噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白的研究

目的：通过筛选乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(core promoter，CP)结合蛋白，为HBV复制机制和调控机制的研究探索新的途径。方法：应用噬菌体展示技术，以HBV的核心启动子的聚合酶链反应(PCR)产物作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程，经噬斑的PCR扩增后。构建克隆载体，最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果：噬菌体经富集后，随机筛选得到7个阳性克隆．成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索，确定了和HBV启动子结合的肝细胞蛋白基因序列，分别编码β2微球蛋白和3种未知功能蛋白。结论：用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了与HBV核心启动子结合的蛋白，分析了该蛋白的编码基因，为进一步研究HBV与肝细胞相互作用的分子生物学机制开辟了新的途径。     

噬菌体展示技术筛选干扰素α启动子DNA结合蛋白

目的筛选干扰素α(IFN α)启动子DNA结合蛋白,探讨IFN α基因表达调节的分子生物学机制。方法应用噬菌体展示技术,以IFN α启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果噬菌体经富集后,随机挑选40个克隆,成功构建了克隆载体,序列测定后经过同源性搜索,确定了和IFN α启动子结合的肝细胞蛋白,筛选到17种与IFN α启动子具有结合作用的蛋白。结论多种具有不同生理、生化功能的蛋白与IFN α启动子具有结合作用。     

用噬菌体展示技术筛选幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白基因结合蛋白的研究

目的筛选幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白（CagA）基因结合蛋白，探索CagA致病机理。方法应用噬菌体展示技术，以幽门螺杆菌CagA基因片段作为固相筛选分子，对噬菌体人胃细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集，噬斑裂解液PCR扩增后，进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索，确定编码结合蛋白的种类。结果噬菌体经富集后，筛选出36个阳性克隆，构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索，确定幽门螺杆菌CagA基因共编码核纤层蛋白B1和胰岛素样生长因子结合蛋白2两种已知蛋白。结论用噬菌体人胃cDNA文库筛选得到幽门螺杆菌CagA基因DNA结合蛋白，为研究CagA致病机理，幽门螺杆菌疫苗的研制和治疗等提供依据。     

噬菌体展示技术筛选重组干扰素-β蛋白结合蛋白

目的:利用噬菌体展示技术筛选重组干扰素-β(IFN-β)肝细胞结合蛋白,探讨IFN-β抗病毒的分子生物学机制.方法:应用噬菌体展示技术,以重组的IFN-β蛋白包被酶联免疫板,作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程.经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列测定和生物信息学分析.结果:对肝细胞cDNA文库经过5轮的生物淘洗,从最后一轮筛选的顶层琼脂中随机挑选40个克隆,构建克隆载体,序列测定后经过同源性搜索和生物信息学分析,确定了和IFN-β蛋白具有结合作用的肝细胞蛋白.结论:筛选到与IFN-β蛋白具有结合作用的多种具有不同生理、生化功能的肝细胞蛋白.     

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA的结合蛋白

目的：筛选丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA结合蛋白，探索HCTP4基因的表达调控机制。方法：应用噬菌体表面展示技术，以多聚酶链反应(PCR)技术扩增的HCTP4启动子DNA片段作为固相筛选分子．对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程，噬斑裂解液PCR扩增后，回收产物并进行克隆化，对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果：噬菌体经富集后，筛选出12个阳性克隆。成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索，确定了与HCV核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA结合的蛋白有：核糖体蛋白L15、视网膜母细胞瘤结合蛋白8。结论：用噬茵体人肝cDNA文库筛选得到HCV核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA结合蛋白，分析了这些蛋白的功能，为研究HCTP4的生物学调节机制，进一步阐明HCV核心蛋白的致病机制奠定了基础。     

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA的结合蛋白

目的：筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白，探索NS5A-TP9的表达调节机制。方法：应用噬菌体展示技术，以聚合酶链反应(PCR)技术扩增的NS5A-TP9启动子DNA片段作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程，噬斑裂解液PCR扩增后，回收产物构建克隆载体，对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索。结果：噬菌体经富集后，筛选出10个阳性克隆，成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索，确定了与HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合的蛋白有：补体C3、甲胎蛋白、人血清白蛋白、人核糖体蛋白20S和α1微球蛋白。结论：用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HCV NS5A蛋白反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白，分析了这些蛋白的功能，为研究NS5A-TP9基因的转录调节机制，进一步阐明HCV非结构蛋白NS5A的致病机制奠定了基础。     

噬菌体展示技术筛选HBV前-前-S抗原基因启动子结合蛋白基因

目的:筛选乙型肝炎病毒(HBV)前-前-S抗原基因启动子的结合蛋白. 方法:应用噬菌体表面展示技术,以HBV前-前-S抗原基因启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“黏附-洗脱-扩增”的筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,并对所筛选克隆进行DNA测序和生物信息学分析. 结果:噬菌体经富集后,从随机筛选的43个克隆中得到20 个与HBV前-前-S抗原基因启动子特异结合的阳性克隆, 包括人类SMG-1的磷脂酰肌醇3相关激酶激酶、28 S核糖体、单倍型As2A线粒体、组氨酰-tRNA合成酶、脂肪醛脱氢酶、桥粒相关蛋白、MAX相互作用蛋白1等17个已知功能基因及3个未知功能基因. 结论:用噬菌体人肝细胞cDNA文库筛选得到HBV前-前- S抗原基因启动子的结合蛋白基因,为进一步研究HBV发病机制创造了新的途径.     

T7 cDNA噬菌体展示文库筛选乙型肝炎病毒前S2蛋白结合蛋白

目的以乙型肝炎病毒前S2蛋白（HBV Pre-S2）为靶蛋白，寻找该蛋白相应的结合蛋白。方法应用噬菌体表面展示技术，以纯化的HBV前S2蛋白为固相筛选蛋白，用正常人肝细胞的噬菌体T7 cDNA文库进行5轮生物筛选，经噬斑PCR，对筛选克隆进行DNA序列分析，将推断的氨基酸序列在蛋白质库中进行搜索，自GenBank中获得与HBV Pre-S2有结合作用蛋白的cDNA和基因组的全长序列，并用ELISA验证筛选的结合蛋白。结果噬菌体经过5轮生物富集后，将随机筛选的200个噬斑裂解液做PCR，得到120个插入片段长短不一的克隆，ELISA证实获得43个阳性克隆。将其PCR产物序列测定后进行同源搜索，初步确定30个人体肝脏中固有的与乙型肝炎病毒前S2蛋白结合的蛋白，其中含细胞色素P450Ⅰ类A型亚基克隆2个、3个PI-3激酶相关激酶SMG-1同类蛋白、2个细胞生长抑制蛋白42，1个膜联蛋白All转录变异体、3个转录激活因子5、2个α酸性糖蛋白、5个未知功能蛋白等。结论应用T7 cDNA噬菌体表面展示技术和生物信息学方法筛选并验证了HBV Pre-S2蛋白结合蛋白，为进一步研究Pre-S2蛋白的生物学功能提供新了思路。     

猪囊尾蚴一种蛋白抗原的cDNA分子克隆

目的从猪囊尾蚴cDNA文库中克隆某种编码蛋白抗原的基因.方法用脑囊尾蚴病人血清筛选猪囊尾蚴cDNA文库,获得阳性克隆后,经PCR技术扩增噬菌体载体中插入的cDNA片段,并将其亚克隆入pUC18质粒载体中,用双脱氧核苷酸末端终止法测定插入片段的核苷酸序列.测序后与GenBank中的核苷酸序列进行同源性分析.结果经3次筛选,从cDNA文库中克隆出一个阳性克隆,测序后其长度为546 bp,含有一个开放读码框,编码158个氨基酸.同源序列分析结果表明此基因片段与编码猪囊尾蚴的一种免疫原性蛋白基因(NC-9)同源性高达99%.结论本研究克隆出一种编码猪囊尾蚴蛋白抗原的基因.     

应用噬菌体展示技术筛选原发性肝癌血清结合蛋白

目的:通过筛选原发性肝癌血清蛋白结合蛋白,探究肝癌的分子发病机制.方法:应用噬菌体展示技术,以肝癌患者的血清作为固相筛选分子,对T7 Select噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选过程,经噬斑的聚合酶链式反应(PCR)扩增后,对阳性PCR产物直接进行序列测定和同源性分析.结果:噬菌体经富集后,随机挑取48个噬斑进行PCR扩增,得到5种大小不同的PCR片断,序列测定后经序列同源性分析,结果发现与肝癌患者血清蛋白结合的蛋白有以下5种:人核仁螺旋体磷酸化蛋白NOLC1,人高度迁移基核小体结合域1(HMGN1),人依赖ATP的DNA连接酶1(LIG1),人小EDRK-丰富因子2(SERF2)和A-kinase anchor protein 9 isoform.结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了肝癌血清蛋白结合蛋白,为进一步阐明肝癌的发生及发病机制奠定了基础.     

噬菌体表面展示技术筛选隐源性肝炎血清蛋白结合蛋白

目的:通过筛选隐源性肝炎血清蛋白结合蛋白,为隐源性肝炎的发病机制研究探索新途径.方法:应用噬菌体表面展示技术,将隐源性肝炎患者血清作为固相筛选蛋白,用噬菌体正常人肝细胞T7cDNA文库进行5轮生物筛选,经噬斑PCR,对筛选克隆进行DNA序列分析,将推断的氨基酸序列在蛋白质库中进行搜索,自GenBank中获得结合蛋白的cDNA和基因组的全长序列,然后再探讨该蛋白在隐源性肝炎发病机制中的作用.结果:噬菌体经过5轮生物富集后,从随机筛选的60个克隆中得到24个阳性克隆,经序列测定后进行同源搜索,初步确定人类HCVNS5A转化调节蛋白13(NS5ATP13)为人体肝脏中固有的与隐源性肝炎血清蛋白结合的蛋白.结论:应用T7cDNA噬菌体表面展示技术,我们发现隐源性肝炎血清蛋白与人类肝细胞HCVNS5A转化调节蛋白13相互作用,在隐源性肝炎发生及抗病毒治疗有重要意义.     

应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒DNAPTP1的反式调节基因

目的:应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆乙型肝炎病毒DNAPTP1反式激活的新型靶基因．方法:以HBV DNAPTP1表达质粒pcDNA3．1(-)- DNAPTP1 转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建 cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析．结果:成功构建DNAPTP1反式激活基因差异表达的cDNA 消减文库．文库扩增后得到60个白色克隆,经菌落PCR分析,得到32个200-1 000 bp插入片段．对所得片段测序,并进行同源性分析,获得3个差异表达的已知蛋白基因和4个未知功能的染色体序列．结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了DNAPTP1可能存在的调控机制的线索．     

应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活的相关基因

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(pre-S1)反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆前-S1反式激活相关基因,以期发现前-S1蛋白反式激活作用的靶位点,为阐明前-S1蛋白的反式激活作用的分子生物学机制,以及HBV相关肝细胞癌(Hcc)形成的分子生物学机制开辟新的研究方向。方法以HBV前-S1表达质粒pcDNA3．1(-)-preS1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌DH5a进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果文库扩增后得到67个阳性克隆,经菌落PCR分析,得到51个200～1000bp插入片段。对所得片段测序,并进行同源性分析,获得32种编码基因,其中26个为已知功能基因,另外6个为未知功能序列,可能是前-S1蛋白反式激活新的靶基因。结论成功构建HBV前-S1反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础。为进一步阐明前-S1蛋白反式调节作用及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法。     

酵母双杂交体系筛选乙型肝炎病毒前S1蛋白相关蛋白

目的 利用酵母双杂交体系筛选乙型肝炎病毒前S1(PreS1)蛋白相关蛋白,进一步探讨PreS1在乙型肝炎病毒(HBV)人胞中的作用机制。方法 以HBV DNA阳性血清为模板扩增含EcoRⅠ与PstⅠ酶切位点的PreS1基因序列,pAS2—1载体及PreS1基因PCR产物经双酶切并连接,对饵载体pAS2—1—PreS1进行序列测定;将pAS2—1—PreS1转化入酵母菌AH109,以western blot法证实其在酵母细胞中的表达。将pAS2—1—PreS1及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞,通过选择性培养、LacZ活性测定筛选阳性菌落,分离实验及交合实验排除假阳性,扩增阳性克隆的目的基因并进行序列测定,结果提交BLAST程序,在GenBank数据库查询其同源序列。结果 饵载体pAS2—1—PreS1经序列测定含有完整的PreS1基因片段,western blot证实转化的酵母细胞能正确表达完整的PreS1—BD融合蛋白。pAS2—1—PreS1与正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞后,选择性培养共长出97个菌落,筛选出1个阳性克隆,其PCR扩增产物经GenBank数据库查询与人类初期多肽相关复合体α亚单位(NACA)高度同源。结论 成功构建了pAS2-1-PreS1饵载体,并通过酵母双杂交体系筛选出肝细胞内与PreS1相互作用的蛋白NACA。     

日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因的克隆和鉴定

目的　从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选并克隆日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因。　方法　用ABC ELISA法从日本血吸虫病流行区筛选出高水平抗血吸虫成虫抗原IgE抗体的个体 15人 ,采集血清并混合。混合血清经Protein G柱吸收后 ,用于日本血吸虫成虫cDNA文库的免疫学筛选。PCR扩增阳性克隆插入cDNA片段。序列分析后 ,于该序列第一开读框两端设计引物并分别引入EcoRⅠ和NotⅠ位点 ,PCR扩增并纯化目的基因片段后克隆入质粒载体pGME T ,再亚克隆入表达载体pGEX 6p 1。经IPTG诱导表达 ,对表达产物进行SDS PAGE和Westernblotting鉴定。　结果　阳性克隆插入片段约 12 0 0bp ,第一开读框长 5 0 7bp ,编码 16 9个氨基酸 ,理论分子量为 19 3kDa。DNA序列分析显示 ,与已知序列同源性小于 4 0 %。重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B能高效表达融合蛋白 ,且能被日本血吸虫特异性IgE抗体识别。　结论　成功构建的重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B ,Sj4 3B可编码日本血吸虫特异性IgE抗体相关抗原     

一种新的猪囊尾蚴蛋白的cDNA分子筛选、序列分析和克隆

目的免疫学筛选猪囊尾蚴cDNA文库,为猪囊尾蚴病临床免疫学诊断提供新的候选抗原分子。方法利用脑囊尾蚴病人血清免疫学筛选猪囊尾蚴cDNA文库,获得阳性克隆,经PCR技术扩增噬菌体载体中插入的cDNA片段,测序后与生物信息网站进行分析,并将一个类似血吸虫核糖体蛋白的基因克隆入PMD-18T载体。结果从cDNA文库中筛选出1个编号为5H的基因,长度是528bp;对其编码的氨基酸序列的分析显示其与日本血吸虫的L18a核糖体蛋白具有高度同源性。结论克隆了猪囊尾蚴的未知核糖体蛋白基因。     

截短型HBsAg中蛋白反式激活基因的克隆

目的：应用抑制性消减杂交技术构建乙型肝炎病毒（HBV）截短型中蛋白（MHBs^t)反式 激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HBV截短型中蛋白反式激活相关基因。方法：以HBV截短型中蛋白表面质粒pcDNA3.1(-)-Tt167转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(-）为对照；制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经Rsa I酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应（PCR），将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果：成功构建人HBV截短型中蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到94个白色克隆，进行菌落PCR分析，均得到200－800bp插入片段。挑取50个插入片段测序，并通过生物学信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得23种编码基因，包括19种已知基因的4种未知基因。结论：筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、免疫应答及肿瘤发生密切相关的蛋白编码基因，因此可能是HBV截短型中蛋白反式激活靶基因。     

应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选HBV XTP12蛋白反式激活基因的上调基因

目的 克隆并筛选乙型肝炎病毒(HBV)反式激活基因XTP12的上调基因,了解其可能存在的调节功能.方法 应用抑制性消减杂交技术克隆并筛选XTP12反式激活的新型靶基因.以XTP12表达质粒pcDNA3.1(-)-XTP12转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果 成功构建人XTP12反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到68个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000 bp插入片段.随机挑选其中28个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果 共获得28种编码基因,其中26种为已知基因编码蛋白,2种为未知功能的新基因.结论 筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞牛长调节、物质代谢、免疫及肿瘤等密切相关的蛋白编码基因,推测了XTP12可能存在的调控机制的线索.     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶N末端蛋白基因芯片研究

目的:检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶N末端蛋白(TP) 的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TP在乙型肝炎陧性化及致肝细胞癌发生发展过程中的分子生物学机制. 方法:根据AF384372 HBVDNA病毒株序列设计、合成HBV DNA P-TP基因序列特异性的引物,以含有AF384372HBVDNA P全基因组cDNA的质粒G318A7作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TP蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HBV DNA-TP 编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定, 构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TP.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析. 结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有TP蛋白的表达,提取高质量的mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA 芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有111 个基因表达水平显著上调,88个基因表达水平显著下调. 结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HBV DNA P-TP转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TP蛋白致病的分子生物学机制提供依据.