中国人前列腺特异膜抗原基因的克隆及序列测定

目的 克隆人前列腺模特异抗原(prostate-specific membrane antigen,PSMA）的编码区cDNA片段。方法 从前列腺癌组织提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增出人PSMA基因编码区序列,将其克隆至pcDNA3.1载体中,并行序列测定。结果 序列测定表明,克隆获得的2253bp片段与文献报道的人PSMA基因编码区cDNA序列一致。结论 本研究为进一步研究 PSMA的生物学性能和用于前列腺癌诊断治疗的可能性打下了基础。     

人前列腺特异性膜抗原基因启动子/增强子表达载体的构建及组织特异性鉴定

目的：构建前列腺特异性表达的人前列腺特异膜抗原（PSMA）基因启动子/增强子表达载体，并进行组织特异性鉴定。 方法：从人外周血中提取基因组DNA，采用PCR技术分别扩增PSMA上游 1 175 bp 的启动子序列，及第三内含子中258 bp的增强子序列，将两个序列定向克隆至荧光素酶报告基因表达质粒pGL3-Basic，构建前列腺特异性表达载体pGL3-PSMP-PSME。将构建载体用脂质体分别转染前列腺癌PC-3M细胞株及4种非前列腺癌细胞株，48 h后通过检测荧光素酶表达活性，确定克隆的启动子及增强子的活性及其组织特异性表达活性。结果：构建的pGL3-PSMP-PSME质粒经酶切及DNA测序分析鉴定，证实克隆片段的大小、插入方向及其序列正确。细胞转染结果显示， pGL3-PSMP-PSME在PC-3M细胞株中表达活性明显高于其它4种非前列腺癌细胞株。结论：构建的前列腺表达载体具有较高的组织特异性, 为进一步研究PSMA调控序列驱动治疗基因进行前列腺癌的靶向生物治疗奠定了基础。     

新型前列腺特异膜抗原剪接变异体的发现及临床意义初步探讨

目的:探讨前列腺特异膜抗原（PSMA）及其与前列腺癌发生、发展的关系，寻求更为特异的前列腺癌诊断和治疗的靶点。 方法:采用RT-PCR和DNA测序技术，克隆PSMA基因新的剪接变异体，并根据其序列信息，设计特异性引物，检测其在不同病变前列腺组织及不同组织来源肿瘤细胞中的表达。 结果:发现了一种新的PSMA剪接变异体，其在前列腺癌、前列腺增生及正常前列腺组织中的表达率分别为92.6％、78.8％及10.0％，且特异表达于前列腺癌LNCaP细胞株，而在前列腺癌PC3细胞株、膀胱癌、肾癌、肝癌细胞株中均不表达。 结论:发现了一种新型PSMA剪接变异体（定名为PSMA5），并证实该变异体与前列腺癌及前列腺增生有明显相关性，为研究前列腺癌的发生机制和寻求前列腺癌特异性诊治靶点提供了新的线索。     

分泌型重组mPSMA腺病毒的构建及表达

目的 构建分泌型重组小鼠前列腺特异膜抗原腺病毒(Ad-mPSMA),并检测其免疫效果。方法 利用AdEasy重组腺病毒载体系统,通过PCR扩增小鼠PSMA全长序列,并在基因的5′端加上人IL-2的信号肽序列,亚克隆至pAdenoVator CMV5穿梭质粒,与pAdenoVator ΔE1/E3进行同源重组获得pAd-mPSMA重组质粒,经HEK293细胞包装扩增获得重组病毒颗粒。通过RT-PCR及Western blot检测小鼠PSMA基因在HeLa细胞中的转录及表达。以该重组腺病毒免疫小鼠,对mPSMA的特异性抗体进行检测。结果 成功将mPSMA基因克隆至pAdenoVator ΔE1/E3载体上,病毒滴度为1.32×1011IU/ml,RT-PCR证实mPSMA的转录,Western blot证实mPSMA的分泌表达,并在小鼠血清中检测到mPSMA的特异性抗体。结论 成功构建分泌型重组mPSMA腺病毒,为前列腺癌特别是激素难治性前列腺癌的预防和治疗提供了更广阔的前景。     

小鼠端粒酶蛋白亚单位真核表达载体的构建和序列测定

目的： 克隆小鼠端粒酶蛋白亚单位(mTERT)的cDNA，构建真核表达载体并进行序列测定。 方法: 从肝癌细胞中提取总RNA，采用RT-PCR 技术扩增mTERT的基因编码区序列，将序列定向克隆至真核表达载体pAC，并进行序列测定。 结果： 获得mTERT编码区 3 369 bp的cDNA片段，用PCR和限制性内切酶分析鉴定，表明获得重组质粒pAC-mTERT。通过对mTERT编码区cDNA序列测序证实其与GenBank中的已知序列一致。 结论： 成功克隆了mTERT编码区序列，并构建了其真核表达载体，为以TERT为基础的肿瘤生物治疗奠定基础。     

构建PSMA shRNA慢病毒载体转染293T细胞后PSMA mRNA和蛋白的表达变化

目的：利用基因工程技术筛选获得阻断前列腺癌细胞株LNCaP中前列腺癌特异性膜抗原 (PSMA) 表达的shRNA序列，并构建慢病毒载体。观察转染前列腺癌细胞后对PSMA mRNA和蛋白表达的影响。方法：〖HTSS〗根据PSMA基因信息，设计siRNA1、siRNA2、siRNA3三条针对PSMA基因cds区的siRNA序列，组建shRNA对应的4对互补的单链DNA，包括siRNA的正义链和反义链；正义链序列按5向3顺序依次为：酶切位点（BamHⅠ）、干扰序列（19 bp）、loop环（TTCAAGAGA）、干扰序列的反向互补序列（19 bp）、终止信号（TTTTT）、酶切位点（EcoRⅠ）。将合成的序列插入空载体pSIH1-H1-copGFP shRNA vector中，转染前列腺癌细胞后，通过real-time PCR检测对PSMA mRNA表达，通过Western blotting检测PSMA蛋白的表达。结果：〖HTSS〗设计的3条针对PSMA的序列中第2条的抑制效果最好，目的序列位于PSMA（NM_004476）的1207到1226，茎环序列为5-GATCC GTCTCAAAGTGCCCTACAA TTCAAGAGA TTGTAGGGCACTTTGAGAC TTTTT G-3。其对前列腺癌细胞株中PSMA mRNA表达的抑制率为60%，对PSMA蛋白表达的抑制率为86%。转染细胞后，细胞可以稳定低表达PSMA。结论：〖HTSS〗成功获得阻断前列腺癌细胞株LNCaP PSMA表达的shRNA序列，并构建慢病毒载体，pSIH-PSMA-siRNA2转染前列腺癌细胞后对PSMA mRNA 表达的抑制率为60%，对PSMA蛋白表达的抑制率达86%。为后期研究PSMA在前列腺癌发病中的作用机制以及免疫导向治疗等提供了实验基础。     

PSMA基因沉默的前列腺癌细胞中肿瘤转移相关基因表达的芯片分析

目的: 探讨前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen, PSMA)在前列腺癌转移过程中的作用通路。方法: 针对PSMA mRNA序列设计合成siRNA序列,脂质体转染LNCaP细胞特异性下调PSMA基因的表达,通过肿瘤转移基因芯片分析84个肿瘤转移相关基因的表达差异。结果: 成功设计了siRNA序列并制备最佳干扰效果的干扰样,mRNA干扰效果达到75%以上,蛋白水平干扰效果达68%以上。通过基因芯片检测发现在下调PSMA基因表达后,有CDH6、CXCL12等10个基因发生了显著上调,而CCL7、MDM2等4个基因发生显著下调表达。结论: 初步发现PSMA参与前列腺癌转移信号通路的调节,为进一步研究PSMA的生物学功能,探索前列腺癌的转移机制奠定了基础。     

人PSCA真核表达质粒的构建及稳定转染B16细胞系的建立

目的:构建真核表达质粒pcDNA3.1-PSCA,通过稳定转染建立高效表达人前列腺干细胞抗原(PSCA)的小鼠黑色素瘤B16细胞系。方法:利用PCR扩增出人PSCA全长基因的cDNA编码区序列,使用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,得到重组表达质粒pcDNA3.1-PSCA。双酶切及测序鉴定后,利用脂质体法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,G418加压筛选后得到阳性克隆。通过流式细胞术、免疫荧光及Western blot检测PSCA在细胞系中的表达情况。结果:经测序及双酶切鉴定,pcDNA3.1-PSCA重组质粒构建正确;稳定转染人PSCA的B16细胞系表达率接近100%。结论:建立的稳定转染人PSCA的B16细胞系能够高效表达PSCA基因,为抗前列腺癌疫苗的功能研究奠定了基础。     

人β防御素-2与前列腺癌特异性膜抗原嵌合蛋白真核表达质粒构建及其诱导的小鼠特异性免疫应答

探索人β防御素2(hBF)-2)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)共表达重组核酸疫苗对前列腺癌的免疫治疗。研究以pcDNA3．1为载体,构建重组质粒pcDNA3．1／PSMA和pcDNA3．1／hBD-2-PSMA．通过RT-PCR和免疫组化检测其表达。并免疫小鼠,进行血清中抗体检测．CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞数目测定及CTL特异性杀伤作用检测。结果显示构建的质粒转染COS-7细胞后能表达目的基因,     

抗PSMA全人源单链抗体制备、鉴定及初步应用

目的 构建抗PSMA全人源单链抗体库,筛选抗PSMA人源单链抗体(ScFv)并鉴定,应用人源ScFv进行分子显像.方法 从健康人外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人轻链和重链可变区基因,重叠PCR拼接轻重链可变区基因,构建ScFv的表达载体pDF-ScFv,电转染大肠杆菌XL1 Blue,获得噬菌体单链抗体库,酶切鉴定及测序分析,用PSMA抗原进行富集筛选,阳性克隆用Western-Blot 和DNA指纹图谱鉴定.应用直接标记法将125I标记在ScFv上,通过尾静脉注入前列腺癌动物模型体内,2h后进行小动物SPECT/CT显像,观察人源ScFv对前列腺癌的定位性能.结果 成功构建抗PSMA全人源单链抗体库,库容约2.16×108,插入片段经酶切及DNA测序证实为人抗体轻链和重链可变区基因.筛选出6株ScFv阳性克隆,Western-Blot证实6株ScFv均能与PSMA抗原特异性结合,DNA指纹图谱鉴定6株ScFv可变区基因具有多样性.动物模型的分子显像:人源ScFv能与前列腺癌PSMA抗原特异性结合,并使肿瘤显像.结论 成功构建了一个全人源噬菌体单链抗体库,并筛选出了抗PSMA单链抗体,单链抗体在动物模型体内能靶向结合前列腺癌细胞,从而为前列腺癌的靶向诊断和治疗奠定了基础.     

前列腺特异性膜抗原在前列腺癌中的表达及临床意义

目的 研究前列腺特异性膜抗原(PSMA)在前列腺癌中的表达及其与Gleason分级之间的关系,同时探讨其在前列腺癌诊断中的价值.方法 采用免疫组化EnVision法检测PSMA在前列腺癌、前列腺上皮内瘤变(PIN)和良性前列腺增生症(BPH)中的表达.结果 PSMA在BPH、PIN和前列腺癌中均表达.在BPH中,PSMA阳性表达部位在前列腺腔缘或顶端/胞质表达,而在PIN中表达模式为胞质伴胞膜阳性,前列腺癌为顶端/胞质、胞质伴胞膜阳性或胞质表达阳性.PSMA在分化差前列腺癌中多为胞质表达,而在分化好的癌中为顶端/胞质和胞质伴胞膜表达.PSMA表达强度在PIN和前列腺癌中明显高于BPH(P＜0.05),同时PSMA染色强度与Gleason评分呈正相关(P＜0.05).结论 PSMA与Gleason分级密切相关,PSMA表达模式和染色强度的改变对PIN和前列腺癌诊断具有参考价值.     

PSMA对LNCaP细胞生长、迁移及ERK蛋白活性的影响

目的: 利用我们已经成功沉默前列腺特异性膜抗原(PSMA)的LNCaP前列腺癌细胞株,探讨PSMA对LNCaP细胞磷酸化胞外信号调节激酶(ERK)及细胞生长、迁移的影响,为进一步研究PSMA在前列腺癌发展中的作用提供理论基础。方法: 实验对象包括携带可稳定抑制PSMA表达siRNA慢病毒的LNCaP细胞组(实验组),携带对任何基因无干扰作用siRNA慢病毒的LNCaP细胞组(空转组),同时建立未进行处理的普通LNCaP细胞组(对照组),分别对在一般培养基及添加ERK蛋白上游抑制剂的3组细胞,使用Western blotting和细胞免疫化学的方法检测MAPK/ERK蛋白活性,并用MTT描绘细胞生长曲线、Transwell观察细胞迁移情况。结果: 在一般培养基的3组细胞中,Western blotting提示实验组磷酸化ERK蛋白表达明显低于对照组和空转组;免疫细胞化学结果显示实验组染色明显比对照组和空转组弱,阳性细胞数较少;MTT绘制生长曲线,得到实验组细胞的增殖生长能力较对照组、空转组降低;Transwell结果提示实验组较对照组和空转组细胞的增殖迁移能力降低。在ERK磷酸化被抑制的情况下,3组细胞磷酸化ERK蛋白均低表达,MTT及Transwell检测显示其生长迁移能力都处于低水平,且与在一般培养基中实验组的效应类似。结论: 初步发现PSMA可能通过上调前列腺癌LNCaP细胞ERK蛋白的活性,从而在其生长、迁移中起正向调节作用。     

Co-administration of a DNA vaccine encoding the prostate specific membrane antigen and CpG oligodeoxynucleotides suppresses tumor growth

BACKGROUND: Prostate-specific membrane antigen (PSMA) is a well characterized prostate-specific tumor associated antigen. Its expression is elevated in prostate carcinoma, particularly in metastatic and recurrent lesions. These observations suggest that PSMA can be used as immune target to induce tumor cell-specific recognition by the host and, consequently tumor rejection. We utilized a DNA-based vaccine to specifically enhance PSMA expression. An immune modulator, such as CpG oligodeoxynucleotides which promote Th1-type immune responses was combined to increase the efficacy of tumor recognition and elimination. METHODS: A eukaryotic expression plasmid pCDNA3.1-PSMA encoding full-length PSMA was constructed. C57BL/6 mice were immunized with endotoxin-free pCDNA3.1-PSMA alone or in combination with CpG oligodeoxynucleotides by intramuscular injection. After 4 immunizations, PSMA specific antibodies and cytotoxic T lymphocyte reactivity were measured. Immunized C57BL/6 mice were also challenged subcutaneously with B16 cells transfected with PSMA to evaluate suppression of tumor growth. RESULTS: Vaccine-specific cytotoxic T lymphocytes reactive with B16 cells expressing PSMA could be induced with this treatment schedule. Immune protection was observed in vaccinated mice as indicated by increased tumor growth in the control group (100%) compared with the groups vaccinated with DNA alone (66.7%) or DNA plus CpG oligodeoxynucleotides (50%) respectively. Average tumor volume was smaller in vaccinated groups and tumor-free survival time was prolonged by the vaccination. CONCLUSION: The current findings suggest that specific anti-tumor immune response can be induced by DNA vaccines expressing PSMA. In addition, the suppression of in vivo growth of tumor cells expressing PSMA was augmented by CpG oligodeoxynucleotides. This strategy may provide a new venue for the treatment of carcinoma of prostate after failure of standard therapy.     

PSMA对JNK/SAPK通路的激活及对前列腺癌细胞凋亡的调控*

 目的：探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)是否通过c-Jun氨基末端激酶/应激激活的蛋白激酶(JNK/SAPK)通路对前列腺癌细胞凋亡进行调控。方法：利用前期研究中建立的高效阻断PSMA表达的shRNA慢病毒载体,阻断前列腺癌细胞中PSMA的表达作为实验的干扰组;同时利用构建的PSMA载体转染前列腺癌细胞,促进前列腺癌细胞中PSMA的表达作为阳性实验组;不做任何处理的细胞株作为空白组;加入JNK/SAPK抑制剂SP600125作为阴性对照。Western blotting及免疫细胞化学方法观察各组细胞p-JNK/SAPK的表达量,CCK-8法检测细胞生长情况、流式细胞术检测细胞周期及凋亡。结果：Western blotting及细胞免疫化学提示抑制PSMA表达后,p-JNK/SAPK表达水平下降;增强PSMA表达后p-JNK/SAPK表达水平上升;在SP600125作用下,3组细胞p-JNK/SAPK均处于较低水平,且彼此无明显差异。CCK-8法和流式细胞术检测细胞周期提示PSMA表达受抑制后细胞增殖能力下降,细胞S期百分比减少;增加PSMA表达,细胞增殖能力增强,S期百分比增加;在SP600125作用下,3组细胞增殖和S期百分比均处于低水平,无明显差异。在抑制PSMA表达组中,前列腺癌细胞的凋亡率明显升高;而在增强PSMA表达组,细胞凋亡率明显降低;加入SP600125后,细胞凋亡率均低于常规培养组。结论：PSMA通过上调JNK/SAPK信号通路对前列腺癌细胞的增殖、细胞周期及凋亡产生影响,但JNK/SAPK并不是唯一通路。     

Prostate-specific membrane antigen expression in the neovasculature of gastric and colorectal cancers

Prostate-specific membrane antigen (PSMA), a type II transmembrane metallo-peptidase highly overexpressed in prostate cancer cells, has been studied as a targeting molecule in prostate cancer. Recently, PSMA has also been found to be expressed in the neovasculature of multiple nonprostatic solid tumors. Because of its unique expression pattern limited to tumor-associated endothelial cells, PSMA may also be an interesting molecule for vascular targeting. In this study, PSMA expression was determined by immunohistochemistry in 119 cases of primary gastric adenocarcinoma, 130 cases of primary colorectal adenocarcinoma, and 24 metastasis of colorectal adenocarcinoma. Expression data were correlated with clinicopathologic information. PSMA expression was detected in tumor-associated neovasculature of 79 (66%) of 119 gastric and 110 (85%) of 130 colorectal carcinomas. Furthermore, the neovasculatures of 16 (84%) of 19 liver and 4 (80%) of 5 nodal metastases from colorectal carcinomas were prostate-specific membrane antigen positive. There was a trend for high-grade tumors to higher PSMA expression (Spearman r = 0.18, P = .046) in colorectal cancers. No association between PSMA expression and overall- or disease-free survival was observed in gastric or colorectal cancers. This study provides the first in-depth look at PSMA expression in gastric and colorectal cancer. Because of its highly tumor-restricted expression and its accessibility to targeted therapy, PSMA represents a promising therapeutic and diagnostic target in colorectal and gastric cancer.