M3R介导逼尿肌细胞收缩的信号传导途径的实验研究

目的 探讨M3R介导逼尿肌细胞收缩的信号传导途径。方法 MR非选择性的激动剂（carbachol)、拮抗剂（atropine)及M2R拮抗剂（methoctramine)、M3R拮抗剂（4－DAMP）刺激原代培养人逼尿肌细胞，通过[^3H]掺入法，检测磷脂酰肌醇（PI）的代谢产物[^3H]-IP含量。结果 [^3H]-IP的含量随carbachol刺激浓度的增加而增加；atropine和4－DAMP能显著抑制carbachol诱导的代谢反应（P＜0.01)，而methoctramine不能显著抑制carbachol的作用；atropine与4－DAMP的作用相比无显著性差异（P＞0.05)。结论 M3R与PI分解及信号分子密切相关。     

Relationship between PI decomposition and M3R expression in human cultured detrusor muscle cells

Objective: To study the relationship between the expression of muscarinic receptor subtype M_3R and thedecomposition of phosphatidylinositol(PI). Methods: The[~3H]-IP contents were detected with[~3H]incorporationin human cultured detrusor muscle cells after being stimulated by carbachol, atropine, methoctramine, and 4-DAMP,respectively. Results: The [~3H]-IP contents m increased with the elevation of carbachol concentration. Both atro-pine and 4-DAMP significantly inhibited the effect of carbachol on PI decomposition (P<0.01), but methoctramine     

Ca2+-CaM在M3R介导逼尿肌细胞收缩中作用的实验研究

目的探讨Ca2+-CaM在M3R介导逼尿肌细胞收缩中作用.方法将原代培养逼尿肌细胞分为实验组和对照组,接种于6孔培养板上培养,加入10-4mol/L carbachol 和methoctramine ,采用Ca2+浓度和CaM活性检测试剂盒分别测定Ca2+浓度和CaM活性.结果实验组中,[Ca2+]i和CaM的平均通道荧光对数值分别为(3.26±0.38)和(2.87±0.34),与对照组[分别为(2.06±0.12)、(2.14±0.24)]相比,均有显著性的升高(P<0.05).结论 Ca2+-CaM信号传导途径参与了M3R介导逼尿肌细胞收缩调节过程.     

膀胱梗阻大鼠逼尿肌不稳定与三磷酸肌醇关系的实验研究

目的探讨膀胱梗阻大鼠逼尿肌不稳定(detrusor instability ,DI)与三磷酸肌醇[inositol(1,4,5)-trisphosphat ,IP3]含量变化的关系.方法建立DI大鼠模型,分别检测DI大鼠、逼尿肌稳定(detrusor stability, DS)大鼠及经卡巴可(Carbachol) 处理的DS大鼠逼尿肌原代培养细胞IP3含量.结果DI大鼠逼尿肌原代培养细胞IP3含量显著高于DS大鼠(P＜0.01),经10-5mmol/L卡巴可刺激后,DS 大鼠逼尿肌原代培养细胞IP3含量较刺激前显著升高(P＜0.01).结论肌醇脂质信号传导通路可能参与了逼尿肌不稳定的形成,IP3含量的升高可能在其中起着重要作用.     

IP3R介导的钙释放在DI发生中的作用研究

目的探讨IP3R的功能改变是否参与了逼尿肌不稳定(DI)的发生。方法对比分析DI和对照组大鼠膀胱平滑肌IP3R mRNA和蛋白表达的变化,观察IP3R阻断剂Heparin对DI和对照组膀胱平滑肌条收缩幅度和频率的影响。结果 DI逼尿肌细胞IP3RmRNA和蛋白表达较对照组显著增加。IP3R阻断剂Heparin能显著抑制DI、正常组大鼠逼尿肌肌条自发收缩频率及收缩幅度,且Heparin对DI逼尿肌条的影响效应要显著高于正常组。结论 IP3R功能在DI逼尿肌组织兴奋、收缩发生中明显上调,这种上调在DI的发生中起着重要作用。     

M_3受体激动剂胆碱对大鼠心肌细胞内钙离子的影响

目的研究M3受体激动剂胆碱对大鼠心肌细胞内钙离子的影响。方法采用钙荧光染料Fluo-3/AM负载心肌细胞,在激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)上测定细胞[Ca2+]i的变化。结果胆碱不影响静息状态下的细胞[Ca2+]i,对咖啡因和三磷酸肌醇(IP3)介导的细胞内钙的释放均无作用。5.0 mmol/L胆碱可以抑制KCl除极诱导的心肌[Ca2+]i的升高幅度,2.0 nmol/L 4-DAMP可以阻断这一作用。结论 M3受体激动剂胆碱通过阻断心肌细胞膜电压依赖性钙通道降低心肌细胞[Ca2+]i,从而发挥心肌保护作用。     

磷脂酰肌醇3-激酶对血管紧张素与胰岛素Ⅱ诱导的血管平滑肌肥大的介导作用

目的　研究磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K)信号通路对血管紧张素 (Ang )与胰岛素诱导的血管平滑肌细胞蛋白质合成的影响 ,及该信号系统对 4 E结合蛋白 1(4 E- BP1)和核糖体蛋白 S6激酶磷酸化的介导作用。　方法　体外培养 8周龄的 SD大鼠平滑肌细胞 ,(1) 3H亮氨酸掺入法测定蛋白合成 ;(2 ) Western印迹法检测蛋白激酶 B(PKB)、4 E- BP1和核糖体蛋白 S6激酶的磷酸化。　结果　 (1)与对照组相比 ,Ang (10 0 nmol/ L )与胰岛素 (10 0 nm ol/ L )对血管平滑肌细胞的 3H亮氨酸掺入有显著刺激作用 [Ang (× 10 3cpm) :8.0 0± 0 .5 4 vs 5 .15± 0 .2 6 ,P<0 .0 5 ;胰岛素 :6 .13± 0 .31vs5 .0 5± 0 .35 ,P<0 .0 5 ]。 PI3K抑制剂 L Y2 94 0 0 2使 Ang 的 3H亮氨酸掺入刺激作用受到抑制 ,抑制率 :0 .1μmol/ LL Y2 94 0 0 2 :38% (P<0 .0 5 ) ;1μmol/ L L Y2 94 0 0 2 :6 2 % (P <0 .0 5 )。同样浓度的 L Y2 94 0 0 2对胰岛素的 3H亮氨酸掺入刺激作用的抑制率分别为 4 3% (P<0 .0 5 ) ,5 7% (P<0 .0 5 ) ,97% (P<0 .0 5 )。(2 )静止的血管平滑肌细胞中加入 Ang 或胰岛素 ,显著增加 PKB的磷酸化。Ang 刺激的 PKB磷酸化于 5 m in达高峰 ,胰岛素刺激的 PKB磷酸化于 30 m in达高峰。PKB抑制剂 L Y2 94 0 0 2以剂量     

磷脂酰肌醇-3-激酶p55γ-N末端24个氨基酸对体外培养HaCaT细胞增殖的影响

目的 观察磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的调节亚单位p55γ-N末端24个氨基酸抑制人永生化角质形成细胞系HaCaT细胞增殖的作用.方法 构建含有PI3K-p55γ-N末端24个氨基酸的腺病毒载体AD-N24-GFP及对照病毒AD-GFP,感染HaCaT细胞,流式细胞仪检测细胞周期进程,应用BrdU/PI双掺入法检测其对细胞DNA合成的影响,CFDA-SE(细胞增殖示踪荧光探针)标记法检测细胞增殖情况.结果 AD-N24能有效阻滞HaCaT细胞周期进程于G 0/G 1期,S期和G 2/M期细胞减少,AD-N24-GFP组各期细胞分布为:G 0/G 1期(84.18±1.73)%,S期(7.60±1.47)%,G 2/M期(8.22±1.33)%,而AD-GFP组各期细胞分布为:G 0/G 1期(61.14±2.76)%,S期(24.54±1.29)%,G 2/M期(14.32±1.61)%,空白对照组各期细胞分布为:G 0/G 1期(65.78±2.11)%,S期(22.22±1.92)%,G 2/M期(12.00±1.19)%,AD-N24-GFP组与AD-GFP组及空白对照组间G 0/G 1期和S期细胞比例的差异有显著性意义(P ＜0.05);BrdU阳性细胞比例显示:AD-N24-GFP组R2为:(5.89±1.33)%,AD-GFP组R2为:(27.09±2.61)%,空白对照组R2为:(24.91±2.04)%,提示AD-N24能有效抑制HaCaT细胞的DNA合成;CFDA-SE检测显示AD-N24-GFP组增殖指数(PI)为:(33.60±2.52),AD-GFP组PI为:(52.47±4.41),空白对照组PI为:(55.29±7.61),提示AD-N24能有效抑制HaCaT细胞的增殖.结论 在HaCaT细胞中过表达N24能有效阻滞HaCaT细胞周期进程,干预其细胞DNA合成,抑制其细胞增殖.     

三磷酸肌醇变化与逼尿肌不稳定关系的研究

【目的】探讨大鼠逼尿肌组织三磷酸肌醇[Inositol（1,4,5）-trisphosphate,IP门变化与逼尿肌不稳定（Detrusorinstabilitv,DI）的关系。【方法】建立DI大鼠模型,分别检测DI大鼠,逼尿肌稳定（detrusorstability,DS）大鼠及经卡巴可（Carbach01）处理的Ds大鼠逼尿肌原代培养细胞IP,含量。应用逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测DI及DS大鼠逼尿肌组织三磷酸肌醇受体（1nositol（1,4,5）-trisphosphatereceptor,IP3R）亚型变化。【结果】DI大鼠逼尿肌原代培养细胞IP3含量显著高于Ds鼠（P〈0．01）,经105 mmolflcarbachol刺激后,DS大鼠逼尿肌原代培养细胞IP3含量较刺激前显著升高（P〈0．01）。DS及DI大鼠膀胱逼尿肌组织均有IP3RI、Ⅱ、Ⅲ亚型表达,DI大鼠IP,RI、Ⅱ亚型表达显著高于DS大鼠（P〈0．05）,IP,RⅢ亚型表达差异无统计学意义（P〉0．05）。【结论】肌醇脂质信号传导通路可能参与了逼尿肌不稳定的形成,IP3含量的增高及IP3RI、Ⅱ亚型表达增强可能在其中起着重要作用。     

阿托品对人视网膜色素上皮细胞D407株 表达及分泌TGF β2的调控

目的：通过观察不同浓度阿托品联合10-5 mol/L卡巴胆碱干预下D407细胞表达及分泌TGF β2的变化,探讨阿托品对RPE细胞表达及分泌TGF β2的调控作用。方法：常规培养D407细胞,药物干预前换用无血清培养基培养, 分为4组。（1）实验组（A组）：A1~A5组依次加入10-4～10-8 mol/L阿托品,孵育30 min后每组加入10-5 mol/L卡巴胆碱;（2）阴性对照组（B组）：B1~B5组依次加入10-4～10-8 mol/L阿托品;（3）阳性对照组（C组）：加入10-5 mol/L卡巴胆碱;（4）空白对照组（D组）：不加药物。干预24 h后采用RT PCR,Western印迹及ELISA法检测细胞胞浆中TGF β2 mRNA及蛋白质的表达水平及上清液中TGF β2的含量。统计学方法采用单因素方差分析。结果：实验组D407细胞胞浆TGF β2 mRNA和蛋白质表达水平及上清中TGF β2蛋白质含量均较阳性对照组低,10-4 mol/L阿托品可完全阻断10-5 mol/L卡巴胆碱上调TGF β2表达及分泌的作用,其效应具有浓度依赖性（F=1 056.897, 1 320.170, 475.657;P＜0.001）。阴性对照组D407细胞胞浆TGF β2 mRNA和蛋白质表达水平及上清中TGF β2蛋白质含量与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：阿托品可有效抑制卡巴胆碱促进人RPE细胞表达及分泌TGF β2的功能,提示M受体参与介导此过程。     

Involvement of M3 cholinergic receptor signal transduction pathway in regulation of the expression of chemokine MOB-1, MCP-1 genes in pancreatic acinar cells

Summary Whether M3 cholinergic receptor signal transduction pathway is involved in regulation of the activation of NF-κB and the expression of chemokine MOB-1, MCP-1 genes in pancreatic acinar cells was investigated. Rat pancreatic acinar cells were isolated, cultured and treated with carbachol, atropine and PDTCin vitro. The MOB-1 and MCP-1 mRNA expression was detected by using RT-PCR. The activation of NF-κB was monitored by using electrophoretic mobility shift assay. The results showed that as compared with control group, M3 cholinergic receptor agonist (10⁻³ mol/L, 10⁻⁴ mol/L carbachol) could induced a concentration-dependent and time-dependent increase in the expression of MOB-1, MCP-1 mRNA in pancreatic acinar cells. After treatment with 10⁻³ mol/L carbachol for 2 h, the expression of MOB-1, MCP-1 mRNA was strongest. The activity of NF-κB in pancreatic acinar cells was significantly increased (P<0.01) after treated with M3 cholinergic receptor agonist (10⁻³ mol/L carbachol)in vitro for 30 min. Either M3 cholinergic receptor antagonist (10⁻⁵) mol/L atropine) or NF-κB inhibitor 10⁻² mol/L PDTC) could obviously inhibit the activation of NF-κB and the chemokine MOB-1, MCP-1 mRNA expression induced by carbachol (P<0.05). This inhibitory effect was significantly increased by atropine plus PDTC (P<0.01). The results of these studies indicated that M3 cholinergic receptor signal transduction pathway was likely involved in regulation of the expression of chemokine MOB-1 and MCP-1 genes in pancreatic acinar cellsin vitro through the activation of NF-κB. ZHENG Hai, male, born in 1972, M. D., Ph. D.     

早期骶3神经电调节在脊髓损伤后神经源性膀胱治疗中的应用及作用机制分析

目的探讨早期骶3神经电调节在大鼠脊髓损伤后神经源性膀胱治疗中的应用及可能作用机制。方法将45只雌性成年SD大鼠随机分为正常组、电针治疗组、电针对照组,每组15只。采用脊髓横断法建立大鼠神经源性膀胱的模型。,电针对照组与电针治疗组造模成功后均进行电极植入;电针治疗组进行电调节治疗,1次／d,连续治疗4周;正常组常规饲养。3组大鼠在电针治疗组治疗4周后均行尿动力学测定,同时处死取材,采用免疫荧光定量PCR方法测定M3受体mRNA表达水平。结果尿动力学结果显示在膀胱最大容量、膀胱漏尿点压、膀胱顺应性指标中,电针治疗组与电针对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。荧光定量PCR结果显示,电针治疗组膀胱M3R的mRNA含量明显高于电针对照组和正常组,差异有统计学意义（P〈0．05或0.01）。结论早期骶3神经电调节可以明显改善脊髓损伤后神经源性膀胱储尿和排尿功能的恢复,其作用机制可能是电调节促进脊髓损伤早期膀胱逼尿肌组织中M3R的高表达,抑制逼尿肌纤维化,改善膀胱顺应性。     

三磷酸肌醇对大鼠逼尿肌细胞内钙影响的激光共聚焦显微镜观察

目的探讨三磷酸肌醇(IP3)/Ca2 信号转导过程与逼尿肌细胞内游离Ca2 浓度[(Ca2 )I]的关系.方法建立逼尿肌不稳定(DI)大鼠模型,利用激光共聚焦显微镜观察原代培养的逼尿肌稳定(DS)及DI大鼠逼尿肌细胞内钙荧光强度的变化以及10-5mol/L IP3影响DS大鼠逼尿肌培养细胞后细胞内钙荧光强度在有钙液及无钙液中的变化情况.结果DI大鼠逼尿肌培养细胞内钙荧光强度较DS大鼠显著增强(P＜0.01),经10-5 mol/L IP3处理后,DS大鼠逼尿肌培养细胞内钙荧光强度较处理前显著增强(P＜0.01),且有钙液中细胞内钙荧光强度显著高于无钙液中细胞(P＜0.01).结论由IP3激活引起的逼尿肌细胞内游离钙浓度的升高可能是DI发生的重要原因之一.     

趋化因子IP10抑制乳腺癌细胞4T1播散转移的研究

目的观察增强IP10在肿瘤局部的表达对乳腺癌细胞4T1远端播散转移的作用。方法用电转染的方法建立稳定表达IP10的4T1细胞株IP10-4T1。将BALB/c小鼠分为IP10-4T1细胞组、4T1细胞组和转染pcDNA3的4T1细胞组(pcDNA3-4T1)。利用实验性肺转移模型和体外杀伤实验研究接种IP10-4T1对4T1细胞播散转移的影响。结果IP10-4T1细胞中IP10mRNA转录水平相对含量为0.92±0.12与未转染的4T1细胞(0.35±0.12)和pcDNA3-4T1细胞(0.29±0.08)比较差异有统计学意义(P<0.01)。IP10-4T1组对淋巴细胞的趋化指数为2.77±0.29,经CXCR3抗体处理后下降为1.71±0.20(P<0.05)。实验性肺转移结果显示,IP10-4T1组小鼠肺重为0.27g±0.02g,与4T1细胞组(0.48g±0.08g)和pcDNA3-4T1组(0.43g±0.16g)比较明显减轻(P=0.021);其肺表面形成的转移结节数较对照组少;IP10-4T1组肺组织中形成的4T1细胞克隆数为2.6±1.7,明显低于4T1组(34.0±6.3)和pcDNA3-4T1组(33.0±2.3,P<0.05);2/6的IP10-4T1组小鼠肺组织内可见转移灶,而对照组全部形成肺转移灶。接种IP10-4T1细胞组小鼠的淋巴细胞杀伤率在各个效/靶比均高于对照组(P<0.05)。结论增加肿瘤局部IP10的表达,能增强机体细胞免疫应答水平,通过肿瘤特异性的杀伤作用,抑制肿瘤细胞在体内播散转移。     

钙通道激动剂BayK8644在兔肺缺血 再灌注损伤中的保护作用

目的：探讨BayK8644预处理对家兔肺缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。方法：40只健康成年清洁级大白兔随机分为假手术组（Sham组）、缺血再灌注损伤组(I/R组)、缺血预处理组（IP组）、BayK8644预处理组（BayK8644组）,每组10只。实验后检测肺湿/干重比（wet to dry weight ratio,W/D）、肺组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)含量,并观察肺组织形态学变化、超微结构改变以及检测肺组织中肺泡表面活性物质相关蛋白-A（pulmonary surfactant-associated protein-A,SP-A）的表达水平。结果：与I/R组相比,BayK8644组与IP组W/D,MDA,MPO含量均降低（均P<0.05）,SOD活性及SP-A表达均升高（均P<0.05）,肺组织病理损伤变化均较I/R组轻。BayK8644组与IP组相比较,各项指标差异无统计学意义(均P>0.05)。结论：对于预处理时期有针对性地使用钙通道激动剂BayK8644可增加钙离子内流,对缺血再灌注有一定的肺保护作用,可模拟缺血预处理的内源性保护作用。