hTERT启动子的克隆及hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞中的转录活性

目的 克隆hTERT启动子核心序列,研究hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞中的联合转录活性。 方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增hTERT启动子核心片段;将其分别插入荧光素酶基因报告质粒pGL3-Basic和pGL3-Enhancer中,构建hTERT启动子调控的表达载体pGL3-hTERTp和由hTERT启动子/SV40增强子联合调控的表达载体pGL3-hTERTp-SV40en,将上述重组质粒分别瞬时转染食管癌细胞Eca-109、EC1和人胚肺成纤维细胞MRC-5,用荧光素酶检测试剂盒检测转染细胞中荧光素酶基因的表达水平并以此计算hTERT启动子和hTERT启动子/SV40增强子在各种细胞中的转录活性。结果 克隆出长213 bp的hTETR启动子核心片段,DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子的碱基序列完全一致;成功构建真核表达载体pGL3-hTERTp和pGL3-hTERTp-SV40en;hTETR启动子在食管癌细胞Eca-109和EC1中均有转录活性,在MRC-5细胞中无明显转录活性;hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞Eca-109和EC1中的转录活性显著高于hTETR启动子的单独转录活性。结论 hTERT启动子在食管癌细胞中具有靶向性转录活性,SV40增强子能显著增强hTERT启动子在食管癌细胞中的转录活性,有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的转录调控元件。     

miR-34b/c启动子区单核苷酸多态性对其转录调控的影响

[目的]研究miR-34b/c启动子区单核苷酸多态rs4938723(T/C)对其转录调控的影响.[方法]构建含有不同基因型miR-34b/c启动子区的报告基因表达载体pGL3-basic-miR34b/c-T和pGL3-basic-miR34b/c-C,分别与内参质粒SV40共转染于Hela、A549和CHO三种细胞后进行荧光素酶活性分析.[结果]pGL3-basic-miR34b/c-C等位基因组荧光素酶相对活性与pGL3-promoter-miR30C-T组等位基因相比,均有显著升高(P＜0.01).[结论]荧光素酶活性强弱间接反映了miRNA启动子区遗传变异对转录活性的影响,当miR-34b/c启动子区rs4938723位点为C时,可以更为有效地增加miR-34b/c的转录产物,从而在转录水平上调控miRNA的表达.     

LCRG1基因5''端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的:LCRG1基因的调控机制至今不清楚, 本研究拟克隆LCRG1基因的转录起始区上游序列, 寻找与其表达有关的调控序列.方法:利用生物信息学技术预测LCRG1基因5′端调控区域的启动子活性区域,采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776 kb(-1 191 bp～ 585 bp)片段,并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3 basic载体中.与内参照质粒PhRL-SV40共转染COS7细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性.结果:成功扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776 kb(-1 191 bp～ 585 bp)片段,测序正确; pGL3-1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0.16倍,为阴性组pGL3 basic 的35倍.结论:成功克隆LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191 bp～ 585 bp),该片段具有启动子活性.     

E2F1对 TFDP3 表达的调控及其对前列腺癌PC3细胞凋亡的影响

目的：构建含TFDP3基因启动子和荧光素酶报告基因的重组载体pGL3-TFDP3-promoter,观察E2F1对TFDP3转录及表达的调控作用以及TFDP3对E2F1诱导肿瘤细胞凋亡的影响。方法：以人前列腺癌PC3细胞系基因组DNA为模板,PCR扩增TFDP3启动子序列并克隆入荧光素酶报告基因载体,与E2F1表达载体pCMV-E2F1-HA瞬时单独或共同转染PC3细胞,测定荧光素酶活性以观察E2F1对TFDP3启动子的调控作用,Western blotting检测pCMV-E2F1-HA转染对PC3细胞内TFDP3表达的影响,流式细胞术检测TFDP3与E2F1相互作用对前列腺癌细胞凋亡的影响。结果：成功构建TFDP3基因启动子重组质粒pGL3-TFDP3-promoter,与E2F1表达载体pCMV-E2F1-HA共转染PC3细胞后,TFDP3启动子诱导的荧光素酶活性较单独转染pGL3-TFDP3-promoter显著升高[（1.14±0.06）vs（0.61±0.05）, P<0.05]。转染pCMV-E2F1-HA的PC3细胞的TFDP3蛋白表达是未转染细胞的2.7倍[（0.24±0.03）vs（0.09±0.02）, P<0.05]。pCMV-E2F1-HA转染后PC3细胞凋亡率较未转染组显著上升[（7.10±0.003）% vs（2.66±0.001)%,P<0.05],而pCMV-E2F1-HA与pcDNA3.1-TFDP3共转染后细胞凋亡率较pCMV-E2F1-HA组显著下降[（4.92±0.002）% vs（7.10±0.003）%,P<0.05]。结论：E2F1可增强TFDP3启动子的活性,增加TFDP3蛋白的表达,其可能通过此机制抑制E2F1诱导的前列腺癌细胞凋亡。     

LCRG1基因5′端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的:LCRG1基因的调控机制至今不清楚,本研究拟克隆LCRG1基因的转录起始区上游序列,寻找与其表达有关的调控序列。方法:利用生物信息学技术预测LCRG1基因5′端调控区域的启动子活性区域,采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp)片段,并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3basic载体中。与内参照质粒PhRL-SV40共转染COS7细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果:成功扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp)片段,测序正确;pGL3-1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0.16倍,为阴性组pGL3basic的35倍。结论:成功克隆LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp),该片段具有启动子活性。     

LCRGl基因5’端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的：LCRGl基因的调控机制至今不清楚，本研究拟克隆LCRGl基因的转录起始区上游序列，寻找与其表达有关的调控序列。方法：利用生物信息学技术预测LCRGl基因5’端调控区域的启动子活性区域，采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRGl基因5’端调控区域1．776kb（-1191bp-＋585 bp）片段，并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3 basic载体中。与内参照质粒PhRL—SV40共转染COS7细胞，通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果：成功扩增LCRGl基因5’端调控区域1．776kb（-1191bp- ＋585bp）片段，测序正确；pGL3—1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0．16倍，为阴性组pGL3basic的35倍。结论：成功克隆LCRGl基因5’端调控区域1．776kb（-1191 bp- ＋585bp），该片段具有启动子活性。     

t（6；11）染色体易位肾细胞癌中Alpha基因片段的克隆及启动子活性分析

  目的   构建包含不同Alpha基因片段的重组报告质粒和Alpha1-TFEB融合基因表达质粒，并评价Alpha基因启动子活性。   方法   利用软件对Alpha基因进行启动子预测；采用PCR技术扩增出5种不同长度的Alpha基因片段和正常TFEB基因启动子序列pTFEB，构建含Alpha基因片段和pTFEB的重组报告质粒；采用脂质体转染法将其分别转染至人胚肾293T细胞；通过荧光素酶活性检测确定Alpha基因的启动子活性。同时构建含Alpha1-TFEB融合基因表达质粒，转染293T细胞后，采用Western blot法检测转染前后TFEB蛋白的表达水平。   结果   成功构建含不同Alpha基因片段和pTFEB的重组报告质粒。与pGL3-Basic质粒转染组进行比较，Alpha1、Alpha2、Alpha3、Alpha4、Alpha5质粒转染组的荧光素酶活性显著增高（P＜0.01）；与正常TFEB基因启动子进行比较，Alpha1、Alpha2、Alpha5的荧光素酶活性明显增高（P＜0.01）；与pGL3-Enhancer质粒转染组进行比较，pGL3-Enhancer-Alpha1-TFEB表达质粒组TFEB蛋白的表达明显升高。   结论   t（6；11）染色体易位肾细胞癌中Alpha基因具有启动子活性，可促进TFEB表达，Alpha5片段最强活性区域位于643~693位碱基序列。      

人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的克隆及其在人肺癌细胞中转录活性的研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位(hTERT)的启动子，并检测它在多种人肺癌细胞株和人胚肺成纤维细胞株中的转录活性，为肺癌靶向性基因治疗的研究奠定基础。方法以人胚肾293细胞基因组DNA为模板，应用PCR方法克隆hTERT 5’端上游旁侧序列长约1．1kh的启动子片段，经DNA测序无误后克隆人荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游，构建pGL3-hTER Tp重组质粒，用脂质体法瞬时转染人肺癌细胞株A549、SPC-A-1、LTEPa-2、NCI—H446、YTMLC、GLC-82、A2，以及人胚肺成纤维细胞株MRC5，转染48h后检测hTERT启动子在各细胞株中的转录活性。结果琼脂糖凝胶电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1.1kb。DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致，其5’端和3’端分别位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp和43bp，片段长度为1084bp。采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒，均显示构建成功。瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示，hTERT启动子在所检测的肺癌细胞株中均有高低不同的转录活性，而在MRC-5细胞株中无转录活性。结论该实验克隆的1084bp大小的hTERT启动子在多种肺癌细胞株中均有转录活性，在人胚肺成纤维细胞中无转录活性。hTERT启动子有可能作为调控元件用于肿瘤靶向性基因治疗。     

转录因子STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒的构建及鉴定

目的： 利用分子克隆的方法构建转录因子STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒并鉴定其效应。方法： 以乳腺癌MCF7细胞基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增STAT5A基因的启动子序列,并将其克隆至荧光素酶报告基因质粒pGL3-Enhancer中,经过菌液扩增、酶切、测序等方法获得目的质粒,并通过双荧光报告基因实验进一步验证其功能。结果： 构建的STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒pGL3-STAT5A-pro-luc-E序列正确,且具有转录活性。在双荧光报告基因实验中发现重组载体pGL3-STAT5A-pro-luc-E荧光素酶的相对活性约为阴性对照pGL3-Enhancer的8倍（P<0.01）,而pGL3-STAT5A-pro-N-luc-E荧光素酶的相对活性约是阴性对照pGL3-Enhancer的6倍（P<0.01）。结论： 本项目成功构建了转录因子STAT5A启动子荧光素酶报告基因质粒,为进一步研究STAT信号转导及转录激活蛋白信号通路提供了重要的研究工具。     

胚胎癌F9细胞中Oct4对miR-302启动子的调控作用

目的： 检测胚胎癌F9细胞中Oct4对miR-302启动子活性是否具有调节作用。方法：构建PGL3-P-miR-302启动子荧光素酶报告基因质粒并验证其活性,然后将0.5 μg PGL3-P-miR-302分别与0.5和1.0 μg Oct4表达质粒共转染至293T细胞中,检测过表达Oct4对miR-302启动子活性的影响;并将0.5 μg PGL3-P-miR-302和Oct4 siRNA(2.0 μg siRNA1和2.0 μg siRNA2)共转染到F9细胞中,检测Oct4 RNA干扰对miR-302启动子活性的影响,以验证Oct4对miR-302启动子是否有调控作用。结果：成功构建了PGL3-P-miR-302启动子荧光素酶报告基因质粒,并证实了PGL3-P-miR-302在F9细胞中具有启动子活性;在T293细胞中,当Oct4表达质粒为0.5 μg时miR-302启动子转录活性是对照组的2.6倍(P<0.05),当Oct4为1.0 μg时miR-302启动子转录活性是对照组的4.3倍(P<0.05);在F9细胞中miR-302启动子的活性在转染Oct4 siRNA后明显下降,约为 siRNA非特异性对照组的68%(P<0.05)。结论：Oct4对miR-302启动子具有正调节作用,miR-302可能是Oct4的靶基因之一。     

SOX7及其在肿瘤中的表达和作用

SOX7是转录因子SOX家族成员,调控多种生物学过程.研究发现SOX7基因是一个抑癌基因,其表达在绝大多肿瘤中下调,可能是通过调节Wnt-β-连环蛋白信号通路介导的转录过程抑制肿瘤的增殖、迁移和侵袭等生物学行为,在肿瘤的发生中起着重要作用.     

转录因子 SOX7 基因在贲门腺癌中的异常表达及其甲基化状态

目的：检测贲门腺癌（gastric cardia adenocarcinoma,GCA）组织及相应癌旁非肿瘤组织中Y性别决定区基因7（sex determining region Y-box 7, SOX7 ）的甲基化状态及其对 SOX7 mRNA表达、Wnt通路中心因子β-catenin异质表达的影响及与临床病理特征之间的相关性。方法：选择河北医科大学第四医院胸外科2006-2012年手术切除的GCA及癌旁组织各130例,应用甲基化特异性PCR（methylation specific PCR, MSP）、RT-PCR分别检测130例GCA及癌旁组织中 SOX7 基因的甲基化状态及其mRNA表达情况,应用免疫组织化学方法检测标本中β-catenin蛋白的表达。分析 SOX7 的甲基化状态与临床病理特征、 SOX7 mRNA表达、β-catenin蛋白的异质表达及上消化道肿瘤家族史（upper gastrointestinal cancers,UGIC）的关系。 结果 ：GCA组织中 SOX7 的甲基化率显著高于癌旁组织为\[57.7%（75/130） vs 30.8%（40/130）, P <0.01\],其高甲基化仅与肿瘤患者的淋巴结转移情况有关（ P <0.05）,与肿瘤组织的病理分级及临床分期均无关（ P >0.05）。GCA组织中 SOX7 mRNA的表达量明显低于癌旁非肿瘤组织\[(0.414±0.054) vs (0.695±0.034), P <0.01]\],其β-catenin蛋白的异质表达率显著高于癌旁组织（85.4% vs 43.1%, P <0.01）;GCA组织中 SOX7 基因mRNA表达情况及β-catenin蛋白的异质表达率均与该基因的甲基化状态有关（ P <0.05）,并且 SOX7 基因的甲基化状态与贲门癌患者的上消化道家族史密切相关（ P <0.01）。结论： CpG岛甲基化是 SOX7 基因表达下调的机制之一,并可能通过Wnt/β-catenin信号转导通路的激活在贲门腺癌的发生中扮演着重要的角色。     

SOX1与肿瘤

SOX1是转录因子SOX家族中的一员,具有调控神经系统及晶状体发育等作用.SOX1在肿瘤中的作用日渐引起人们的注意.研究表明,SOX1在多种肿瘤组织中因甲基化水平上升而呈低表达,能够调控肿瘤的增殖、侵袭与转移能力,且在调节肿瘤干细胞的分化过程中起着重要的作用.深入研究SOX1及其在相关信号通路中的作用,可为肿瘤治疗提供新途径.     

过表达SOX7对胆囊癌GBC-SD细胞增殖生物学特性的影响及其机制研究

目的 探讨过表达SOX7(Sex determining region Y-box 7)基因对胆囊癌GBC-SD细胞株增殖、凋亡的影响及其可能涉及的细胞信号通路。方法 用特异性的重组质粒pcDNA3.1-SOX7作为实验组转染GBC-SD细胞建立稳定过表达SOX7基因的细胞,空载体pc-DNA3.1-mock作为对照组。采用Edu细胞荧光染色法检测过表达SOX7基因对GBC-SD细胞增殖的影响,同时采用Hoechst 33342细胞染色法检测GBC-SD细胞的凋亡。Western blot检测相关信号通路蛋白的表达。结果 实验组中SOX7 mRNA的相对表达量为(353.0±28.1)%,相对于对照组(100.0±2.3)%表达明显增加,差异具有统计学意义(P＜0.05)。对照组细胞在450 nm吸光度值为(4.6±0.4),较实验组(2.4±0.2)明显升高,差异具有统计学意义(P＜0.05)。Edu免疫荧光染色结果表明,对照组细胞增殖比例(33.3±3.4)%高于实验组(12.2±4.2)%,差异具有统计学意义(P＜0.05)。Hoechst 33342细胞凋亡荧光染色结果表明,对照组细胞凋亡比例(5.2±1.3)%较实验组(10.2±2.4)%降低,差异具有统计学意义(P＜0.05)。Western blot实验结果表明,对照组PTEN蛋白的相对表达量为(0.2±0.02),而实验组的相对表达量为(0.7±0.04),对照组磷酸化Akt的相对表达量为(0.8±0.03),而实验组为(0.4±0.02),差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论 过表达SOX7基因能显著抑制胆囊癌细胞GBC-SD的增殖,导致其凋亡增加。PTEN/Akt信号通路的激活可能与之有关。     

Unique and redundant roles of SOX2 and SOX17 in regulating the germ cell tumor fate

Embryonal carcinomas (ECs) and seminomas are testicular germ cell tumors. ECs display expression of SOX2, while seminomas display expression of SOX17. In somatic differentiation, SOX17 drives endodermal cell fate. However, seminomas lack expression of endoderm markers, but show features of pluripotency. Here, we use chromatin immunoprecipitation sequencing to report and compare the binding pattern of SOX17 in seminoma-like TCam-2 cells to SOX17 in somatic cells and SOX2 in EC-like 2102EP cells. In seminoma-like cells, SOX17 was detected at canonical (SOX2/OCT4), compressed (SOX17/OCT4) and noncomposite SOX motifs. SOX17 regulates TFAP2C, PRDM1 and PRDM14, thereby maintaining latent pluripotency and suppressing somatic differentiation. In contrast, in somatic cells canonical motifs are rarely bound by SOX17. In sum, only 12% of SOX17-binding sites overlap in seminoma-like and somatic cells. This illustrates that binding site choice is highly dynamic and cell type specific. Deletion of SOX17 in seminoma-like cells resulted in loss of pluripotency, marked by a reduction of OCT4 protein level and loss of alkaline phosphatase activity. Furthermore, we found that in EC-like cells SOX2 regulates pluripotency-associated genes, most likely by partnering with OCT4. In conclusion, SOX17 (in seminomas) functionally replaces SOX2 (in ECs) to maintain expression of the pluripotency cluster.