大鼠面神经损伤后神经营养因子-4的动态表达

目的研究大鼠面神经损伤后NT-4在面神经、触须肌以及面神经核团中表达的动态变化规律。方法以30只Wistar大鼠建立面神经骨管内挤压伤模型,分别于建模后1、3、7、14、21d取大鼠面神经、触须肌、以及脑桥组织并提取总RNA和蛋白,采用RT-PCR和Western-Blot技术检测不同时段NT-4的表达变化,应用免疫组织化学方法观察其表达部位。结果正常的大鼠面神经、触须肌以及脑桥中均有少量的NT-4表达;NT-4在面神经损伤后大鼠的面神经和面神经核团中表达逐渐增高,并且于第14天达到高峰,随后下降;NT-4的表达变化趋势在mR-NA和蛋白水平一致。在触须肌中,NT-4的表达量逐渐减少,于第14天降至最低,并维持较低水平。结论面神经损伤后,NT-4在神经束和核团神经元细胞中的表达呈现出先升高后下降的动态趋势,而在面神经所支配的肌肉组织中的表达逐渐降低,提示神经组织中NT-4的表达水平和面神经损伤密切相关。     

神经营养素-3基因转染神经干细胞的实验研究

目的：用神经营养素-3（NT-3）基因修饰神经干细胞,并观察在转染后的神经干细胞内的表达情况,为进一步的研究奠定基础。方法：采用阳离子脂质体介入法,将含绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒表达载体pAd—NT—3转染原代培养的神经干细胞,观察GFP及NT-3两种蛋白的表达,镜下测定转染率,采用免疫组化和逆转录酶-多聚酶链反应（RT-PCR）方法进行鉴定。转染后的神经干细胞经G418筛选,获得成功转染NT-3基因的NSCs克隆。结果：镜下观察到绿色荧光蛋白长期表达在转染后的神经干细胞,转染率可达40％。免疫组化和RT-PCR结果显示NT-3在转染后的神经干细胞可以长期表达。结论：NT-3基因,通过腺病毒的介导,以阳离子脂质体为载体,可有效的转染培养的神经干细胞并长期表达。     

超声微泡对碱性成纤维生长因子转染大鼠损伤面神经的修复作用研究

目的 应用超声微泡介导碱性成纤维生长因子(bFGF)基因进行受损面神经(大鼠模型)修复,研究其可行性及有效性.方法 将40只SD大鼠制作面神经损伤模型,并分成4组,每组10只;A组:bFGF+超声+微泡组;B组:bFGF+微泡组;C组:bFGF+超声组;D组:单纯手术组(PBS).于bFGF基因转染后第1、10、20、28天,观察各组大鼠一般状况,检测损伤面神经传导速度、潜伏期及动作电位波幅.提取损伤处面神经组织后采用RT-PCR检测mRNA的表达,Western blot检测bFGF蛋白表达.结果 转染后第20天,A组大鼠术侧有少量胡须可观察到细微摆动;转染后第28天,A组大鼠一般状况较B、C、D3组恢复得更好.A组面神经损伤后修复的神经电生理表现优于B、C、D3组;A组bFGF mRNA和蛋白表达量明显高于B、C、D3纽(P＜0.05).结论 超声微泡介导bFGF有助于面神经损伤的修复.     

阳离子脂质体介导神经营养因子-3在大鼠雪旺细胞中的表达

目的观察阳离子脂质体转染神经营养因子-3（Neurotrophin-3,NT-3）基因在大鼠雪旺细胞（schwann cell,SC）的表达和提高SC细胞分泌NT-3的能力。方法采用阳离子脂质体介入法,将脂质体转染酶介导的NT-3转染至SC细胞,以转染后及未转染作为实验组和对照组,于转染后1、2、4、8周用ELISA双抗体夹心法测定NT-3蛋白的表达,采用DNA酶切鉴定转染后NT-3的DNA,免疫组化S-100染色法检测转染前后SC纯度。电镜下观察转染后SC细胞结构。结果转染后2、4、8周NT-3蛋白表达量与转染前比较差异有统计学意义（P〈0.05）。转染后NT-3的DNA酶切鉴定结果与NT-3基因片段相符。转染前后SC纯度分别为（94.1±2.3）%及（95.8±2.1）%,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 NT-3基因可转染培养的SC并高效表达。SC作为受体细胞易于获取并能在体外大量培养繁殖,能较长时间稳定大量表达所携带基因而不衰减。     

GDNF基因体内转染对大鼠脊髓损伤后轴突再生的影响

目的：研究脂质体介导的胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）基因在大 鼠损伤脊髓内的表达,观察外源性GDNF对损伤脊髓轴突再生的作用。方法：利用Nystrom法制备大鼠胸髓压迫损伤模型。以直接注射法将脂质体DC－Chol和重组质粒pEGFP－GDNF cDNA混合后注入大鼠损伤脊髓。采用RT－PCR技术和荧光显微镜检测GDNF基因转染后的体内表达,并通过辣根过氧化酶（HRP）顺行追踪技术和神经微丝（NF）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组化活性的变化来评价GDNF基因转染对轴突再生的影响。结果：经脂质体DC－Chol介导GDNF基因可有效地转染脊髓组织 中并得到表达。GDNF转基因4周后可明显增加NF阳性轴突数目,促进皮质脊髓束再生并通过损伤区。结论：外源性GDNF在损伤区局部高表达具有神经损伤保护作用,提示阳离子脂质体介导GDNF体内转基因治疗创伤性脊髓损伤的方法是可行的。     

GDNF基因转染诱导神经干细胞向神经元分化的作用

目的探索转染GDNF基因到大鼠神经干细胞(neural stemcell,NSC)的方法,并研究其诱导大鼠神经干细胞向神经元和多巴胺能神经元分化的作用。方法体外扩增GDNF基因,并构建带有绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体PcDNA3-GDNF-GFP质粒。悬浮培养大鼠胚胎神经干细胞,脂质体介导PcDNA3-GDNF-GFP质粒转染神经干细胞,荧光显微镜观察转染及表达情况;免疫细胞化学鉴定β-微管蛋白Ⅲ(β-Tubulin III)和酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH),以确定神经干细胞的分化为神经元和多巴胺能神经元情况。结果转染后72 h,荧光蛋白大量表达。脂质体介导PcDNA3-GDNF-GFP质粒转染神经干细胞后,神经干细胞分化为神经元和多巴胺神经元的比例明显增高。结论脂质体介导GDNF基因转染神经干细胞的方法简单、有效,是一较为理想的基因转染方法。GDNF基因能明显促进神经干细胞分化为神经元和多巴胺神经元的比例。     

羟基磷灰石纳米颗粒介导NT-3基因对豚鼠兴奋毒性损伤耳蜗的保护作用

目的:利用羟基磷灰石纳米颗粒(hydroxyapatite nanoparticle, HAT)携带构建的神经营养因子-3 (neurotrophic factor-3,NT-3)-绿色荧光蛋白基因(enhancement type Green fluorescent protein C2, pEGFPC2),通过耳蜗灌注方法转染兴奋毒性损伤后的豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞(spinal ganglion cells,SGCs),观察pEGFPC2-NT3的表达及其对耳蜗螺旋神经节细胞的保护作用.方法:构建携带绿色荧光蛋白报告基因的重组质粒pEGFPC2-NT3.通过耳蜗灌注海人酸(kainic acid,KA)建立豚鼠耳蜗兴奋性损伤模型,在给KA 1周后利用HAT携带重组质粒进行耳蜗灌注以转染耳蜗螺旋神经节细胞,免疫组化法观察转染后1周NT-3的表达及4周后电镜下螺旋神经节细胞形态学变化,同时观察对听觉脑干诱发电位(auditory brain-stem response,ABR)的影响.结果:成功构建豚鼠耳蜗兴奋损伤模型.灌注重组质粒后1周免疫组化法观察到螺旋神经节细胞胞浆内NT-3蛋白表达.4周后电镜下螺旋神经节细胞形态学损害减轻,ABR检测听功能较兴奋毒性损害后有恢复.结论:在豚鼠耳蜗灌注KA造成耳蜗兴奋性损伤后第7天,经耳蜗鼓阶转染羟基磷灰石纳米颗粒介导的NT-3基因仍可减轻KA对耳蜗螺旋神经节细胞的兴奋性毒性损伤.     

自主构建壳聚糖神经导管对大鼠面神经缺损的修复作用

目的 应用南通大学神经再生重点实验室自主构建的壳聚糖人工神经导管桥接修复模型大鼠面神经缺损,评价其在面神经功能恢复及再生中的作用.方法 24只大鼠分为3组,每组8只,建立大鼠右侧面神经上颊支缺损模型,分别采用自体神经翻转桥接(自体神经组)、壳聚糖神经导管桥接(壳聚糖组)和离断旷置处理(离断组).运用触须运动评分评估处理后2、4、6、8、10、12周3组大鼠面神经相应支配功能恢复情况,免疫组织化学双染法及透射电镜观察对侧正常神经及处理后12周大鼠造模侧神经的髓鞘与轴突的直径、厚度及层数.结果 触须运动评分经广义线性混合效应模型(GLMMs)分析后,分组及时间主效应有统计学意义(P＜0.05),分组和时间的交互效应有统计学意义(P＜0.05),自体神经组、壳聚糖组分别于处理后4、6周开始出现触须运动功能恢复表现,术后12周自体神经组、壳聚糖组触须运动功能评分差异无统计学意义(P＞0.05),离断组触须运动功能无恢复;形态学观察和透射电镜显示自体神经组、壳聚糖组均出现再生神经,自体神经组、壳聚糖组与对侧正常神经三者相比有髓神经纤维直径(F=36.734,P＜0.05)、髓壳厚度(F=67.307,P＜0.05)、再生髓壳层数(F=75.213,P＜0.05)差异有统计学意义;壳聚糖组的有髓神经纤维直径、髓壳厚度和再生髓鞘层数与自体神经组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 动物实验结果表明,该壳聚糖人工神经导管具有促进面神经损伤再生和功能恢复的作用,为临床修复除坐骨神经、桡神经等以外的其他组织周围神经的应用研究提供了依据.     

大鼠眶下神经断扎后触须垫的神经支配

目的　观察大鼠眶下神经断扎后触须垫的神经支配变化 ,探讨三叉神经痛患者术后疼痛复发的外周机制。方法　将大鼠随机分成 3组 :第 1组为正常对照组 ,动物不做处理直接将辣根过氧化物酶 (horseradishperoxidase ,HRP)引入触须垫 ;第 2组为即刻引入组 ,将眶下神经断扎后立即将HRP引入触须垫 ;第 3组为 2月组 ,断扎眶下神经 ,2个月后将HRP引入触须垫。结果　同侧半月节中 ,正常对照组、即刻引入组和 2月组分别可见有大量深染的神经元、无染色的神经元及少量淡染的神经元 ;对侧半月节中 ,3组均未见染色的神经元。结论　大鼠眶下神经不跨中线支配 ,眶下神经断扎后 ,同侧未损伤神经可发出分支到失神经支配触须垫。     

腺病毒介导神经营养素-3基因转染施万细胞

【目的】构建神经营养素-3(NT-3)基因转染的施万细胞。【方法】NT-3基因重组腺病毒(AdvNT-3)扩增、纯化和测定后，转染体外培养的施万细胞(SCs)。用免疫细胞化学和ELISA方法分别检测NT-3基因转染SCs的NT-3表达及培养液中NT-3的含量。【结果】实验中获得的AdvNT-3中外源基因序列与大鼠NT-3的DNA序列完全一致，与未基因转染SCs相比，NT-3基因转染SCs的NT-3阳性增强，培养液中NT-3含量增高。【结论】通过腺病毒介导可以获得NT-3过量表达的基因转染SCs。     

神经生长因子修复动眼神经损伤的实验研究

目的 探讨外源性神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对大鼠动眼神经损伤后功能修复的影响.方法 健康S-D大鼠30只均分3组,正常对照组(10只),动眼神经不损伤,其余20只分为两组,均在海绵窦区将动眼神经切断后给予缝合,第一组大鼠每天大剂量靶器官注射外源性神经生长因子,第二组不给NGF作为损伤对照,术后评估神经功能恢复情况并行动眼神经解剖、组织学研究.结果 注射NGF的大鼠动眼神经新生神经纤维数量明显增加(P＜0.01),对上直肌特异性支配作用优异,眼外肌功能恢复满意,但中脑运动神经元数量无明显差别(P＞0.05).结论 神经生长因子对动眼神经损伤后的功能修复有较好的促进作用.     

大鼠面神经切断后其神经元形态变化的研究

目的观察面神经高位切断后其神经元的形态改变．方法建立SD大鼠面神经高位切断模型后行HE、TB和TUNEL染色,观察健侧面神经元及术后1、3周时伤侧面神经元的形态改变．结果健侧和术后1周伤侧面神经元均未见明显凋亡,术后3周伤侧面神经元见明显凋亡．结论面神经损伤后3周可导致伤侧面神经元出现明显凋亡．     

成年及新生大鼠面神经结扎后NADPH-d阳性神经元的不同表达

目的: 研究新生及成年大鼠面神经结扎后,面神经核运动神经元(FMN)NADPH-d阳性细胞的动态变化. 方法: 于新生及成年大鼠茎乳孔处结扎面神经,于3, 7, 14, 21, 28, 56, 84 d采用NADPH-d组织化学方法观察NADPH-d阳性细胞在面神经核中的变化. 并观察NADPH-d阳性细胞与存活神经元之间的关系. 结果: 成年大鼠面神经结扎FMN受损后,3 d～12 wk NADPH-d阳性持续表达. 但是幼年大鼠面神经结扎FMN受损后1 wk,NADPH-d阳性方可在损伤侧观察到,至8 wk则几乎观察不到NADPH-d阳性FMN. 结论: 面神经损伤后,成年及新生大鼠损伤侧NADPH-d阳性FMN数目均有所增加,但是它们在表达时程上显示了不同的模式.     

Study on Remodeling of Astrocytes in Facial Neuclus after Peripheral Injury

To observe the glial reactions surrounding facial motor neurons following facial nerve anastomosis. At 1,7,21 and 60 d following facial nerve anastomosis, the recovery process of facial movement was observed, the glial fibrillary acidic protein （GFAP） immunoreactivity was analyzed by a combined method of fluorescent retrograde tracing and immunofluorescent histochemical staining, and the uhrastructure of astrocytes were observed under a transmission electron microscope （TEM）, respectively. Postoperatively the function of facial muscles could not return to normal, often accompanied with hyperkinetic syndromes such as synkinesis at the late stage. Motor neurons in every facial subnucleus could be retrogradely labeled by fluoro-gold （FG）, and displayed an evident somatotopic organization. Normally there was a considerable number of GFAP-positive cells in nonnucleus regions but few inside the facial nucleus region. Postoperatively the GFAP immunoreactivity in the anastomotic side increased significantly, but gradually decreased at the late stage. The ultrastructure of astrocytes in our experiment showed that the sheet-like process of astrocytes invested and protected the injured facial motor neurons. The present study shows that reactive astrocytes undergo some characteristic changes during the process of facial nerve injury and regeneration. The plastic change at the late stage may be involved in the mechanism of synkinesis.     

环孢素A对异种脱细胞神经移植的影响

目的 研究脱细胞异种面神经移植中环孢素A(cyclosporin A,CSA)的作用效果.方法 48只W istar 大鼠随机选择一侧作为实验侧,解剖面神经后于颊支制造lcm的神经缺损.按神经移植的种类分为4组,A组:异种面神经移植组;B组:异种面神经移植应用CSA免疫抑制组;C组:异种脱细胞神经移植组;D组:异种脱细胞神经移植应用CSA免疫抑制组.各组实验动物分别于术后5周,12周进行电生理学测试(潜伏期、运动神经传导速度),并进行光镜、电镜观察形态学变化.结果 术后5周和12周时,C,D组动物在电生理指标及光镜、电镜指标上均优于A,B组,术后5周和12周,D组面神经颊支传导速度均高于其它各组.结论 1.0 cm缺损的异种脱细胞面神经移植动物实验中,应用CSA5mg/(hg·d)5周可以降低排斥反应,提高神经再生能力.     

骨髓间充质干细胞经BDNF基因修饰后移植治疗大鼠半横断脊髓损伤的电生理研究

目的 采用电生理的研究方法,观察脑源性神经营养因子（BDNF）基因修饰的骨髓间充质干细胞对脊髓损伤的修复作用。方法 随机将大鼠分成 3组：空白组10只( 只切除椎板,暴露脊髓硬脊膜) ;SCI 组10只;SCI术后细胞移植组10只;从以上三组老鼠随机抽取8只于细胞移植后1d、7d、14d、21d、30d、60d进行SEP（皮层体感诱发电位）、MEP（运动诱发电位）等电生理检测技术,并观察大鼠的运动评分恢复程度。结果 脊髓损伤鼠在细胞移植术后3-4天,饮食、活动稍增加,整个肌张力恢复过程：1-4天迟缓性瘫,损伤侧后肢拖行,5-8天痉挛性瘫;8-12天损伤侧下肢恢复少量活动;12-21天损伤侧后肢活动逐渐恢复,30天损伤侧后肢活动能力及肌张力恢复程度最明显,30天以后恢复程度不会有太大变化。通过免疫组织化学研究和行为学观察,表明MSCs细胞移植后能够在脊髓内存活,而且脊髓损伤大鼠的运动功能有所改善。结论 BDNF基因修饰的骨髓间充质干细胞移植后能够有效促进大鼠损伤脊髓神经的再生及部分传导功能恢复。     

眼轮匝肌麻痹酶组织化学与超微结构研究

目的:探讨眼轮匝肌麻痹的发病机制与面神经挫伤后肌肉功能恢复与神经再生的关系。方法:夹持wistar大鼠面神经颞支和颧支,制备眼轮匝肌麻痹模型。采用琥珀酸脱氢酶(SDH)和乙酰胆碱酯酶(AchE)结合染色,显微图像分析、透射电镜技术,观察眼轮匝肌及运动终板酶组织化学与超微结构的动态变化。结果:①眼轮匝肌肌纤维:术后1周直径及SDH含量开始下降,3周末降至最低,4周肌纤维直径及SDH活性开始恢复,5～8周逐渐接近正常。②运动终板:4周面积和AchE活性稍降低。5～7周逐渐下降,8周开始再生,AchE活性恢复。10周时再生运动终板增多,面积增大,AchE活性基本恢复。12周完全恢复正常。③超微结构:3周肌纤维内线粒体空泡变,嵴断裂、消失,肌原纤维间隙增宽,部分肌丝溶解,明暗带不清。4～7周突触后膜接头褶变浅、排列紊乱、局部消失。8～10周逐渐恢复,线粒体增多增大,肌丝排列较规则,突触膜接头褶清晰可见。12周恢复正常,白肌运动终板改变较其它两型明显。结论:眼轮匝肌以快缩纤维白肌为主,白肌纤维对损伤敏感,反应剧烈,恢复晚,故临床上面瘫患者眼部麻痹症状重于口部及其他面肌;其受单侧神经支配,神经纤维直径大,易损伤,程度重,神经功能恢复慢,在面神经挫伤后第12周,眼轮匝肌可重新建立神经与肌肉接头。     

不同程度失神经支配后眼轮匝肌和口轮匝肌的形态学研究

目的:探讨不同程度失神经支配后,眼轮匝肌和口轮匝肌的形态学变化。方法:制作豚鼠面神经总干压榨15s、30s和切断的动物模型,分别于术后1周和1个月取眼轮匝肌和口轮匝肌,应用琥珀酸脱氢酶(SDH)染色,光镜和透射电镜下观察肌肉的形态和超微结构。结果:正常状态下,眼肌中I型纤维占29.51%,II型纤维占70.49%;口肌中只有II型纤维占100%。神经损伤后眼肌的I型纤维向II型纤维转化,当神经功能恢复时,I型纤维百分比又逐渐恢复。同时,SDH含量随损伤加重逐渐减少,随着神经功能恢复SDH含量又逐渐恢复。结论:面肌失神经和恢复神经支配时,肌纤维分型的转化提示肌肉功能的变化;面肌与面神经之间有一致性的变化趋势,提示面肌的病理改变可以成为判断面神经功能状态的科学标准。     

大鼠面神经压榨损伤对面神经核神经元p27蛋白表达的影响

 目的研究p27 在面神经纤维压榨伤后大鼠面神经核中的表达变化及其作用。方法制做成年大鼠面神经压榨伤模型，观察大鼠行为变化，利用免疫组织化学技术观察大脑面神经核运动神经元中p27 蛋白表达的时程变化。结果面神经纤维压榨伤后压榨侧触须垂下，拂动消失，眼睑不能闭合。1 周后面神经功能开始恢复，4 周后完全恢复正常。检测面神经压榨侧6h、12 h、1周、2周、3周、4周等时间点p27 含量均高于正常侧，差异有统计学意义（ P>0.05），而在1 d、2 d、3 d时压榨侧与健侧相比无统计学差异﹙ P>0.05﹚。结论面神经压榨伤后早期p27 升高可能与机体的应激反应有关，晚期p27 升高的机制可能是与其参与损伤神经元的DNA修复有关。