载10-羟基喜树碱脂质超声微泡的处方制备及一般特性研究

目的 研究载10-羟基喜树碱(HCPT)脂质超声微泡的处方制备工艺,筛选出最佳处方制备载药微泡,研究微泡的一般特性及显影效果,并检测微泡的药物包封率和载药量.方法 以机械振荡法制备载HCPT脂质超声微泡;采用正交试验优选处方;采用紫外分光光度法和反相高效液相色谱法测定微泡的包封率和载药量;在光学显微镜下计数并观察微泡的外观和分布情况;以马尔文激光粒径测量仪测量微泡粒径大小和Zeta电位;观察并比较微泡经60Co射线灭菌前后其外观、形态、平均粒径和包封率的改变;并观察微泡在兔肝脏的增强显影效果.结果 以最佳处方制备的载10-羟基喜树碱(2 mg)微泡的药物包封率为86.70%,载药量为21.70%;浓度为(3.07±0.58)×109/ml,粒径范围为(1.10±0.20)μm,平均粒径为1.10 μm;Zeta电位为-(3.90±0.80)mV;超声定向辐照微泡后,药物吸光度值明显增加;经60Co射线灭菌后观察微泡形态、平均粒径及包封率无明显变化;静脉注射此载药微泡后,兔肝脏超声显影持续增强.结论 采用机械振荡法制备的载HCPT脂质微泡,包封率和载药量较高,粒径分布均匀,体内显影效果好,有望实现实时监控下的体内定点靶向给药,为进一步研究奠定了基础.     

载10-羟基喜树碱脂质超声微泡在小鼠体内的药代动力学研究

目的 制备载10-羟基喜树碱(HCPT)脂质超声微泡,检测其形态、粒径、电位,并探讨其在小鼠体内的药代动力学特征及在超声辐照下药物在小鼠肝脏的定位释放情况.方法 用机械振荡法制备载HCPT脂质超声微泡,在光学显微镜下观察其外观和分布情况,以马尔文激光粒径测量仪测量其粒径大小和Zeta电位;测定HCPT注射液、载HCPT脂质超声微泡(HLM)在不同时间点小鼠血浆中的药物浓度,数据用3P97药动学程序处理,得到各主要药代动力学参数;将实验小鼠分为HLM组、HLM辐照组、HCPT注射液组、HCPT注射液辐照组4组,分别注射HLM及HCPT注射液后,用一定声强的超声经体表定点辐照,用HPLC-荧光法测定小鼠肝脏中的HCPT含量.结果 光镜下观察载HCPT脂质超声微泡呈球形,粒径范围为(1.1±0.2)μm,平均粒径1.1 μm ,Zeta电位为-(3.9±0.8)mV;HLM及HCPT注射液的药-时曲线符合二室模型,HLM在多数取样时间点的血药浓度较HCPT注射液高,HLM在血浆中的消除半衰期(6.70 h)较HCPT注射液(1.12 h)明显提高,延长了药物在血浆中的滞留时间,同时提高了HCPT的生物利用度,其AUC(药-时曲线下面积)为HCPT注射液的5.5倍;HLM辐照组小鼠肝组织中的HCPT含量明显高于其余各组.结论 载HCPT脂质超声微泡粒径分布均一,可延长HCPT在体内的循环时间,在一定声强的超声定位辐照下能明显提高靶组织内的药物浓度.     

载10-羟基喜树碱液态氟碳靶向纳米粒的制备及体外双模态成像

目的制备载10-羟基喜树碱(10-HCPT)液态氟碳靶向纳米粒,观察其对人卵巢癌SKOV-3细胞的寻靶能力及体外超声/CT双模态成像效果。方法以羟基端乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA-COOH)、全氟溴辛烷(PFOB)及10-HCPT为原料,采用双乳化法制备PLGA@10-HCPT-PFOB纳米粒,观察其外部形态和内部结构,测量粒径大小和表面电位,以及10-HCPT的包封率和载药量;通过碳二亚胺法连接cRGD肽制备cRGD-PLGA@10-HCPT-PFOB靶向纳米粒,使用共聚焦显微镜和流式细胞仪检测PLGA@10-HCPT-PFOB纳米粒与cRGD肽的连接情况。体外实验检测其对人卵巢癌SKOV-3细胞的靶向性能;观察靶向纳米粒的体外超声/CT成像能力。结果本实验制得的靶向载药纳米粒外观呈黄色混悬液,光镜下纳米粒形态规则、大小均一,平均粒径(322.03±5.34)nm,平均表面电位(-1.55±0.10)mV;扫描电镜示靶向纳米粒呈球形,表面光滑;透射电镜示其为核壳结构,PLGA包裹PFOB和10-HCPT,10-HCPT包封率和载药量分别为(81.34±2.28)%和(13.24±1.24)%;共聚焦显微镜观察示FITC标记的cRGD肽呈绿色荧光,与DiI标记染色的红色纳米粒共同融合呈橙黄色荧光,流式细胞仪检测PLGA@10-HCPT-PFOB纳米粒FITC荧光强度为0.78%,cRGD-PLGA@10-HCPT-PFOB纳米粒FITC荧光强度为80.76%;共聚焦显微镜及流式细胞仪显示大量纳米粒靶向到SKOV-3细胞表面,与细胞膜上的αvβ3受体结合,部分被SKOV-3细胞吞噬;随着靶向纳米粒的浓度不断增加,其体外超声/CT成像明显增强。结论本实验成功制备载10-HCPT液态氟碳靶向纳米粒,其10-HCPT包封率和载药量均较高,对人卵巢癌SKOV-3细胞有较强的靶向性,通过聚集显影可增强体外超声/CT成像。     

LHRHa靶向微泡造影剂的制备及体外寻靶实验

目的 制备人卵巢癌靶向超声造影剂,观察其体外寻靶能力。方法 采用生物素-链霉亲和素法制备促黄体生成素释放激素类似物(LHRHa)靶向脂质微泡,以免疫荧光染色验证LHRHa与脂质微泡的结合情况,并以普通脂质微泡作为对照,在倒置显微镜下观察LHRHa靶向脂质微泡对人卵巢癌A2780/DDP的体外寻靶能力。结果 LHRHa靶向脂质微泡免疫荧光阳性;体外寻靶实验显示LHRHa靶向脂质微泡能够与表面存在LHRH受体的A2780/DDP细胞特异性结合,而普通脂质微泡则不能结合。结论 利用生物素-链霉亲和素方法可成功制备LHRHa靶向脂质微泡造影剂,该靶向造影剂具有体外寻靶能力。     

靶向BST2微泡造影剂的制备及其与肿瘤细胞的体外结合能力

目的 制备骨髓基质抗原蛋白(BST2)靶向微泡造影剂,观察其与小鼠前列腺癌细胞(RM-1)和小鼠乳腺癌细胞(4T1)的体外结合能力,探讨BST2作为前列腺癌潜在靶点的可行性.方法 通过免疫荧光染色和蛋白质印迹法对BST2在两种细胞中的表达进行对比分析.采用生物素-亲和素桥连技术制备BST2靶向脂质微泡,普通光镜下观察BST2靶向微泡造影剂,并采用Accu Sizer 780A粒度仪进行表征,以非靶向微泡作为对照,比较其与RM-1和4T1两种肿瘤细胞系的结合特性及结合率.结果 BST2在RM-1细胞中的表达高于在4T1细胞中的表达;BST2靶向微泡与RM-1细胞的黏附率明显高于其与4T1细胞的黏附率,并远远高于非靶向微泡的黏附率.结论 BST2靶向微泡造影剂可与RM-1细胞特异性结合,有望作为前列腺癌的特异性超声分子探针用于前列腺癌的靶向分子成像.     

携载PSMA单抗靶向前列腺癌的纳米级脂质微泡的制备及体外寻靶能力

目的制备携载PSMA单抗靶向人前列腺癌的纳米级脂质微泡,并观察其体外寻靶能力。方法利用静电吸附法制备携载PSMA单抗靶向前列腺癌的脂质纳米级微泡,检测其一般特性;免疫荧光法检测抗体与纳米级微泡的结合情况;用细胞免疫荧光分析鉴定PSMA的表达及其在细胞膜上的定位;普通光镜下观察靶向微泡对前列腺癌细胞的寻靶能力,同时以胃癌细胞作对照。结果携载PSMA单抗的靶向纳米级微泡分布均匀,平均粒径为(623.70±66.05)nm,免疫荧光法显示微泡表面可见绿色荧光,细胞免疫荧光检测前列腺癌细胞膜高表达PSMA,体外寻靶实验显示该靶向微泡可与人前列腺癌LNCAP及C4-2细胞牢固结合,而与胃癌MKN45细胞不结合。结论本实验成功制备的携载PSMA单抗靶向人前列腺癌的纳米级脂质微泡具有较强的体外寻靶能力,能特异性地与前列腺癌细胞结合。     

载10-羟基喜树碱液态氟碳纳米粒制备及其表征、体外增强超声显像效果观察

目的 研制一种包裹液态氟碳（PFP）的新型载药纳米级超声造影剂,考察其基本特性并观察其体外增强超声显像效果。方法 采用旋转蒸发和探头超声法制备载10-羟基喜树碱（10-HCPT）的液态氟碳（PFP）纳米粒,在光学显微镜和透射电镜下观察纳米粒形态,采用马尔文仪测量纳米粒粒径和电荷。采用紫外分光光度计测定纳米粒包封率,并应用低强度聚焦超声（LIFU）辐照载药液态氟碳纳米粒溶液,观察纳米粒相变情况及其增强超声显像效果。结果 制备的载药脂质纳米粒外观为乳白色混悬液,在油镜及透射电镜下观察,载药纳米粒形态规则,分布均一,平均粒径约（500.82±25.97）nm,表面平均电位为（-47.77±3.09）mV;在体外经LIFU辐照后,可见纳米粒发生液气相变形成微泡,在基波模式和谐波模式下,均可显著增强超声显影。结论 成功研制了包裹液态氟碳的载药脂质纳米粒,可望成为一种新型的多功能超声造影剂。     

超声辐照载10-HCPT微泡在小鼠H22肝癌移植瘤的定位释放研究

目的制备载10-HCPT脂质超声微泡(HLM),结合超声定位破坏微泡的方法实现10-HCPT在H22移植瘤的定位释放。方法用机械振荡法制备HLM。用荧光显微镜观察荧光标记的HLM在肿瘤中的分布情况。将荷瘤小鼠分为5组:超声+10-HCPT注射液组、超声+空白脂质微泡+10-HCPT注射液组、单独HLM组、超声+HLM组及生理盐水对照组。于处理1h后处死小鼠剥取肿瘤及心、肝、脾、肺、肾,测定各组织内药物浓度。结果病理切片见荧光素在肿瘤的分布超声+HLM组明显多于单独HLM组。药物浓度检测显示:1 h后肿瘤内10-HCPT浓度最高的是超声+HLM组,其他组织中10-HCPT浓度使用HLM的两组显著高于使用10-HCPT注射液的两组(P0.05)。结论局部超声辐照破坏HLM的方法能定位释放10-HCPT,提高移植瘤局部的10-HCPT含量,同时脂质微泡作为10-HCPT的载体能延长其体内循环时间。     

叶酸靶向超声造影剂的制备及体外寻靶实验研究

目的 制备偶联叶酸的靶向超声微泡造影剂,鉴定其基本性质,并探讨体外寻靶能力.方法 将DSPE-PEG(2000)Folate溶入微泡成膜材料中,制备叶酸靶向超声微泡造影剂.用DFY型超声图像定量分析诊断仪检测微泡粒径和浓度.通过光镜和激光共聚焦显微仪观察该靶向造影剂对SKOV3细胞的体外寻靶情况,以普通超声微泡作对照.结果 靶向超声微泡的大小、粒径及分布与普通超声微泡相似.体外寻靶试验显示,该靶向微泡可以较多并牢固地聚集到SKOV3细胞表面,而普通微泡对照组未见特异性结合.结论 成功制备出偶联叶酸的靶向超声微泡造影剂.该造影剂在体外对高表达叶酸受体的SKOV3细胞具有较强的特异性亲合力,有望成为靶向显像卵巢癌的理想造影剂.     

10-羟基喜树碱治疗胃肠道肿瘤近期疗效及安全性的Meta分析

目的评价10-羟基喜树碱治疗胃肠道肿瘤的近期临床疗效和安全性.方法电子检索中国学术期刊网全文数据库（1995～2005）,MEDLINE（1995～2005）和Cochrane图书馆（2005第1期）,并与研究者联系以获得更多相关研究资料.纳入比较10-羟基喜树碱（10-HCPT）或以10-HCPT为主的二联及多联化疗方案治疗胃肠道肿瘤的随机对照试验,比较两组化疗有效率、消化道和血液毒性反应率.由两名评价员独立检索和提取资料并交叉核对,对纳入文献的方法学质量进行评价,数据采用RevMan4.2.2版软件进行统计分析.结果共纳入25个试验,共1 881例患者.Meta分析结果提示：10-HCPT可以显著提高近期大肠癌化疗疗效[OR 1.62,95%CI（1.37,1.92）]和胃癌化疗疗效[OR 1.48,95%CI（1.18,1.85）],其所致消化道严重毒性反应发生率与对照组比较差异无统计学意义[OR 0.96,95%CI（0.62,1.50）],但血液系统严重毒性反应发生率却显著增高[OR 1.27,95%CI（1.02,1.58）].结论现有研究资料显示,10-HCPT可以提高胃肠道肿瘤化疗近期临床疗效,但会增加血液系统严重毒性反应发生率,其在改善预后方面的作用还需要进一步研究.     

载多西紫杉醇脂质微泡超声造影剂的制备及其性质

目的 制备载多西紫杉醇脂质微泡并测定性质及观察其体内显像效果.方法 制备载多西紫杉醇脂质微泡,测定粒径、包封率等性质;观察60Co射线灭菌前后微泡性质的差异,观察超声辐照后载药微泡药物的释放,并观察其对兔VX2肝癌的显像效果.结果 载多西紫杉醇微泡的浓度为2.2×109～3.2×109个/ml;粒径分布范围为473.4～706.6 nm,平均粒径为623.1 nm;微泡的包封率为70%以上,载药量为(17.5±0.8)%;Zeta电位为-(3.1±0.9)mV;超声辐照微泡溶液后,药物可释放;静脉注射此微泡后,兔肝实质见良好、持续的增强显像,肝癌病灶可见明显的"快进快出"显影表现.结论 载多西紫杉醇脂质微泡包封率较高,性质较佳,体内显像效果好,提高了超声在肝癌等肿瘤诊断中的价值,超声辐照能促使微泡中的药物释放,有望在实时监控下体内定点靶向给药,实现对肿瘤的靶向治疗.     

以HER2为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂的制备及实验研究

目的 制备以HER2受体为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂,并观察其体外寻靶能力及体外超声显像效果.方法 制备生物素化Herceptin单抗,检测其生物素化程度及生物学活性;薄膜水化-声振法制备生物素化纳米微泡,以生物素-亲和素为桥梁制备HER2为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂,观察其对SKOV3卵巢癌细胞的体外寻靶能力及靶向结合的体外超声显像.结果 平均每分子Herceptin单抗可与16个生物素分子结合;与游离单抗相比,生物素化抗体的活性未见明显降低(P＞0.05).体外寻靶实验观察:靶向纳米微泡组SKOV3细胞表面有明显的红染纳米微泡与其牢固结合,沿细胞表面排列较规则;非靶向组SKOV3细胞表面未结合红染的纳米微泡.靶向纳米微泡体外超声显像:细胞爬片与靶向纳米微泡孵育后可明显增强超声显像效果,对照组均未见明显超声显像.结论 应用生物素-亲和素系统成功构建了以HER2为靶点的纳米级超声造影剂,与SKOV3细胞结合后有明显超声显像效果.     

包裹阿霉素的新型载药微泡制备及体外缓释实验研究

目的 将包裹阿霉素(ADM)的乳/羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米缓释药物微球(ADM-NP)通过共价结合方式连接于带正电氨基脂质超声微泡(MB-NH2)表面,制备包裹ADM的新型载药微泡,并观察其基本理化特性、载药量、包封率、体外缓释特性及显影效果.方法 采用双乳化法,制备ADM-NP,并通过碳二亚胺法活化ADM-NP表面的羧基,在一定条件下,使ADM-NP以共价结合的方式,连接于MB-NH2表面.用光镜观察连接情况、微泡形态并检测其粒径大小.用高效液相色谱法(HPLC)检测其包封率及载药量,观察该新型载药微泡的体外缓释药特性以及对兔VX2肝癌的显像效果.结果 48 h后光镜观察,可见大量ADM-NP连接于MB-NH2表面,呈花环状,分布较为均匀,其平均最大径为(2.68±0.98)μm.该新型载药微泡的载药量为(8.71±0.46)％,包封率为(86.11±6.76)％.两组体外释药均符合Hignch方程,其结果无明显差异性(P＞0.05),48 h体外累积释药量达90％以上.经兔耳缘静脉注射该微泡后,兔肝实质明显持续增强,肝癌呈“快进快退”显像表现.结论 采用碳二亚胺法可将ADM-NP通过共价结合方式连接于MB-NH2表面,提高微泡载药量,延长药物的持续作用时间,并且在兔VX2肝癌肿瘤中显影效果好,为采用超声靶向爆破微泡进行药物定位释放技术提供了一种新型高效的载药微泡系统.     

新型液态氟碳纳米脂质微球超声造影剂的制备及显像实验研究

目的 制备液态氟碳(perfluorooctylbromide,PFOB)纳米脂质微球并探讨其对大鼠肝脾实质的超声显像效果、安全性及相关机制.方法 采用高压均质技术制备PFOB纳米脂质微球,用透射电镜观察微球形态、分布,用激光粒度和电位分析仪测定微球粒径及表面电位.经大鼠尾静脉注射微球后行超声显像,同时监测大鼠生命体征变化.肝脾实质为感兴趣区,应用DFY超声图像定量分析系统评价造影效果,建立时间一强度曲线.大鼠肝脾冰冻切片探讨微球增强肝脾超声显像的相关机制.结果 PFOB微球为实心球形结构,粒径极小且分布均匀;造影后约10 S肝实质回声增强,达峰时间约在注射微球后3～4min,持续增强约1 h;脾实质较肝实质增强时间更长,效果更显著,第2 d仍持续增强;实验过程中大鼠生命体征未见明显变化;微球在肝脾组织内大量分布聚集可能是其增强肝脾显影的机制之一.结论 PFOB微球是一种安全有效的新型超声造影剂,有潜在的开发应用价值.     

纳米级脂质微泡超声造影剂肿瘤被动靶向研究

目的 观察纳米微泡通过肿瘤血管内皮间隙实现被动靶向的可行性.方法 20只SKOV3细胞皮下种植荷瘤裸鼠分为A组(超声显像组10只)及B组(冰冻切片组10只,再分为B1组及B2组).制备DiI标记的纳米微泡及微米微泡并调整至相同浓度.A组:各裸鼠先后经尾静脉注射相同浓度微米微泡及纳米微泡(35μl/只,间隔1.5h),分别进行超声显像观察.B组;B1组及B2组各裸鼠分别注射相同浓度微米微泡及纳米微泡(约10μl/只),1.5h后对裸鼠进行心脏灌注后切取肿瘤组织及肌肉组织进行冰冻切片、Hoechst核染,激光共聚焦显微镜下观察不同微泡在两组织中的滞留情况.结果 超声显示:纳米微泡组达峰时间及消退时间均长于微米微泡组,而峰值强度低于微米微泡组.冰冻切片观察;纳米微泡组肿瘤细胞周围见明显红色荧光聚集,微米微泡组肿瘤、肌肉组织中及纳米微泡组肌肉组织中均未见明显红色荧光.结论 纳米级脂质微泡可通过肿瘤血管内皮间隙,即实现了肿瘤被动靶向.     

携抗P-选择素单抗靶向超声造影剂的制备及体外寻靶实验研究

目的 制备携抗P选择素(P-selectin)单抗的靶向超声造影剂,并研究其体外寻靶能力.方法 采用“亲和素-生物素”桥接法制备携抗P-seleetin单抗靶向超声造影剂,检测其基本特性.应用不同剂量重组人白介素-4(rhIL-4)和组胺联合刺激人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)表达P-selectin,用免疫荧光检测P-selectin的表达水平并探寻rhIL-4最适刺激剂量.靶向超声造影剂、同型对照超声造影剂和空白超声造影剂分别与经最适剂量rhIL-4和组胺联合刺激的HUVECs和未作处理的HUVECs进行体外寻靶实验.结果 成功制备携抗P-selectin单抗靶向超声造影剂,平均粒径为(2.24±0.71)μm,平均Zeta电位为(-2.75±0.84)mV,浓度为(3.0±0.3)×109个/ml,抗体结合率高达99.80％;免疫荧光检测结果显示rhIL-4和组胺能成功刺激HUVECs表达P-selectin,并探寻出rhIL-4最适刺激剂量;体外寻靶实验显示靶向超声造影剂能较好地黏附在经最适剂量rhIL-4和组胺联合刺激的HUVECs表面,与其他组比较差异有统计学意义(P ＜0.01).结论 采用“亲和素-生物素”桥接法成功制备携抗P-selectin单抗靶向超声造影剂,该造影剂在体外能有效地黏附在经rhIL-4和组胺联合刺激的HUVECs表面.     

脉冲超声辐照微泡增强脂质体介导基因转染的体外实验研究

目的 探讨脉冲超声辐照微泡超声造影剂提高脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒在肝癌,细胞(HepG2)中转染率的可行性.方法 将HepG2接种在24孔板中,随机分为以下6组:①空白对照组;②质粒+脂质体组;③超声+质粒组;④超声+质粒+微泡组;⑤超声+质粒+脂质体组;⑥超声+质粒+脂质体+微泡组.荧光显微镜及流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白表达及转染效率;MTT法检测此转染方法对HepG2生长活性的影响.结果 超声+质粒+脂质体组的转染效率最高,并对细胞活性无明显影响;而超声+质粒+脂质体+微泡组转染效率与超声+质粒+脂质体组比较差异无统计学意义(P＞0.05),但细胞活性与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 脉冲超声辐照可介导基因转染,并能提高脂质体基因转染效率.同时,在一定条件下,超声微泡造影剂可提高超声介导基因转染效率,此方法可为基因转染提供新的思路.     

纳米脂质微泡超声造影剂制备及其显影效果的实验研究

目的 制备一种纳米级脂质超声微泡造影剂,并将其与普通脂质微泡在正常兔肝的造影效果进行比较,以评价其造影效果.方法 经机械振荡法制备纳米脂质微泡,检测其形态、粒径、表面电位等物理特性.分别经兔耳缘静脉团注自制纳米脂质、普通脂质微泡造影剂(2.5 ml/kg),动态观察肝的实质回声增强情况,并用DFY型超声图像分析诊断仪对造影效果进行定量分析.结果 纳米脂质微泡平均粒径为415.8 nm,平均电位为-(13.7±1.6)mV.造影后观察:该纳米微泡能明显增强兔肝的二维灰阶显像,与普通脂质微泡比较,纳米微泡达峰时间较晚,峰值持续时间较短,增强持续时间较普通脂质微泡长,纳米微泡对肝的增强峰值强度略低于普通微泡.结论 自制纳米微泡形态好,粒径均一,显影效果理想,为肿瘤的靶向性研究提供了一个前期基础.