抗乳腺癌人鼠嵌合抗体的构建

目的：构建抗人乳腺癌单克隆抗体人鼠嵌合抗体，降低鼠源性抗体应用于人体的免疫排斥反应。方法：采用RT－PCR技术，从分泌抗人乳腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株CDI315B分离克隆抗体轻重链可变区基因，对其进行序列分析，将连接组建人鼠嵌合轻链和人鼠嵌合重链，然后分别将它们克隆到真核细胞表达载体pcDNA3。结果：构建的人鼠嵌合抗体基因克隆在真核细胞表达载体上。结论：人鼠嵌合抗体的构建为它的表达和临床应用打下基础。     

抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建和表达

目的:构建嵌合型抗人膀胱癌抗体的真核表达载体,并实现其真核表达.方法:从杂交瘤细胞中克隆得到鼠源单抗的可变区基因,插入嵌合抗体IgG1真核表达载体pDHL中,转染 CHO细胞,实现其真核表达,并对抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体的功能进行初步鉴定.结果:成功构建抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体真核表达载体,并实现其真核表达. 初步的功能鉴定表明抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体具有较好的特异性和亲合力.结论 :构建的抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体真核表达载体在真核细胞内得到表达 ,且其功能较为理想.     

抗CD_3鼠/人嵌合抗体基因的构建及表达 I.CD_3单抗重链可变区基因的克隆及序列测定

以人工合成的小鼠免疫球蛋白重链可变区(V_H)基因特异的寡核苷酸片段为引物,用PCR法成功地进行了HIT_3a(抗CD_3单克隆抗体)V_H基因的扩增,并将扩增片段克隆进了pGEM-7Zf(+)质粒DNA中,重组质粒序列测定的结果表明,片段大小为353 bp,基因重排方式为VDJ_4。     

抗CD42—鼠嵌合抗体的生物学特性及作用机理探讨

目的 比较抗ＣＤ４人－鼠嵌合抗体与鼠源性单抗在单向混合淋巴细胞反应（ＭＬＲ）和兔皮内移植物抗宿主反应（ＧＶＨＲ）中的作用，及嵌合抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒（ＡＤＣＣ）和补体依赖细胞毒（ＣＤＣ）活性，以进一步探讨抗ＣＤ４嵌合抗体的增殖抑制作用机理。方法 用四甲基偶氮唑盐比色分析法检测抗ＣＤ４抗体在单向ＭＬＲ中的抑制作用。以免疫抑制剂处理后的大白兔作为ＧＶＨＲ的动物模型，对抗体的增殖抑制作用进行     

抗CD71人-鼠嵌合抗体的体外抗肿瘤效应研究

目的 对抗CD71人-鼠嵌合抗体体外抗肿瘤效应进行研究。方法 以表达CD71分子的3种人类肿瘤细胞（K562，CEM和SMMC-7721）为靶细胞，以正常人外周血单个核细胞（PBMC）为效应细胞，在效/靶细胞比为50：1的条件下，测定嵌合抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（ADCC）；以CEM和SMMC-7721为靶细胞，在有新鲜补体存在下，测定嵌合抗体的补体依赖性细胞毒效应（CDC）。结果 抗CD71人-鼠嵌合抗体（D2C）能够通过识别CD71分子，并通过人抗体Fe段介导ADCC。在有新鲜补体存在下，介导CDC。结论 抗CD71人-鼠嵌合抗体对CD71^ 肿瘤细胞可介导ADCC和CDC。     

抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建及瞬时表达

目的构建及瞬时表达抗人CD28鼠-人嵌合抗体。方法采用基因工程技术,从分泌鼠抗人CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株（克隆号：2F5）中克隆出抗体重链和轻链可变区基因及相应信号肽编码序列。分别与人免疫球蛋白IgG1恒定区重、轻链基因拼接,构建含有重组基因的pIRES表达质粒pIRES/h2F5。转染293T细胞并用抗性药物G418选择培养。采用流式细胞术,检测瞬时转染细胞后嵌合抗体的表达情况。结果抗人CD28鼠人嵌合抗体得到表达并能与CD28分子特异性结合。结论抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建和瞬时表达是成功的,为后续构建稳定分泌抗人CD28鼠-人嵌合抗体的CHO基因转染细胞株奠定了基础。     

NBS法标记CEA人鼠嵌合抗体rch24的初步研究

目的:研究125I直接标记CEA人鼠嵌合抗体rch24的方法。方法:采用NBS(溴代琥珀酰亚胺)法进行碘标,并测定标记物的放射化学纯度、标记率和体外稳定性。结果:采用纸层析法测定的标记率和放射化学纯度分别为97.2%±0.4%和95.5%±0.2%;标记抗体体外4℃存放,放射化学纯度逐渐下降,14天后降为92.6%,35天后为89.3%。结论:标记物具有较高的放射化学纯度及稳定性,为体内治疗打下良好的基础。     

抗HFRS病毒单抗1A8鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体的构建及表达

目的 构建HFRS病毒mAb1A8鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体，并进行表达。方法 将抗HFRS病毒mAb1A8的VH基因和人重链CH1基因加接，VL基因和人Ck基因连接，分别构建了鼠/人嵌合重链Fd基因和轻链基因，将它们克隆人pComb3，构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗表达载体，用辅噬菌体VCSM13超感染，ELISA间接夹心法检测抗体活性。结果 经多种限制性内切酶酶切鉴定载体构建正确，ELISA间接夹心法检测超感染上清为阳性。结论 成功构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体，并在噬菌体表面表达出可结合HFRS病毒抗原的鼠/人嵌合Fab抗体。     

抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体死亡受体5嵌合抗体的构建及其真核表达

目的构建以人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体死亡受体5(DR5)为抗原的鼠/人重组嵌合抗体。方法采用基因工程技术,扩增和克隆抗DR5嵌合抗体的轻、重链表达载体,共转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr-),筛选稳定分泌表达抗DR5嵌合抗体的细胞株。采用ELISA和Western bloting法鉴定抗体的人源性和抗体-抗原结合活性,四唑盐/吩嗪硫酸甲酯比色法检测抗体的生物学活性。结果获得了稳定表达和分泌抗人DR5的嵌合抗体(anti-DR5mV-hH)的重组细胞;与人DR5蛋白具有高的特异性结合活性;能使体外培养的人髓性白血病Jurkat细胞和人结肠癌HCT116细胞的存活率分别下降到73.15%和77.30%。结论抗DR5嵌合抗体anti-DR5mV-hH具有抗肿瘤活性,为发展人源化抗体药物的研究奠定了基础。     

CEA单链抗体表达质粒构建及产物纯化

目的单链抗体基因的构建并在大肠杆菌中进行表达以及表达产物的纯化研究。　方法采用重组PCR技术将已获得的抗癌胚抗原 (CEA)鼠源单克隆抗体E7B10 重、轻链可变区基因 (VH、Vk)经 (Gly4 Ser) 3 编码的寡核苷酸拼接成单链抗体基因 ,并在大肠杆菌中表达了单链抗体C端融合 6×His蛋白 ,表达产物经Ni2 -IDASepharose 6B亲和柱纯化。　 结果表达的融合蛋白在胞内主要以可溶性存在 ,其表达量达到菌体总蛋白的 10 % ,SDS -PAGE和Western印迹图谱显示表达产物分子量为 2 7kd ,与其基因编码蛋白的理论推算值相符。表达产物经Ni2 -IDASepharose 6B亲和柱纯化 ,纯度可达 90 %以上 ,得率为 0 .8mg/ 10 0ml。　 结论纯化后的融合蛋白具有CEA结合活力 ,其亲和常数为 5 .4× 10 7/M(抗体结合浓度 ) ,略低于其亲本单抗E7B10 2 .7× 10 9/M。     

乙肝病毒表面蛋白及其抗体复合物对人精子功能的影响

目的：研究乙肝表面蛋白（HBs）与其单克隆抗体（MAb）复合物对人精子功能的影响,探讨乙肝病毒（HBV）损害人精子的可能机制。方法：对HBs-HBsMAb孵育后的精子活力进行分析,采用JC-1染料结合流式细胞术监测人精子线粒体膜电位（MMP）。结果：人精子在体外与25μg/mL的HBs和不同浓度（20、40、80μg/mL）HBsMAb共孵育后,活力好的精子百分比例显著下降（P〈0.01）,MMP也下降。结论：HBV可能通过HBs-HBsMAb对人精子功能产生负面影响。     

SZ—63单链抗体的基因构建、表达及免疫性研究

目的：基因构建与表达SZ-63单链抗体(SZ-63scFv)，降低单克隆抗体对人体的免疫源性。方法：运用基因工程手段通过一段小分子连接肽(Gly4Ser)3将SZ-63抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因连接，构建成pET22b-63scFv表达载体，并导入大肠杆菌BL21（DE3）plys中进行表达，同时进行表达特性的研究。结果：pET22b-63scFv在BL21（DE）3plys中经IPTG诱导后，SZ-63scFv以包涵体形式存在，经复性处理后具有与纤维蛋白D—二聚体结合的活性，其表达量占菌体总蛋白的18％，SZ-63scFv具有13mg／g湿菌的表达量。结论：成功地获得了SZ-63scFv单链抗体并保留了与亲本抗体同一的抗体结合特性。     

新型CpG佐剂——BW006协同乙型肝炎病毒表面抗原活化小鼠B、T淋巴细胞的作用

目的探讨新型CpG佐剂BW006协同乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)对小鼠B、T淋巴细胞活化的影响。方法以BW006和(或)HBsAg体外刺激小鼠脾单个核细胞,检测B细胞膜表面分子CD80、CD86和T细胞早期活化分子CD69的表达水平。小鼠免疫BW006和(或)HBsAg后24h取脾,无菌分离单个核细胞,检测CD80、CD86和CD69的表达水平。结果 40μgHBsAg+5μg BW006体外刺激24h时,B细胞CD80、CD86阳性率显著高于对照组(27.36%±1.77%vs 10.41%±0.72%;98.92%±0.09%vs 74.85%±5.13%,P均<0.01),T细胞CD69阳性率显著高于对照组(12.47%±3.31%vs 7.15%±1.37%,P<0.01)。4μg HBsAg+20μg BW006联合免疫后,小鼠脾B细胞CD80的阳性率显著高于BW006免疫组(12.26%±2.33%vs 9.80%±1.17%P<0.05)和生理盐水免疫组(12.26%±2.33%vs 8.50%±1.34%,P<0.05),CD86阳性率显著高于生理盐水免疫组(63.84%±1.48%vs 56.69%±1.33%,P<0.05),T细胞CD69表达阳性率显著高于BW006组(33.97%±2.17%vs 31.32%±2.78%,P<0.05)和生理盐水组(33.97%±2.17%vs 27.77%±2.51%,P<0.05)。结论 BW006佐剂能有效辅助HBsAg活化B和T细胞,上调B细胞表面协同刺激分子CD80、CD86及T细胞早期活化分子CD69的表达。     

抗人活化血小板嵌合单克隆抗体SZ-51/Hu的纯化、鉴定和核素标记

目的评价抗人活化血小板嵌合单克隆抗体SZ-51/Hu核素标记及其用于临床血栓放射免疫显像的可行性.方法用免疫亲和层析法纯化SZ-51/Hu,并对其特性进行鉴定,以过量的2-亚氨硫醇预处理SZ-51/Hu,采用99Tcm-葡庚糖酸钠(GH)配体交换法标记.薄层层析法测定标记物的放化纯度.制备实验性狗股动脉血栓模型后,经静脉注入99Tcm-SZ-51/Hu进行SPECT显像.结果纯化的SZ-51/Hu分子量为160kD,亲和常数5.5104×108L/mol,每个活化血小板的结合位点数平均为10262±2372个.99Tcm抗体的标记率达96%以上.实验性狗股动脉血栓模型注射99Tcm-SZ-51/Hu后4h血栓显示清晰.结论SZ-51/Hu保留了原鼠源单抗SZ-51/Hu相同的活化血小板(GMP-140)结合特异性和亲和力.99Tcm标记后仍保持良好的体内特异性血栓定位能力,可望用于临床血栓放射免疫显像.     

抗乳腺癌人单抗CM—1重链可变区基因的序列测定与分析

为存留抗乳腺癌人单抗CM－1的可变区编码基因，从CM-1杂交瘤细胞中提出总RNA，经逆转录生成cDNA，PCR后得到一400hP左右的基因扩增片段。用一条内引物直接对PCR产物进行基因序列测定，测得344个碱基序列，与已知人抗体重链可变区的读码框架相符，其对应的氨基酸序列属人抗体可变区“典范结构”的1～3类，从而进一步验证了CM-1单抗的人源性，并为人抗体编码基因的研究提供了新资料，也为制备CM－1小分子抗体作了准备。