抗Ig融合蛋白Fc段单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

目的：制备并鉴定抗Ig融合蛋白Fc段的单克隆抗体(mAb)，建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法和纯化Fc融合蛋白的亲和层析法。方法：以hBCMA—Ig融合蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠，通过细胞融合制备抗Fc段mAb，用ELISA等方法鉴定mAb的Ig亚类、表位以及种属特异性，建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法;Western blot检测mAb对变性Ig融合蛋白的反应性。将mAb与Sepharose4B交联，制备亲和层析柱，对LAIR1-Ig融合蛋白进行纯化。结果：获得7株稳定分泌抗Fc段mAb的杂交瘤(FMUFcl-FMUFc7)。利用FMUFc4作为包被mAb，FMUFc5作为酶标记mAb，成功地建立了检测Ig融合蛋白的ELISA法，敏感度达到2μg／L；在7株mAb中，FMUFc6可用于Ig融合蛋白的western blot检测。用FMUFc 6mAb制备的亲和层析柱，可有效地纯化LAIRl—Ig融合蛋白。结论：成功地制备了抗Ig融合蛋白Fc段的mAb，建立了可用于Ig融合蛋白检测和纯化的方法，为Ig融合蛋白的应用提供了有力手段。     

用膜亲和层析法纯化小鼠腹水中的单克隆抗体

目的 用膜亲和层析法（MAC）纯化小鼠腹水中单克隆抗体（mAb)。方法 采用尼龙滤膜ZBM作为介质吸附抗人血清白蛋白（HSA）,将含mAb的腹水滤过此ZBM,再将吸附于ZBM上的mAb解离下来,获得纯化的mAb。结果 直径50mm吸附了HSA的ZＢＭ。经１０mL腹水循环滤过两次,即可达到最大mAb结合量。从ＺＢＭ上解离mAb,仅需解离液滤过１次就可完成,纯化的mAb经ＰＡＧＥ检测,只显示１条带。用纯化的mAb做金标记斑点免疫渗滤法（ＤＩＧＦＡ）检测ＨＳＡ标准品时,其灵敏度较用未纯化的腹水时提高了２０倍,结论 用尼龙滤膜ＺＢＭ改进的膜亲和层析法,可用于纯化中的单克隆抗体 且简便、省时、有效。     

抗CD30L/CD153单克隆抗体的制备与初步鉴定

CD30L（CD153）是肿瘤坏死因子超家族（TNFSF）中的一个成员，属Ⅱ型跨膜蛋白，其胞膜外区与其他TNFSF成员（如TNF—α、LT—α和CIMOL等）有较高同源性，主要表达于活化T细胞、单核／巨噬细胞、中性粒细胞，以及某些髓系和淋巴系起源的造血系统的恶性肿瘤细胞。CD30L结合其受体CD30，介导分化和活化信号，促进细胞增殖和活化，     

一组小鼠抗大鼠单克隆抗体的鉴定

本室保存了一组小鼠抗大鼠的单克隆抗体(ｍＡｂ)ＯＸ５４(ＣＤ２) ,Ｗ３／２５(ＣＤ４) ,ＯＸ１９(ＣＤ５) ,ＯＸ３９(ＣＤ２５) ,ＯＸ７(ＣＤ９０ ,Ｔｈｙ１) ,ＯＸ１８(ＭＨＣ Ｉ单态 )和Ｒ７３(ＴＣＲαβ)。现以间接免疫荧光染色法和流式细胞仪分析技术 ,观察了这组ｍＡｂ在大鼠胸腺细胞及淋巴结细胞中的分布 ,并对其特异性进行了鉴定。１材料和方法１．１材料分泌ＯＸ５４(ＣＤ２) ,Ｗ３／２５(ＣＤ４) ,ＯＸ１９(ＣＤ５) ,ＯＸ３９(ＣＤ２５) ,ＯＸ７(ＣＤ９０,Ｔｈｙ１) ,ＯＸ１８(ＭＨＣ Ｉ单态 )和Ｒ７３(ＴＣＲαβ)等ｍＡｂ的杂…     

抗CD59单克隆抗体的制备及鉴定

本实验应用杂交瘤技术，首次在国内建立了两株抗人补体终末阶段同源限制因子的杂交瘤细胞系。经抗原特异性及功能分析提示它们所针对的抗体分子具有相似的功能，但抗原性和分子量不同：２Ａ７－Ａｇ为１８－２２ＫＤａ，１Ｆ１０－Ａｇ为６５ＫＤａ。进一步应用免疫荧光流式细胞分析、促同源补体溶血试验、中和实验、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ，ＰＩ－ＰＬＣ处理等实验手段系统地鉴定了２Ａ７抗原的细胞分布、抗原特异性、分子     

抗死亡受体-5单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:研制抗DR5单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法:以纯化的DR5免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗DR5mAb。用Ig亚类ELISA试剂盒鉴定抗DR5mAb的亚类。用ELISA法测定sDR5对抗DR5mAb与DR5结合的阻断作用及流式细胞术检测与Jurkat细胞膜上DR5结合的阻断作用,以鉴定mAb的特异性。用间接ELISA法检测腹水mAb的效价、亲和常数并进行表位分析。结果:获得4株可分泌抗DR5mAb的的杂交瘤细胞系YM366EC、YM366ED、YM369F5和YM369E6。4株mAb的Ig亚类均为IgG1;腹水mAb效价为1×10-4~5×10-6;亲和常数为1×109水平,4株mAb可识别2种不同的抗原表位。结论:获得4株抗DR5的mAb,为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件。     

抗人CD100单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的：研制可识别天然CD100分子的单克隆抗体（mAb)。方法：采用真核表达的CD100分子免疫BALB/c小鼠，以间接ELISA法筛选阳性杂交瘤，并分别用人急性T淋巴细胞性白血病细胞系MOLT-4，猿T淋巴细胞系MLA-144及猴EB病毒转化的B淋巴细胞系（BLCL），进行间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定mAb的特异性。结果：共获得7株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株。所有mAb均可识别人和猴细胞系的膜表面天然CD100分子，其中6株可识别猿细胞系膜表面的天然CD100分子，结论：成功地制备了7株抗CD100分子的特异性mAb。为研究人和猿，猴CD100分子的结构与功能提供了新的手段。     

大鼠抗小鼠胸腺基质细胞单克隆抗体的鉴定

根据小鼠胸腺冰冻切片免疫组织化学染色，将已获得的３０种大鼠抗小鼠胸腺基质细胞单克隆抗体分为８组：１．髓质胸腺基质细胞（ＴＳＣ）阳性，皮质ＴＳＣ阴性；２．髓质部分ＴＳＣ阳性，皮质ＴＳＣ阴性；３．皮、髓交界部分ＴＳＣ阳性；４．皮、髓质部分ＴＳＣ阳性；５．髓质ＴＳＣ阳性，皮质部分ＴＳＣ阳性；６．皮、髓质大部分ＴＳＣ阳性；７．被膜和血管内皮细胞呈阳性；８．髓质ＴＳＣ和皮质胸腺细胞为阳性。用这８组单抗对本室     

抗大鼠Nogo分子单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的：制备抗大鼠Nogo分子单克隆抗体(mAb)，为研究Nogo分子的组织分布和功能提供实验手段。方法：应用淋巴细胞杂交瘤技术制备小鼠源性抗大鼠Nogo mAb。用免疫荧光组织化学技术，对Nogo分子在大鼠中枢神经系统(CNS)的分布进行鉴定。结果：获得3株分泌抗Nogo mAb的杂交瘤细胞株。间接ELISA测定腹水效价达10^-6，两株mAb为IgG1(κ)亚类，另一株为IgG2b(κ)，在免疫荧光组织化学技术应用中获得较满意效果。结论：获得3株能特异性识别天然Nogo分子的mAb，为进一步研究Nogo分子的结构和功能奠定了基础。     

抗人B7（CD80）分子单克隆抗体的制备及鉴定

为了利用抗Ｂ７ｍＡｂ深入研究Ｂ７分子的作用，我们用融合蛋白Ｂ７Ｉｇ免疫小鼠，用细胞ＥＬＩＳＡ及间接膜免疫荧光法进行筛选，得到了两株抗Ｂ７ｍＡｂ３Ａ２和３Ｂ６克隆，其Ｉｇ类别分别属于ＩｇＭ和ＩｇＧ２ａ型。在功能上３Ａ２能明显抑制抗ＣＤ３ｍＡｂ诱导的Ｂ７分子协同刺激的Ｔ细胞增殖     

小鼠抗天花粉蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

<正> 天花粉蛋白Tian Hua Fen,THF或Trichosanthin Protein是从葫芦科植物栝楼根Trichosanthes Kirilowii Maxim中提取的有效引产成份,对所有滋养叶细胞来源的疾病也有治疗作用。近年来还发现该蛋白     

抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗抗CD3 ScFv单克隆抗体并研究其生物活性.方法：分离纯化后的抗CD3 ScFv蛋白免疫BALB/c小鼠,采用传统杂交瘤技术制备抗抗CD3 ScFv单克隆抗体;采用ELISA和Western blot鉴定其亚类和抗原结合特异性;采用FACS测定抗抗CD3 ScFv单克隆抗体对Jurkat细胞特异活性.结果：成功筛选出一株能稳定分泌抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的杂交瘤细胞株（10B7）,其分泌的抗体亚类为IgG1.该抗抗CD3 ScFv单克隆抗体直标后可特异性结合抗CD3 ScFv蛋白和抗CD3抗体.结论：文中所研制的抗抗CD3 ScFv单克隆抗体具有与抗CD3抗体、抗CD3 ScFv蛋白特异结合的活性,在肿瘤导向治疗中抗CD3/抗肿瘤双特异抗体的亲和层析纯化、药代动力学监测等方面具有广泛的应用前景.     

抗CD34单克隆抗体HI273的制备和鉴定

ＣＤ３４抗原可选择性地表达于不成熟的造血干／祖细胞、血管内皮细胞和一些组织的成纤维细胞上。这一发现 ,不仅有利地促进了对造血干／祖细胞识别、发育、增殖和分化的研究 ,而且大大推动了临床上应用ＣＤ３４ 细胞回输体内治疗某些血液病和恶性肿瘤的开展。目前 ,抗ＣＤ３４ｍＡｂ已成为研究造血调控、识别、分离富集造血干／祖细胞 ,以及分析白血病细胞表型的非常有用的工具。国际上 ,经ＨＬＤＡ命名的抗ＣＤ３４ｍＡｂ近４０株〔１ ,２〕。国内仅于１９９５年见舒翠玲等〔３〕报道的用表达ＣＤ３４抗原的重组痘苗病毒为抗原 ,制备的４…     

鼠抗人CD28分子单克隆抗体的研制及生物学特性研究

目的 制备鼠抗人CD28分子的单克隆抗体（mAb),研究其在T细胞的活化、增殖及信号传导中的作用。方法 以小鼠淋巴瘤细胞转染人CD28基因的细胞株（CD28-T）为免疫原,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,获取分泌特异性mAb的杂交瘤细胞株,以体内诱生法生产腹水,并以免疫亲和层析法对其纯化,以快速定性试纸法鉴定mAb的Ig亚类,竞争抑制法分析mAb识别的抗原表位,3H-TdR掺入法研究mAb对T细胞的刺激效应,结果 成功地获得了5株分泌特异性抗入CD28mAb的杂交瘤细胞株,鉴定的1株（克隆18G8）属IgG2a,腹水效价（流式细胞仪分析）达1：2400以上,该mAb能60%阻断标准鼠抗入CD28抗体与相应抗原的结合,提示其识别的抗原表位与标准mAb不完全相同,mAb18G8可取代B7-1分子介导的协同刺激信号,促进人外周血T细胞增殖（ST=7）。结论 18G8是12株功能性mAb,具有重要的研究和应用价值。     

5株鼠抗人CD28单克隆抗体的研制及生物学特性的研究

目的：制备鼠抗人CD28分子功能性单克隆抗体，研究其对T细胞活化、增殖及信号转导等方面的生物学效应。方法：以天然高表达CD28分子的人多发性骨髓瘤细胞株U266和小鼠淋巴瘤细胞转人CD28基因细胞株CD28-T分别作为免疫原和检测细胞株，采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行单抗的研制；以快速定性试纸法鉴定单抗亚类；腹水诱生法和免疫亲和层析法进行单抗的制备和纯化；经间接免疫荧光法分析单抗对不同细胞膜表面CD28分子的识别；采用竞争抑制法分析单抗识别的抗原位点；利用^3H-TdR掺入法分析单抗对PBTC的刺激效应和免疫荧光法分析PBTC活化前后的表型变化。结果：成功获得5株鼠抗人CD28功能性单克隆抗体，分别命名为2D5、2F5、3136、3F8和8G8，其中2D5为IgG2a亚类，其余均为IgG1亚类；流式细胞仪分析结果显示，5株单抗均能良好识别CD28-T、U266、XGI和Jurkat细胞表面的CD28分子；竞争抑制试验表明，2D5和8G8能完全阻断标准抗人CD28单抗与U266膜CD28分子的结合，其余3株为部分阻断；^3H-TdR掺入法实验结果表明，单抗8G8联合激发型CD3单抗能明显促进PBTC的增殖，刺激指数为7．4，活化细胞CD4、CD25、ICOS、4IBB及OX40分子的表达上调。结论：5株单抗均为抗人CD28单克隆抗体，具有重要的基础研究及潜在的临床应用价值。     

抗CD1d单克隆抗体的制备及其识别结构域的鉴定

目的:制备抗人CD1d单克隆抗体(mAb)并研究其结合特性。方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术制备鼠源性抗人CD1d mAb。用免疫荧光染色和流式细胞术鉴定其识别位点。结果:获得1株分泌抗CD1d mAb的杂交瘤细胞株。mAb的腹水ELISA效价达10-6,为IgG1亚类,可识别293T细胞转染的CD1d分子的α1结构域。结论:获得1株可特异性识别CD1dα1结构域的mAb,为进一步研究CD1d的结构及功能提供了手段。     

两步串联层析法纯化鼠抗人CD28单克隆抗体2F5

目的建立从小鼠腹水中纯化鼠抗人CD28单克隆抗体(mAb)2F5的两步串联层析法。方法将含mAb2F5的腹水经离心、过滤及缓冲溶液变换预处理后,先经固相化金属螯合亲和层析法(immobilizedmetalaffinitychromatography,IMAC)纯化,去除大部分杂蛋白,再经凝胶过滤层析法(gelfiltration,GF)精细纯化,并探讨了上样的流速和洗脱液的种类对mAb2F5纯度的影响。纯化的mAb2F5的生物学活性用3H-TdR掺入法进行分析。结果以两步串联层析法纯化的鼠抗人CD28mAb2F5的纯度大于90%,总回收率达70%。纯化的mAb2F5在体外对PBTC具有明显的促增殖作用;而且其促增殖作用的活性优于ProteinG亲和层析法(affinitychro-matography,AC)纯化所获得mAb。结论建立的两步串联层析纯化方法操作简便,所得mAb的纯度高、生物学活性好。     

抗CD86单克隆抗体对哮喘小鼠TH1/TH2细胞因子的影响

目的观察抗CD86单克隆抗体对卵蛋白干粉(OVA)致敏并刺激小鼠TH1和TH2细胞因子比例的变化,为防治哮喘提供实验依据.方法经OVA致敏的雌性Balb/c于激发前腹腔注射抗CD86单克隆抗体及同型对照IgG2α 50 μg,末次激发48 h后收集支气管肺泡灌洗液(BALF),以酶联免疫吸附法(ELISA)测定BALF中白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)和干扰素-γ(INF-γ)水平.结果以OVA致敏并激发的哮喘对照组小鼠BALF中IL-4、IL-5水平升高[分别为(64.23±3.91)pg/mL、(379.84±73.02)pg/mL],与PBS对照组[分别为(22±2)pg/mL、(245.75±50.01)pg/mL]比较,差异有显著性(P＜0.05);OVA致敏并激发的哮喘对照组小鼠BALF中INF-γ水平降低[(98.73±16.41)pg/mL],与PBS对照组[(218.35±48.63)pg/mL]比较,差异有显著性(P＜0.05).抗CD86单克隆抗体组小鼠BALF中IL-4、IL-5水平降低[分别为(35.78±4.88)pg/mL、(222.98±58.68)pg/mL],而INF-γ水平升高[(206.92±47.8)pg/mL],与哮喘对照组及同型对照IgG2α组(98.73±16.41)pg/mL、(102.32±15.49)pg/mL比较差异有显著性(P＜0.05).结论抗CD86单克隆抗体通过阻断共刺激信号,纠正TH1/TH2失衡,从而达到抗气道炎症的作用.     

小鼠抗登革病毒2型单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备小鼠抗登革病毒2型(TR1751株)的单克隆抗体(Monoclonal antibody mAb)，并对其性质进行鉴定。方法免疫原为病毒感染的Blabfc乳鼠脑组织，匀浆后离心，去除细胞成分。免疫Blab／c小鼠，将小鼠脾细胞和SP2／0细胞融合后，通过ELISA、间接免疫荧光染色、噬斑减少中和实验(Plaque reduction neutralization test，PRNT)及Western blot进行筛选和鉴定。结果筛选到I1、I9和B152 3株杂交瘤细胞系，其分泌的mAb均为识别登革病毒E蛋白的中和抗体。结论获得了3株分泌小鼠抗登革病毒2型mAb的杂交瘤细胞系，利用所制备的抗体，为进一步研究登革病毒致病机理和开发疫苗提供了免疫学工具。