flaB-PCR在钩端螺旋体病检测中应用

目的 探讨flaB-PCR对组织标本中钩端螺旋体检测的可行性，为钩端螺旋体流行病学调查提供一种快速、有效的技术手段。方法 根据黄疸出血型钩体赖株高度保守序列flaB设计一对引物，用PCR方法对实验动物标本及疫区动物标本中的钩端螺旋体DNA进行flaB基因片断扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果 该引物可特异性扩增钩端螺旋体DNA，而对本实验所用其它细菌均不扩增。肾组织中含10条钩端螺旋体经flaB-PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳可以目测到扩增产物。26份人工感染钩端螺旋体的动物脏器标本，flaB-PCR扩增阳性10份，阳性率38．46％；细菌分离阳性2份，阳性率7．69％。2种方法比较差异有统计学意义（X^2=6．93，P〈0．01）。疫区70份蛙肾标本。分离细菌8株，阳性检出率11．43％；flaB-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳阳性14份，阳性检出率20％。细菌分离阳性的标本flaB-PCR均为阳性。结论 flaB-PCR灵敏、特异、快速，是钩端螺旋体检测的有效方法，可用于钩体病疫情监测和流行病学调查。     

斑点杂交技术用于蛙钩端螺旋体病的流行病学调查研究

目的用Dotblotting杂交技术检测蛙类钩端螺旋体（钩体）,为动物钩体的流行病学监测和调查提供一种比较理想的方法。方法根据钩体赖株DNA合成1对flaB引物,用PCR技术对钩体菌株、疫区现场蛙肾材料等进行flaB基因扩增,用地高辛（DIG）标记flaB基因探针,用斑点杂交技术进行检测。结果结果表明用DIG标记的flaB探针可以检测到5fg及以下的DNA扩增产物。疫区70份蛙肾标本,斑点杂交检测阳性19份,阳性率为27．14％。而钩体细菌分离阳性者只有8份,阳性率11．43％,PCR扩增阳性者14份,阳性率20．00％。结论Dotblotting杂交是一种灵敏、特异、快速的钩体检测方法,可用于两栖类钩体的流行病学监测和调查。     

聚合酶链反应和地高辛标记的核酸杂交技术用于钩端螺旋体的检测

目的为钩端螺旋体快速诊断和流行病学调查建立一种比较理想的方法.方法根据钩端螺旋体赖株DNA合成一对flaB引物,用PCR技术对钩端螺旋体菌株、疫区现场动物标本等进行flaB基因扩增,用地高辛（DIG）标记flaB基因探针,用琼脂糖凝胶电泳和斑点杂交技术进行检测.结果纯化钩端螺旋体DNA 5pg经flaB-PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳可以目测.用DIG标记的flaB探针可以检测到5fg及以下的DNA扩增产物.疫区70份蛙肾标本,分离细菌8株,阳性率11.43%.flaB扩增阳性14份,阳性率20%;DIG标记探针斑点杂交检测,阳性19份,阳性率为27.14%.结论PCR-斑点杂交是一种灵敏、特异、快速的钩端螺旋体检测方法,既可用于快速检测和早期诊断,也可用于疫情监测和流行病学调查.     

福州市钩体病高发区野栖鼠感染调查与方法探讨

目的了解福州市病例高发地区野栖鼠感染钩端螺旋体(钩体)情况,探讨23SrDNA与secY在钩体实验室检测上的差异。方法用PCR方法检测捕获的野栖鼠鼠肾,同时对鼠血、鼠肾进行病原分离培养。结果在92只野栖鼠中,病原分离法共获得钩体8株(8.7%),PCR检测23SrDNA阳性35份(38.0%),检测secY阳性42份(45.7%),PCR方法检测钩体的敏感性高于病原分离培养法;23SrDNA与secY检测结果一致性好(Kappa=0.85),也可作为钩体PCR诊断的目标片段,但secY有更高的阳性率。结论两种PCR方法均能用于钩体病检测,且PCR法阳性率高于病原分离法。     

钩端螺旋体在不同水体中的存活及其消毒

目的了解钩端螺旋体在不同自然水体中的存活时间 ,并研究含氯消毒剂杀灭钩体及其影响因素。方法将培养的钩体掺入不同自然水体 ,同步观察钩体在不同条件下的存活时间。应用悬液定量杀菌实验观察含氯消毒剂对钩端螺旋体的杀灭作用及温度、pH值、有机物对其杀灭的影响。结果钩体在自来水、长江水、稻田水、小溪水、家畜粪便污染的池塘水、玄武湖水、秦淮河水的存活时间与水中杂菌、水温、光照和有机物的含量有关。 15℃避光时的存活时间分别为 5、10、2 0、30、5、3、1d。含氯消毒剂杀灭钩端螺旋体的作用与有机物和杂菌的含量有关 ,在 30min内完全杀灭钩体 ,其有效氯浓度在自来水、长江水、稻田水、小溪水、家畜粪便污染的池塘水、玄武湖水、秦淮河水分别为 1.0、5 .0、5 .0、2 .0、30、4 0、4 0mg·L 1。结论钩体在自然水体中存活时间不一 ,杂菌、水温、光照与有机物有明显影响 ;含氯消毒剂可有效杀灭水中钩端螺旋体 ,水中生物与理化特性可影响杀菌效果。     

用聚合酶链反应检测尿中的钩端螺旋体

人类钩端螺旋体(简称“钩体)感染的早期诊断可增加治疗的成功率,并将减少和预防钩体感染的传播。由于目前对钩体感染的早期诊断尚无快速和实用的方法,本文介绍一种高度敏感的聚合酶链反应(PCR)技术,可快速检出样本中极少量的钩体。作者检测了21份牛尿标本,用4种不同的检测技术(血清学试验、组织培养、快速印迹法和PCR法)进行比较。尿标本经无菌法收集自屠宰场和牧场中感染上钩体的牛。在4℃经13000×g离心15分钟,在显     

应用纯化重组外膜脂蛋白LipL32检测钩端螺旋体病抗体

目的 建立以纯化重组外膜脂蛋白LipL32为基础的钩端螺旋体(钩体)病抗体的检测方法 .方法 以摹因重组技术获取重组钩体外膜脂蛋白LipL32,以该蛋白为抗原,分别使用间接法和夹心法ELISA应用于不同人和鼠血清的检测,检测结果 与钩体显微镜凝集试验(MAT)进行比较,同时人血清的检测结果 还与进口试剂盒比较.结果 纯化的重组蛋白检测9例钩体确诊病例双份血清标本,三种ELISA法的检出率与MAT无明显差别.检测45份MAT阳性标本,间接法ELISA敏感性为71.11%(32/45),夹心法ELISA为80.00%(36/45),而进口 ELISA阳性13份,占28.89%(13/45),25份可疑占55.56%(25/45).特异性检测,MAT阴性血清69份,间接和夹心法ELISA特异度均为97.10%(67/69),其中检测门诊体检血清43份,间接和夹心法ELISA均为阴性,进口ELISA检测14份,也为阴性.检测非钩体发热病例血清标本16份,间接和夹心法ELISA共检出2份阳性,进口ELISA则是1份阳性,12份可疑.检测梅毒螺旋体质控阳性血清10份,四种方法 均为阴性.重组蛋白检测鼠血清标本274份,夹心法ELISA的敏感性为86.75%(131/151),特异性为99.19%(122/123),符合率为92.34%(253/274),与MAT检测结果 相符.结论 重组LipL32蛋白具有结合活性,可应用于钩体血清抗体的检测,其中夹心法ELISA对鼠血清钩体抗体的检测显示较好的敏感性和特异性,适用于钩体病现场血清流行病学大样本调查.     

浅谈钩端螺旋体病的诊断与防治

钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体引起的以发热、黄疸、血红蛋白尿和流产为主要症状的人畜共患病,对畜牧业的危害很大。 [病原] 钩端螺旋体根据生物学特点不同,可分为双曲钩端螺旋体和问号状钩端螺旋体两大群,前者为非致病性或腐生性钩端螺旋体,后者为致病性钩端螺旋体。     

浅谈钩端螺旋体病的诊断与防治

钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体引起的以发热、黄疸、血红蛋白尿和流产为主要症状的人畜共患病,对畜牧业的危害很大。1 病原 钩端螺旋体根据生物学特点不同,可分为双曲钩端螺旋体和问号状钩端螺旋体两大群,前者为非致病性或腐生性钩端螺旋     

用聚合酶链反应（PCR）检测临床标本中的钩端螺旋体

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测临床标本中的钩端螺旋体王际莘译杨裕华校基因ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交有助于确定９种基因型的钩体，其构成２００多种血清型，其中非致病性钩体仅有三种。即双曲钩端螺旋体，Ｌ．ｍｅｙｅｒｉ和Ｌ．ｗｏｌｂａｃｈｉ。致病性钩体由二种构成：问号...     

环介导等温扩增技术在钩端螺旋体病监测中的应用

目的:评价LAMP技术在钩端螺旋体检测与监测中的可行性。方法:采用LAMP技术对感染病人血清及钩体标准菌株感染鼠肾进行检测,同时与卫生行业标准推荐的引物G1/G2 PCR方法进行对比。结果:LAMP快速检测方法 60 min内即可完成检测,具有较高的检测灵敏度,对纯培养的钩体检测灵敏度可达1.5 CFU/ml,比PCR法高出两个数量级,结果肉眼直接可观。同时对21种共42株细菌进行LAMP扩增,仅钩体结果为阳性,显示该LAMP方法具有较强特异性。结论:LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高且成本低廉,在钩体的快速检测和疫情监控中具有良好的应用前景。     

中国七日热型、澳洲型钩端螺旋体分子流行病学调查

确定耕牛是否是七日热型,澳洲型钩端螺旋体的传染源。方法自钩端螺旋体病患者血液及耕牛尿中分离出的１２株七日热型、澳洲型钩端螺旋体野生株染色体ＤＮＡ用限制性内切酶ＥｃｏｒⅠ酶切后,进行染色体ＤＮＡ限制性内切酶图谱及１６Ｓ＋２３ＳｒＲＮＡ基因限制性内切酶片段长度多态性分析。结果自然 钩端螺体病患者血液及耕牛尿中分离的同一血清型的钩端螺旋体野生株的染色体ＤＮＡ酶谱及核糖核酸型相同。血清型不同的钩端螺旋体型     

应用PCR技术检测致病性钩端螺旋体

目的 建立一种能特异检测我国致病性钩端螺旋体所有血清型的PCR方法。方法 从Genbank中选取钩体23SrDNA序列，设计一对种特异性引物。通过Blast验证引物的特异性和广谱性后，用PCR检测我国流行的所有18个血清群钩体代表株，观察其敏感性和特异性。探讨简便的样品处理方法，并对模拟标本进行检测。结果 18个血清群的25株钩体均出现单一482bp的特异性扩增产物，而双曲钩体及其他螺旋体、微生物、空白对照均无任何DNA扩增条带。PCR单一反应最小检出钩体数为8条。用煮沸法、试剂盒、SiO高盐吸附法及氯仿苯酚混合法处理样品对PCR结果无明显影响。对模拟标本的检测符合临床实际要求。结论 PCR方法是一种灵敏度高、特异性强、检测谱广的快速检测钩体的有效方法。     

PCR扩增技术在钩端螺旋体病早期诊断中的应用

目的 研究钩体病患者血清中钩体DNA，为防治该病提供科学依据。方法 应用PCR技术。测定患者血清钩体DNA和MAT法测血清中钩体抗体。结果 40份患者早期血清中PCR法检出阳性8份，53份血清中MAT法检出阳性11份。结论 PCR分子生物学技术应用钩体病早期诊断是一种快速敏感扔效的方法，有利于提高钩体病防治总体水平。     

七日热型、澳洲型钩端螺旋体野生株rRNA基因MRSP分析

目的 :用两对特异引物扩增 12株七日热型、澳洲型钩端螺旋体野生株及相应的 2株参考株的 16S、2 3SrRNA基因 ,用Hinf内切酶对扩增产物作MRSP分析。方法 :应用rRNA基因MRSP分析技术。结果 :不同宿主来源 (钩端螺旋体病人、耕牛 )的同一血清型钩端螺旋体野生株之间具有相同的MRSP型 ,同一血清型钩端螺旋体野生株与相应的参考株的MRSP型也相同 ,故七日热型、澳洲型钩端螺旋体属同一MRSP型。结论 :用此法对钩端螺旋体进行快速鉴定 ,初步分类 ,不失为分子流行病学调查的一种有效手段     

钩端螺旋体毒力相关基因的分布特点分析

目的 探讨钩端螺旋体(钩体)毒力相关基因的分布特点。方法 根据钩体赖型赖株全基因组序列的生物信息学分析资料，选择了12个可能与钩体毒力相关的基因，采用聚合酶链反应(PCR)方法，对中国问号钩体38株参考菌株和81株分离的野生菌株，以及12株非致病性的双曲钩体共131株菌株进行了检测。结果 问号钩体中各毒力相关基因分布广泛，双曲钩体中仅检测到个别毒力相关基因。lipL32基因存在于所有检测的问号钩体，lipL36基因在问号钩体不同菌株中的变异较大，阳性检测率为0％～90．91％；lal608基因在问号钩体黄疸出血群菌株中阳性检测率为87．50％，而在其他血清群菌株间阳性检测率为0％～25．00％，sphA基因仅在问号钩体少数菌株中能检测到，阳性检测率为17．65％，且在中国赛罗群哈焦型参考菌株中未检测到。结论 这些基因可能是问号钩体重要的毒力相关基因。其中lipL32可能是问号钩体各血清群菌株共同抗原的编码基因；lipL36基因可能和问号钩体血清群特异性和多样性有关；lal608基因可能是黄疸出血群菌株特有的基因；哈焦型菌株与问号钩体菌株在基因结构具有较大的差异。     

lipL32—PCR应用于钩端螺旋体检测

目的探讨lipL32-PCR检测方法对钩端螺旋体（钩体）检测的可行性。方法根据外膜脂蛋白基因（@L32）设计引物,与卫生行业标准推荐的引物G1／G2对比,进行特异性与灵敏度研究,并应用于常山县蛙、鼠肾脏标本钩体PCR检测;对浙江省2008年分离菌株进行钩体PCR鉴定。结果lipL32-PCR具有较高的灵敏度和特异性,该引物可特异性扩增致病性钩体DNA,对本实验所用的其他细菌不扩增。2008年分离的钩体菌株PCR鉴定结果与血清学鉴定结果相符;鼠和蛙肾标本进行liL32-PCR和卫生行业标准的G1／G2PCR检测,结果两法符合率为95．0％;lipL32-PCR检测阳性率为10．0％,G1／G2-PCR检测阳性率为5．0％,采用精确计算概率法进行阳性率比较,二者差异无统计学意义（尸：0．25）。结论liL32-PCR检测方法可灵敏、特异地检测致病性钩体,能正确有效地反映野生动物带菌率,为控制钩体病提供依据。     

安徽省皖南山区钩端螺旋体病流行菌群(型)更迭分析

目的 对安徽省皖南山区钩端螺旋体病(简称钩体病)流行菌群(型)更迭情况进行研究，掌握菌群动态，为甲体病防制提供科学依据。方法 分别采用细菌分离培养和显微凝集试验(MAT)对自然人群、病人、疑似病人及宿主动物进行病原学调查和血清学分析。结果：该地区自然人群及病人血清抗钩端螺旋体标体现以赛罗群棉兰型为主，其阳性率分别为34.13%和25.82%。结论：皖南山区流行菌群（型）与20世纪90年代相比出现更迭现象，从黑线姬鼠肾组织标本中新分离出赛罗群棉兰型钩体菌株，啮齿动物仍是该地区钩体病的主要宿主，水牛是棉兰型钩体病宿主之一。     

中越河口-老街边境地区鼠传疾病病原的调查研究

〔目的〕掌握中越河口—老街边境地区鼠携带汉坦病毒、钩端螺旋体和鼠疫杆菌的情况。〔方法〕2008年11月和2009年4月在云南省河口县和越南老街市的居民区用鼠笼捕鼠,取鼠肺、肝和肾脏组织。从鼠肺中提取RNA,用RT-PCR方法扩增汉坦病毒核酸;从鼠肝和肾脏中提取DNA,用PCR方法分别扩增鼠疫杆菌和钩端螺旋体核酸。〔结果〕在河口—老街边境地区捕获黄胸鼠、褐家鼠、大足鼠、小家鼠、臭鼳鼱和斯氏家鼠共198只,黄胸鼠数量最多,占总数的79.8%;从老街黄胸鼠鼠肺中检测到3份汉坦病毒核酸,阳性率为4.41%;从河口黄胸鼠、褐家鼠和大足鼠鼠肾中共检测到7份钩端螺旋体核酸,河口黄胸鼠钩端螺旋体核酸阳性率为11.36%;未检测到鼠疫杆菌核酸。〔结论〕中越河口—老街边境地区鼠传疾病病原有汉坦病毒和钩端螺旋体,应加强当地鼠传疾病的监测。     

问号状钩端螺旋体外膜蛋白Loa22的克隆、表达及对豚鼠的免疫保护作用研究

目的构建问号状钩体强毒赖型56601株外膜蛋白Loa22的重组质粒,表达Loa22蛋白,研究该蛋白对豚鼠的保护作用。方法以问号状赖型钩体56601株基因组为模板扩增目的基因,将Loa22基因克隆至原核表达载体PQE-31,构建PQE31-Loa22重组体,将其转入大肠杆菌M15中诱导表达目的蛋白。于0、2、4周将蛋白及对照PBS分别经豚鼠腹股沟、腋下免疫豚鼠。每次剂量为蛋白50μg/只,末次免疫后2周,用培养3d的56601株钩体从腹腔攻击各免疫组豚鼠(1ml/只)。连续观察15d,观察各免疫组豚鼠发病情况,并取各免疫组豚鼠的肺、肝、肾做病理切片。分析蛋白Loa22对豚鼠的免疫保护作用。结果成功扩增出Loa22基因,构建原核重组质粒PQE31-Loa22。重组质粒能在大肠杆菌M15中高效表达Loa22蛋白。用Loa22蛋白主动免疫的豚鼠用56601株钩体攻击,结果显示无发病现象,而免疫对照组的豚鼠中出现了食欲不振、活动减少等现象,病理切片有明显改变。结论成功构建了Loa22重组原核表达质粒,表达纯化的蛋白可以使豚鼠抵抗同型钩体的攻击,免疫保护作用为82%。