乙型肝炎病毒核心启动子缺失变异对病毒抗原表达的影响

目的：为研究乙型肝炎病毒（HBV）核心启动子（CP）20／21bp部分缺失（nt1748/1747至nt1767)及同时存在的A1896点变异对病毒抗原表达的影响。方法：利用前期构建的HBV全基因的重组载体转染HepG2细胞后,对病毒抗原进行ELISA检测及Western-blotting分析。结果：变异株分泌到细胞外的HBsAg,HBeAg及细胞内的HBcAg表达量较野毒株均明显减少。结论：HBV CP20／21bp部分缺失株及同时存在的A1896点变异株的病毒抗原表达较野毒株显著下降。     

HBV核心启动子部分缺失重组质粒的构建

目的：构建乙型肝炎病毒（HBV）核心启动子（CP）部分失的真核表达质粒。方法：利用线性化的,从CP上游顺序列始且含完整转录单元的HBV基因克隆（P3．8I质粒）为工具,采用分子克隆,人工定点突变,PCR－PFLP鉴定和测序分析等技术构建目载体。结果：成功构建了HBV全基因CP20／21个bp缺失（nt1748/1747-1767)和CP20／21个bp缺失＋1896热点变异的重组真核质粒表达质粒,并经PCR－RFLP序列分析证实。结论：此重组真核表达质粒构建可为体外进一步研究上述变异的生物学意义奠定基础。     

乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变及其临床意义

目的探讨利用基因芯片技术检测乙型肝炎病毒(HBV)前C区/BCP区基因突变方法的临床价值及前C区/BCP区基因突变的临床意义。方法应用基因芯片技术检测95例慢性乙型肝炎患者的HBV前C区G1896A(nt1896G→A)、A1814C(nt1814A→C)及HBV C基因启动子(BCP)T1762A、G1764A(nt1762A→T、nt1764G→A)四位点突变,同时检测血清HBV DNA含量及ALT、AST水平。结果95份血清标本中,有91份分别检测到了HBV前C区/BCP区基因突变,阳性率95.8%,其中61896A突变33例(36.3%),A1762T G1764A联合突变64例(70.3%),G1896A A1762T G1764A联合突变22例(24.2%),未检测到A1814C突变毒株。抗-HBe阳性的慢性乙肝患者HBV前C区/BCP区突变率较HBeAg阳性的患者明显增高。G1896A突变后血清ALT水平与未变异组比较有显著性差异(P<0.05),而其他各组的肝功能无显著变化。G1896A A1762T G1764A联合突变后,血清HBV DNA水平较未变异组降低(P<0.05),其他各组间则无显著变化。结论应用基因芯片法测定HBV特定变异位点,可一次同时检测多个突变位点,具有一定的临床应用价值。HBV前C区/BCP区突变对血清HBVDNA水平和肝功能有一定的影响。     

乙型肝炎病毒前C区变异对HepG2细胞HLA-Ⅰ表达的影响

目的 :研究乙型肝炎病毒 (HBV)前C区热点变异对宿主细胞HLA Ⅰ分子表达的影响 .方法 :构建HBV前C区野毒株及A83,A83/A86变异株真核表达质粒 ,转染HepG2细胞 ,鉴定目的基因在宿主细胞中的生物活性 ,流式细胞术检测HLA Ⅰ分子的表达 .结果 :PCR和ELISA法分析能检测到目的DNA片段和HBeAg ,转染细胞表达HLA Ⅰ分子的平均荧光强度不同 ,野毒株为 1.3,前C区变异后平均荧光强度增加 ,尤以A83变异表达增强显著 (17.6 ) ,A83/A86为 7.3.结论 :前C区热点变异后宿主细胞HLA Ⅰ分子的表达为上调乙型肝炎病毒前C区变异对HepG2细胞HLA…     

慢性HBV感染患者bcp/pc区点突变模式、pres区缺失及其临床意义

目的阐明HBV(hepatitis B virus,HBV)感染患者不同临床阶段bcp/pc(basic core promoter,BCP/precore,PC)点突变模式及pres区缺失突变规律,并探讨其临床意义。方法慢性HBV感染患者180例,其中,无症状HBV携带者13例,慢性乙型肝炎者75例,HBV相关肝硬化及肝癌分别为62、30例。Qiagen法提取血清HBV-DNA,常规PCR扩增目的基因,纯化PCR产物ABI377DNA自动测序仪直接双向测序。直接测序失败者,回收目的 DNA与PMD-18T载体连接,克隆质粒双向测序。DNAStar软件包的SeqMan软件进行生物信息分析。结果 Bcp/pc区点突变包括nt1753、nt1762、nt1764、nt1776、nt1803、nt1846、nt1896。HBV携带者、慢性乙型肝炎、HBV相关肝硬化及肝癌患者nt 1762(nt 1764)点突变率分别为7.7%、68.0%、72.7%(68.0%)及90.9%(81.8%),肝癌患者G1896A突变频率占54.6%。A1762T+G1764A联合突变占36%;A1762T、G1764A、G1896A联合突变占11%;T1753A/C、A1762T、G1764A、G1896A发生率为7%。克隆测序显示,肝硬化及肝癌患者bcp区起始点A1727G点突变率分别为72%、63%。HBeAg阴性患者存在更多的基因变异(P=0.022),G1776A和G1896A突变是HBeAg阴性的独立预测因素(P<0.05)。Bcp区点突变与HBeAg阴性无明显关系。肝硬化和肝癌患者pres基因缺失突变频率最高,肝癌及肝硬化患者pres1、pres2及pres1+s2缺失频率分别为7.1%、71.4%、7.1%及41.2%、58.8%、29.4%(P<0.05)。结论 A1727G、A1762T、G1764A及A1762T/G1764A联合突变、pres缺失在HBV相关肝硬化及肝癌患者多见,可能是肝脏疾病进展的危险因素,G1776A和G1896A突变是HBeAg阴性的独立预测因素。Bcp/pc点突变及pres区缺失可能为肝癌发生的早期预测因素,值得进一步研究。     

乙型肝炎病毒拉米夫定耐药毒株的全基因质粒构建及其在HepG2细胞中复制与表达

目的 探讨拉米夫定耐药变异对病毒复制及抗原表达的影响.方法 通过定向点突变方法,成功的在模板质粒P3.8Ⅱ基础上构建成功3种P基因变异株质粒,并转染HepG2细胞,与HBV野毒株相比,分析变异毒株复制表达活性的差别.结果 经DNA测序证实,成功构建了rtG172E、rtG174C、rtG172E/rtG174C等3种变异株质粒,转染细胞系后发现上清均表达有HBsAg和HBeAg,证明转染质粒在细胞内成功表达并分泌HBsAg和HBeAg.通过检测细胞内复制产生的子代HBVDNA发现,rtG172E、rtG174C、rtG172E/rtG174C等3种变异株的复制活性均有明显减弱.结论 新发现的3种P基因变异株会影响HBV复制活性,对药物敏感性的影响需进一步研究.     

乙型肝炎病毒1896A变异对HBV复制的影响

目的 :研究乙型肝炎病毒 1896A变异对HBV复制的影响。方法 :采用错配引物聚合酶链反应 (PCR)—限制性片段长度多态性 (RFLP)分析 ,对 10 5例HBVDNA阳性的HBV感染者进行HBV 1896A变异及HBVDNA定量检测。结果 :1896A变异组HBeAg阴性率较非 1896A变异组高 (P <0 .0 0 5 )。HBV 1896A变异组HBVDNA含量在HBeAg+ 病例 (10 8.2 3± 0 .96 copy/ml,vs 10 7.6 7± 0 .6 7copy/ml,P <0 .0 1)及HBeAg- 病例 (10 7.99± 1 .33copy /mlvs 10 7.0 8± 1 .4 9coyp/ml,P <0 .0 1)中均较非HBV 1896A变异组高。 结论 :1896A变异在阻断HBeAg表达的同时促进HBV的复制。     

乙肝病毒前C/C区基因一级结构及变异特征的临床探讨

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)前C/C基因突变与HBV-DNA水平及转氨酶的关系;方法:收集慢性乙型病毒性肝炎患者血清423份,进行前C/C区基因测序、HBV标志物、HBV-DNA、ALT、AST测定.结果:HBVnt1896突变毒株158例,nt1899突变毒株57例.C区变异大部分集中在第5、27、60位氨基酸的...     

慢性乙肝患者e抗原血清转换与HBV基因变异的关系

目的 :了解慢性乙肝患者e抗原血清转换中HBV -DNA前C基因及C基因启动子变异的关系。方法 :HBV -DNA阳性且e抗原 /或e抗体阳性的慢性乙型肝炎患者各 30例 ,以PCR结合微板核酸杂交 -ELISA方法检测乙肝病毒前C基因 (nt 1896、nt 1899)及其基本核心启动子 (BCP ,nt 176 2、nt 176 4)变异。结果 :不论前C基因还是BCP变异 ,均与e抗原血清转换相关 (P <0 .0 5 ) ;不论e抗体阳性组还是e抗原阳性组 ,BCP变异均高于前C基因变异 (P <0 .0 5 ) ,但二者均不相关 (P >0 .0 5 )。结论 :乙肝病毒C基因启动子与前C基因的变异是随机的 ,都可下调HBeAg的表达 ,前者更易于发生变异。     

乙型肝炎病毒前C区1896点突变的检测

目的：探讨乙型肝炎病毒(HBV)前C区1896点突变的临床意义。方法：利用PCR-ELISA技术检测38倒HBeAg阴性而HBV DNA阳性的乙型肝炎病毒感染者HBV前C区1896点突变。结果：38例HBeAg阴性而HBV DNA阳性的乙型肝炎病毒感染者检出28例HBV前C区1896变异病毒株，检出率为73．7％。结论：临床HBeAg阴性，HBV DNA阳性感染者多数为HBV l896变异病毒株感染，这些感染者具有传染性，故HBeAg阴性不能作为排除HBV复制和传染性的唯一指标。     

乙型肝炎病毒X基因变异和慢性乙型肝炎患者临床与组织病理学指标的相关性

 目的 探讨慢性乙型肝炎患者肝组织内乙型肝炎病毒（HBV）X基因部分区段的变异与HBV相关各临床与组织病理学指标的关系。方法 以83例慢性乙型肝炎肝穿刺活检标本作为研究对象，20例HBV相关性肝细胞癌作为对照；HBV X基因变异的研究采用PCR扩增和直接双向测序。免疫组化二步法显示肝组织内四种病毒蛋白的表达；荧光实时定量PCR检测肝组织内HBV DNA含量。结果 HBV X基因nt1583～1793区段错义突变主要出现在对应的X蛋白aa87（nt1632、1633）、88（nt1635、1636）、116（nt1719）、118（nt1726、1727）、119（nt1730）、127（nt1752）、130（nt1762）和131（nt1764）位氨基酸。nt1725～1730（aa118/119）突变与肝组织内HBcAg显著低表达（P=0.006），和HBV DNA低拷贝数（P=0.004）明显相关，尤以ACTGAC（TD）型突变最为明显；相反，nt1762/1764（aa130/131）位点突变则伴肝组织内HBcAg显著高表达（P=0.005）和高水平的HBV DNA含量（P=0.006）。同时，肝癌组中nt1725～1730 野生型所占比率明显高于慢性肝炎（P<0.05），而nt1762/1764 突变型所占比率肝癌组与肝炎组相比显著增高（P<0.01）。结论 肝组织内，在nt1725～1730突变能显著降低HBcAg 的表达和HBV DNA水平，nt1762/1764突变则相反。肝组织内HBV的高负载可能与肝细胞癌的发生有关     

乙型肝炎病毒C基因启动子和前C基因变异对HBeAg含量和HBVDNA定量及肝炎病情的影响

目的　研究乙型肝炎病毒 (HBV)C基因启动子 (CP)和前C基因变异对HBeAg含量和HBVDNA定量及肝炎病情的影响。方法　通过DNA扩增、基因序列分析检测 75例慢性乙肝、 14例慢性重型乙肝和 34例肝硬化患者的血清HBVCP和前C基因序列 ,通过微粒子发光法定量检测血清中HBeAg的含量 ,通过荧光定量PCR技术检测血清HBVDNA含量。结果　 (1)中度和重度慢性乙型肝炎 (CH)患者CP双变异 (nt176 2A→T和 176 4G→A)的发生率同轻度CH组比较显著升高 (分别为 6 1 3%和 6 1 1%VS 2 3 1% ) ;肝硬化组患者CP双变异发生率同CH组比较显著升高(76 5 %VS 4 8 0 % )。前C基因终止变异 (nt1896G→A)在重型乙型肝炎患者中的发生率显著升高 (71 4 % )。 (2 )双变异组和终止变异组患者HBeAg含量均显著下降 ,但后者下降更明显。双变异组的HBeAb阳性率和对照组比较无明显差异 ,但终止变异组的HBeAb阳性率同双变异组和对照组比较差异显著。终止变异联合双变异组的HBeAg含量及HBeAb阳性率同终止变异组相似。 (3)双变异组和对照组患者HBVDNA含量间无明显差异。结论　CP双变异和前C基因终止变异均影响HBeAg表达 ,但后者影响更大 ;在对病情影响上 ,前者与肝硬化发病有关 ,后者则与重型乙肝发病有关。     

HBV全基因C区突变株在永生化B淋巴母细胞系中的稳定表达

目的 构建携带V60、G87和L97突变位点的HBV全基因组真核表达载体,转染慢性HBV感染者永生化B淋巴母细胞系（LCLs）。方法 用定点突变技术将HBVp3．8Ⅱ质粒C基因区3个氨基酸V60、G87、L97进行突变（p3．8Ⅱ-V60,G87,L97）,转化E．coli．XL1-Blue感受态细胞扩增筛选,用限制性内切酶Sac I和Kpn I分别将野生型和突变型p3．8Ⅱ质粒进行双酶切,插入EBV-plpp真核细胞表达载体,转染LCLs,潮霉素稳定筛选后,鉴定目的基因在转染细胞能够稳定表达。结果与结论 DNA序列分析表明,野型HBV DNA核心区第60、87、97位氨基酸发生了预期的突变,Western Blotting和微粒子免疫荧光法证明转染的LCLs能稳定表达HBV抗原,证实成功构建了预期细胞模型。     

深圳市乙肝疫苗免疫失败者S基因分析

目的了解乙肝疫苗免疫失败者的HBVS基因的变异情况。方法采用流行病学、ELISA与分子生物学方法,筛选乙肝疫苗免疫失败者。采用聚合酶链反应（PCR）、基因克隆和测序的方法,对乙肝疫苗免疫失败者的HBVS基因进行分析,并与HBV参考序列s基因进行比较,分析其变异情况。结果从2564份受检者中．筛选出2例（0．78％e）HBsAg（-）／HBeAg（＋）／HBcAb（＋）乙肝疫苗免疫失败者（HBsl、HBs2）,经HBVDNA荧光定量PCR检测和HBVS基因PCR扩增,结果均为阳性,为B基因型。其S基因序列与参考序列（JX429908．1）相比,同源性为98．57％,且乙肝疫苗免疫失败者s基因在第363位和第467位分别由野生型的C变为A、G变为A,HBsAg121位和156位氨基酸C和w缺失。结论乙肝疫苗免疫失败者HBVS基因上第363位和第467位碱基存在错义突变（C→A和G→A）,改变了HBsAg的结构和抗原性。     

HBV核心启动子部分缺失重组质粒的构建

目的　构建乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）核心启动子（ＣＰ）部分缺失的真核表达质粒。方法　利用线性化的、从ＣＰ上游顺 序开始且含完整转录单元的ＨＢＶ 基因克隆（Ｐ３．８Ｉ质粒）为工具,采用分子克隆、人工定点突变、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ,鉴定和测 序分析等技术构建目的载体。结果　成功构建了ＨＢＶ全基因ＣＰ ２０／２１个ｂｐ缺失（ｎｔ １７４８／１７４７－１７６７）和ＣＰ２０／２１个ｂｐ 缺失＋１８９６热点变异的重组真核质粒表达质粒,并经ＰＣＲ－ＲＦＬＰ序列分析证实。结论　此重组真核表达质粒构建可为 体外进一步研究上述变异的生物学意义奠定基础。     

慢性乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒DNA序列异质性及准种特点的研究

目的 以乙型肝炎病毒(HBV)基因异质性来探讨HBV准种群在慢性感染者中的存在状态。方法应用聚合酶链反应（PCR)法,自18例慢性患者血清中分别扩增前C／C基因、P基因逆转录酶区(RT)、HBV全S区、X基因和全基因组序列,克隆人pGEM Teasy质粒,挑选81克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果除外大段缺失突变的克隆,来源于同一患者前C／C区、RT区、全S区、X区和全基因组不同克隆之间的碱基序列同源性分别为98．0％-99．1％、98．7％-99．3％、97．5％-100％、93．0％-98．20A,和96．6％-97．5％。前C区A83点突变、C抗原内部缺失较为常见,缺失突变、终止替换突变、短序列的插入或缺失突变造成的移框突变在各个区域中均可检出,X基因(核心蛋白启动子区,CP)内部缺失突变不仅导致X蛋白羧基端的多样性,而且调控HBeAg的表达。编码截短型表面抗原中蛋白和缺陷病毒基因亦在患者外周血中。结论 多区域测序结果提示HBV慢性患者体内HBV呈现准种群共存,X区(CP区)内存在热点缺失突变区,CP区的变异可能影响前C蛋白的表达,这些变异可能与患者不良预后有关。病毒蛋白的氨基酸的替换突变表现的个体特异性值得进一步研究。     

乙型肝炎病毒C区蛋白在肝癌细胞株中的表达

用PCR法获得编码乙型肝炎病毒C区不同蛋白的基因，利用基因重组技术构建表达这些蛋白的真核表达载体。并在高分化肝癌细胞株HepG2中进行了稳定表达。     

乙型肝炎病毒C基因启动子变异与基因型和肝硬化的关系

目的 研究HBV C基因启动子(CP)和前C基因变异与HBV基因型和病情的关系。方法 通过DNA扩增、基因序列分析检测44例慢性乙型肝炎(CH)，29例肝硬化(LC)患者的血清HBV S基因序列以确定其基因型，测定HBVCP和前C区序列以确定其变异状况。结果 (1)CP双变异(nt 1762A→T和1764G→A)的发生率肝硬化组为75．9％，慢性乙型肝炎组为45.5%，两组间差别有显著性意义(P＜0.05)。(2)LC患者的C基因型检出率为69．0%，CH患者的C基因型检出率为43.2％，二者间差别有显著性意义(P＜0.05)。(3)C基因型HBV感染者CP双变异发生率为69.2％，B基因型HBV感染者CP双变异发生率为44．1％，二者间差别有显著性意义(P＜0.05)。结论 CP双变异与C基因型密切相关，并且导致病情向肝硬化发展。     

硫代反义寡聚脱氧核苷酸体外对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）C基因翻译起始区和C基因区硫代反义寡聚脱氧核苷酸（ASON）对HBV表达的序列性抑制作用。方法 以2．2．15细胞系作为实验对象,设计了一系列互补于HBV mRNA编码核心蛋白基因区（C区）15聚硫代ASON,通过脂质体介导将这些合成的外源基因导入2．2．15细胞中,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测作用细胞培养上清液中乙型肝炎病毒E抗原（HBeAg)和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg)含量。结果 与HBV mRNA C基因起始区互补的硫代ASON序列特异性地抑制乙型肝炎病毒基因表达,而正义硫代寡聚脱氧核苷酸未见有抑制效应,与HBV mRNA C基因内部互补的序列很少或无抗病毒活性。另外,硫代ASON对细胞生长无毒性作用。结论 硫代ASON能够在细胞水平有效地抑制乙型肝炎病毒基因的表达。