panc-1细胞中稳定表达;与对照组相比,转染后的Panc-1细胞生长受到抑制,阻滞于G0-G1期,早期细胞凋亡率增加,细胞体外侵袭能力受到抑制。结论TFPI-2基因表达能够在体外抑制胰腺癌细胞系Panc-1的细胞增殖,降低其体外侵袭转移能力。     

节律基因Bmal1对胃癌细胞BGC-823增殖及凋亡的影响

目的 探讨节律基因Bmal1对胃癌细胞BGC-823增殖及凋亡的影响.方法 构建针对Bmal1序列的shRNA,用脂质体介导转染入胃癌细胞BGC-823,G418筛选稳定细胞株(转染组),同时设对照组(空白组).用克隆形成率检测细胞生长,用流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,RT-PCR及Western blot法检测相关基因及蛋白表达.结果 转染组克隆形成率低于对照组(P＜0.05).与对照组比较,转染组Bmal1总凋亡率升高(P＜0.05),其细胞周期再分布出现G1期缩短(P＜0.05),G2期延长(P＜0.05),同时发现Bcl-2 mRNA表达下调(P＜0.05),c-Myc mRNA表达上调(P＜0.05).结论 Bmal1可以抑制胃癌细胞BGC-823增殖,促进细胞凋亡,有可能成为诱导胃癌细胞凋亡的新靶点.     

E1A基因对人肺腺癌细胞增殖和细胞周期的影响

目的 探讨E1A基因对人肺腺癌细胞增殖的抑制作用与细胞周期的关系及作用机制。方法 利用细胞增殖曲线和裸小鼠体内致瘤性实验研究E1A基因对人肺腺癌细胞增殖的影响,采用流式细胞术分析人肺腺癌细胞周期,以蛋白印迹方法分析P16、P21、P53和cyclin B1水平变化。结果 转染E1A基因后,人肺腺癌细胞（Anip973-E1A）生长缓慢,体内致瘤性降低。Anip973-E1A细胞周期出现明显的S期抑制和G2/M阻滞,周期调控蛋白P16、P21、P53水平无明显变化,但cyclin B1表达明显下降。结论 E1A基因能显著抑制人肺腺癌细胞的体内外增殖,降低周期蛋白cyclin B1的表达,使细胞周期阻滞于G2/M,这可能与A1A基因抑制作用有关。     

miR-101在胰腺癌组织中的表达以及对胰腺癌细胞ASPC-1增殖的影响

目的 观察miR-101在胰腺癌组织中的表达,探讨其对胰腺癌细胞增殖的影响.方法 采用实时定量PCR方法 检测miR-101在胰腺癌组织、癌旁组织和胰腺癌细胞株ASPC-1中的表达.通过基因重组技术构建miR-101的表达载体peGFPc1-miR-101,应用脂质体将其转染到ASPC-1细胞,荧光显微镜检测转染效率;实时定量PCR检测转染细胞miR-101的表达水平,以癌旁正常胰腺组织为1,折算成相对倍数;MTT法检测转染细胞的增殖率.利用在线软件targetScan预测miRNA可能的靶基因.结果 miR-101在胰腺癌组织和胰腺癌细胞株ASPC-1中相对表达量分别为55%和39%,较癌旁正常胰腺组织显著降低(P＜0.01).peGFPc1-miR-101转染ASPC-1细胞后,miR-101表达增加,为对照组的19.8倍(P＜0.01),癌细胞增殖率明显降低,最低仅为原代细胞的26%(P＜0.01).EZH2基因是miR-101影响胰腺癌细胞增殖活力的可能靶基因.结论胰腺癌组织miR-101低表达,它可能通过抑制EZH2的表达调控细胞的增殖.     

γ-氨基丁酸对胰腺癌细胞增殖及转移作用的实验研究

目的 观察γ-氨基丁酸(GABA)对胰腺癌SW1990细胞增殖、细胞周期及基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9表达的影响.方法 应用不同浓度(0～320 μmol/L)GABA干预SW1990细胞,采用MTT法和流式细胞仪检测细胞增殖和细胞周期.RT-PCR检测细胞MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表达,Western blot检测MMP-2和MMP-9蛋白表达.结果 GABA促进胰腺癌SW1990细胞的生长,使G0/G1细胞减少,S期和G2/M细胞增多.320μmol/L的GABA干预细胞后的A570值为1.11±0.03,较无GABA干预组的0.56±0.01显著增加(P<0.01);G0/G1细胞为(46.18±1.12)%,较无GABA干预组的(87.29±1.34)%显著减少(P<0.01);MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA及蛋白表达分别为8.6、6.8、10.5、8.4,较0～40μmol/L组显著增加(P<0.05).结论 GABA能促进SW1990细胞增殖和MMPs的表达.     

褪黑素对胰腺癌细胞株SW1990体外增殖及凋亡的影响

目的 探讨褪黑素(MT)体外抑制胰腺癌细胞株SW1990增殖及诱导其凋亡的作用.方法 以不同浓度的MT(0.1、0.5、1.0、2.5及5.0 mmol/L)处理体外培养的胰腺癌细胞株SW1990细胞24、48、72 h.用MTT法测定细胞增殖,以Annexin V/PI检测细胞凋亡,流式细胞仪分析细胞周期及Western blotting检测细胞Bcl-2、Bax蛋白表达.结果 MT呈浓度和时间依赖性抑制SW1990细胞的增殖.0.1～5.0 mmol/L MT作用48 h后,细胞的增殖抑制率为7.4%～85.8%.1.0～5.0 mmoL/L MT作用48 h后,G0/G1期比例为72.6%～85.3%,细胞凋亡率为21.5%～41.7%,同时Bcl-2蛋白表达下调,Bcl-2/Bax比值下降.结论 MT可以抑制SW1990细胞增殖,其机制可能与上调Bax表达,下调Bcl-2表达,促进细胞凋亡,将细胞周期阻止于G0/G1期有关.     

沙利度胺对人胰腺癌细胞株SW1990体外增殖及凋亡的影响

目的 观察沙利度胺(THD)体外抑制人胰腺癌细胞株SW1990增殖及诱导其凋亡的作用.方法 应用不同浓度的THD(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400μg/ml)处理胰腺癌SW1990细胞24、48、72 h,用MTT法测定细胞的生长抑制率,流式细胞仪分析细胞周期,Annexin V/PI检测细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测细胞Bcl-2、Bax蛋白的表达.结果 THD呈浓度和时间依赖性抑制胰腺癌细胞SW1990的生长.200μg/ml的THD干预使SW1990细胞G0/G1期比例从(41.15±2.23)％上升到(58.83 ±2.33)％;细胞凋亡率从2.6％增加到28.0％;细胞Bax蛋白表达量从0.17±0.03上调到0.33±0.04,Bcl-2蛋白表达量从0.35±0.02下调到0.17±0.01,Bcl-2/Bax比值从2.17±0.44下降到0.52±0.07.结论 THD可以抑制SW1990细胞增殖,其机制可能与上调Bax蛋白表达、下调Bcl-2蛋白表达,促进细胞凋亡,将细胞周期阻滞于G0/G1期有关.     

二甲双胍对人胰腺癌细胞株CFPAC-1增殖与凋亡的影响

目的观察二甲双胍对人胰腺癌细胞株CFPAC-1增殖、凋亡的影响,探讨其相关分子机制。方法应用1、2．5、5、10、20、40、60mmol／L二甲双胍处理人胰腺癌CFPAC-1细胞24、48、72h,以未处理的细胞作为对照组。采用CCK-8法检测细胞的增殖抑制率,流式细胞仪分析细胞周期,AnnexinV／PI双染法检测细胞凋亡,蛋白质印迹法检测磷酸化AMPK（p-AMPK）、FAS、cyclinD1、Bcl-xl、Bax、caspase-3、survivin蛋白的表达。结果二甲双胍呈浓度及时间依赖性抑制CFPAC-1细胞的增殖。40mmol／L二甲双胍处理细胞48h后,G0／G1细胞比例显著增多[（65．93±0.27）％比（42．89±1．02）％],G2／M期、s期细胞比例显著减少[（22．01±2．95）％比（38．28±4．93）％,（13．58±0．43）％比（20．12±3．38）％],差异均有统计学意义（P值均〈0．05）;细胞凋亡率从对照组的（3．01±0．49）％增加到（32．97±3．19）％（P〈0．05）;p-AMPK、Bax、caspase-3表达增强,FAS、cyclinD1、Bcl-xl、survivin表达减弱。结论二甲双胍可以显著抑制CFPAC-1细胞增殖,促进细胞凋亡,其机制可能通过激活AMPK信号通路,下调FAS、cyclinD1、survivin表达及Bcl-xl／Bax比值,上调caspase-3表达所致。     

曲古菌素A对人胃癌细胞增殖和细胞周期的作用

目的 观察曲古菌素A(TSA)对人胃癌细胞株SGC-7901细胞增殖及细胞周期的影响,探讨其可能的机制.方法 TSA干预人胃癌SGC-7901细胞24 h后.采用四甲基偶氮唑盐法检测其对细胞增殖的影响,流式细胞技术检测细胞周期,实时PCR检测细胞周期素D1和p21 mRNA的表达情况.结果 经TSA干预24 h后,人胃癌SGC-7901细胞增殖受抑制,TSA 0.1、0.5和2.0μmol/L组抑制率分别为3.52%±6.11%、13.29%±4.13%和14.24%±2.80%;同时TSA 0.5μmol/L组(71.26%±0.51%)和TSA 2.0μmol/L组(71.03%±0.12%)的G0/Gl期细胞比例明显高于对照组(51.12%±1.17%);TSA 0.5μmol/L组(13.55%±0.44%)和TSA 2.0 μmol/L组(10.63%±0.63%)的S期细胞比例明显低于对照组(34.60%±0.60%).出现G0/G1细胞周期阻滞.TSA干预后细胞周期相关基因细胞周期素D1 mRNA表达下调和p21 mRNA表达上调.结论 TSA通过调控细胞周期相关基因细胞周期素D1和p21的表达,抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖,引起G0/G1期细胞周期阻滞,最终影响肿瘤细胞的生长.     

缺氧对胰腺癌PANC1细胞增殖、凋亡及迁移的影响

目的 探讨氯化钴( CoCl2)模拟缺氧对人胰腺癌细胞株PANC1增殖、凋亡和迁移的影响.方法 分别用终浓度为0(对照)、100、200、400、800 μmol/L CoCl2处理PANC1细胞24h,采用实时定量PCR、蛋白质印迹法分别检测细胞缺氧诱导因子(HIF)-1α、血管内皮生长因子(VEGF) mRNA及蛋白的表达,采用CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,细胞划痕试验检测细胞迁移能力.结果 对照组及100、200、400、800 μmol/L CoCl2处理组HIF-1α mRNA表达量分别为1、1.08±0.12、1.12±0.09、1.04±0.11、0.66±0.07;VEGF mRNA表达量分别为1、2.69±0.35、4.81±0.54、2.19 ±0.21、0.79±0.08;HIF-1α蛋白表达量为0.23±0.03、0.36±0.04、1.15±0.11、1.08±0.09、0.44±0.04;VEGF蛋白表达量为0.14±0.02、0.12±0.01、0.95±0.09、0.87±0.09、0.55±0.06;细胞存活率分别为100％、(98.43±2.88)％、(76.15±0.70)％、(53.87±0.77)％、(35.23±0.67)％;细胞凋亡率分别为(5.2±1.12)％、(5.74±1.07)％、(6.82±1.85)％、(12.09±3.53)％、(31.88±6.95)％;细胞爬行距离分别为(43.24±3.67)％、(59.46±5.39)％、(80.56±8.05)％、(63.89±5.96)％、(9.09±1.59)％.与对照组相比较,处理组细胞VEGF mRNA、VEGF及HIF-1α蛋白表达、细胞爬行距离均呈先上升后下降的趋势(P＜0.05),HIF-1αmRNA表达、细胞增殖率呈剂量依赖性降低,细胞凋亡率呈剂量依赖性升高.结论 CoCl2达到一定浓度时可显著抑制PANC1细胞增殖,促进细胞凋亡;CoCl2对PANC1细胞迁移效应的双向作用与高浓度CoCl2对细胞直接损伤有关.     

RNA干扰DNA甲基转移酶1对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察以DNA甲基转移酶1(DNA methy transferas 1,DNMT1)基因为靶基因的RNA干扰对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖及凋亡的影响.方法 设计、合成针对DNMT1基因的siRNA和阴性对照siRNA(N-siRNA).实验分为空白对照组、脂质体组(仅予脂质体)、N-siRNA组(转染30 nmol N-siRNA)、siRNA组(转染30 nmol siRNA).siRNA转染48 h后,实时PCR法检测DNMT1 mRNA水平;WST-8法检测细胞增殖;流式细胞技术检测细胞凋亡.结果 siRNA组DNMT1 mRNA的抑制率为(86.0±4.3)%,明显高于N-siRNA组的(40.1±2.2)%和空白对照组的0(P＜0.01);细胞存活率为(47.6±5.6)%,明显低于N-siRNA组的(68.1±4.1)%和空白对照组的100%(P＜0.01);细胞凋亡率为(14.94±2.89)%,明显高于空白对照组的(7.51±1.12)%、脂质体组的(7.06±0.39)%、N-siRNA组的(8.84±1.44)%(均P＜0.01).结论 siRNA能特异、有效地抑制人胰腺癌PaTu8988细胞DNMT1mRNA的表达,同时抑制细胞增殖、促进细胞凋亡.