重组人干细胞因子菌种稳定性鉴定

细胞因子(stem cell factor，SCF)是一种对造血细胞有重要作用的因子，它主要作用于早期多能干细胞、祖细胞，同时对晚期成熟血细胞也有作用，在肿瘤放疗和化疗的辅助治疗、体外造血、骨髓移植等方面有着广阔的应用前景。为了满足临床和科研工作对rhSCF的需求，本所已构建了高效表达rhSCF的工程菌DH5α(pMG604）。菌种的稳定性是     

重组人干细胞因子理化性质和生物活性分析

干细胞因子（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ,ＳＣＦ）是一种对造血细胞有重要作用的因子,在自体外周血造血前体细胞移植、肿瘤放化疗的辅助治疗、贫血和其他血液病的治疗方面有良好的应用前景。目的：分析所制备的ｒｈＳＣＦ的理化性质和生物活性。方法：用反相高效液相色谱、质谱、凝胶高效液相色谱等方法分别测定了制品的纯度、分子量、氨基酸组成,紫外光谱等,并用ＴＦ－１细胞测定了液相色谱等方法分别测定了制品的纯度、     

干细胞因子的辐射防护作用及其机制

干细胞因子（ＳＣＦ）不仅是维持生命活动所需要的，而且在抵抗电离辐射对机体的作有及修复辐射所致损伤中都是必不可少的。许多作者发现，ＳＣＦ能明显改善受致死剂量照射动物的长期生存率，这种作用在与其它造血刺激因子和抗放剂协同作时更为明显。目前认为，ＳＣＦ的主要防护机制是可以抑制凋亡和促进细胞周期的进程，加速骨髓及外周血多种有效成分的增殖和分化等，且其抑制凋亡机制与ｐ５３、Ｃａ＾２＋内流及ｃａｓｐａｓｅ的介     

干细胞因子的辐射防护作用及其机制

干细胞因子(SCF)不仅是维持生命活动所需要的,而且在抵抗电离辐射对机体的作用及修复辐射所致损伤中都是必不可少的。许多作者发现,SCF能明显改善受致死剂量照射动物的长期生存率,这种作用在与其它造血刺激因子和抗放剂协同作用时更为明显。目前认为,SCF的主要防护机制是可以抑制凋亡和促进细胞周期的进程,加速骨髓及外周血多种有效成分的增殖和分化等,且其抑制凋亡机制与p53、Ca2+内流及caspase的介导等有关。     

重组人乙型肝炎病毒核糖核酸酶H基因工程菌的生物活性研究

目的：研究表达乙型肝炎病毒核糖核酸酶H(HBV—RNaseH)工程菌的发酵条件。方法：采用摇瓶发酵，研究不同宿主菌对表达HBV—RNaseH的效果；同时对培养基、诱导时期、诱导时间、初始pH等发酵条件以及质粒稳定性进行研究。结果：选用E coliBL21为宿主菌，在LB培养基中培养至A600为0．6时，诱导表达4．5h，HBV—RNaseH表达量最高达33．6％。而且重组质粒具有良好的分离稳定性和结构稳定性。结论：此发酵条件可以比较好的提高HBV—RNaseH的表达量，为发酵规模的扩大奠定了基础。     

失代偿期肝硬化患者外周血干细胞因子水平测定及意义探讨

目的探讨失代偿期肝硬化患者外周血干细胞因子（stemcellfactor,SCF）与健康体检者的差异。方法失代偿期肝硬化患者20例及门诊体检者15例．ELISA法检测各组血清SCF水平。结果失代偿期肝硬化患者血清SCF水平明显高于健康对照组（2612±39．4ng／L vs．2263±25．7ng/L,P〈0．01）,差异有统计学意义。结论失代偿期肝硬化患者外周血清SCF水平增高,提示肝硬化失代偿时肝再生可能需要自体干细胞的参与。     

重组人Flt3配体联合其它细胞因子对免疫细胞的体外抗辐射作用研究

目的：研究重组人Flt3配体(rhFL）及其他细胞因子在体外免疫细胞的抗辐射作用及其可能机理。方法：用流细胞仪分析照射前后外周血单个核细胞（PBMC）表型及rhFL对受PBMC有型的影响。[^3H]-TdR测定细胞的增殖能力。PBMC来源贴壁细胞经细胞因子诱导树突状细胞（DC）,并观察辐射对诱导DC的影响及rhFLDC的抗辐射效应;用PI－Annexin,V、DNALadder分析细胞凋亡。结果：PBMC在体外经15Gy照射后,CD^8 、CD^56 细胞明显减少,照射产细胞培养液中加入100ng/mlrhFL,可促进CD^56 细胞的;有应用rhFL及照射后联合应用IL－2等细胞因子,可促进受照射CD^8 、CD^56 细胞的恢复;rhFL可协调,GM－CSF、IL－4、TNFα产生DC,并使DC细胞的数量较常规方法诱导产生的数量增加6倍,而rhFL对DC分化诱导的辐射作用有明显的抗性;rhFL可抑制照射所致的细胞凋亡。结论：rhFL单独或与其他细胞因子联合应用,对人外周血免疫细胞具有明显的抗辐射效应,对这辐射损伤机体遥调节和恢复具有重要的使用价值。     

重组人干细胞因子对猕猴外周血干细胞的动员作用

给正常成年猕猴每天一次皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子 10 μg·kg-1·d-1(μKD)或 (和 )重组人干细胞因子 2 0、5 0和12 5 μKD ,前者给药 5天 ,后者 8天 ,观察国产重组人干细胞因子动员外周血干细胞的效果。结果表明 ,给药后外周血白细胞数最高值rhG CSF单独给药组为 2 0 6 % ,rhSCF单独给药为 2 0 0 % ,而两者联合给药后为 2 80 %～ 310 % ;外周血CFU GM较动员前分别升高 1 1、1 3和 5 8～7 9倍 ;3个联合动员组外周血CD34+ 细胞数分别为动员前的 2 0、2 4和 35倍。说明rhSCF对外周血干 /祖细胞有明显的动员作用 ,rhSCF+rhG CSF联合动员效果更佳     

干细胞因子对红白血病细胞系TF-1凋亡的抑制作用

目的 :探讨干细胞因子 (stemcellfactor ,SCF)阻止红白血病细胞系TF 1进入凋亡程序的作用。方法 :进行3H TdR掺入实验、细胞存活实验、细胞基因组DNA电泳分析和流式细胞术分析。结果 :发现TF 1细胞对SCF的反应存在量 半高效关系 ,在SCF存在时细胞存活率明显提高 ,TF 1细胞系在SCF饥饿 2 4h时出现DNA梯型条带 ;流式细胞术检测显示 ,在SCF饥饿 36h后 ,在G1峰前出现凋亡特有的AP峰。结论 :SCF有阻滞或抑制红白血病细胞系TF 1凋亡的作用。     

HGF基因修饰增强间充质干细胞的免疫抑制作用

目的：探讨HGF基因在间充质干细胞（mesenehymal stem cell，MSC）中过表达对细胞生物学的影响，为扩充MSC临床应用范围提供依据。方法：用携带HGF基因的重组腺病毒感染人骨髓来源的间充质干细胞后。与对照细胞相比，进行以下项目的检测：FCM测定细胞表型；MTT法测定细胞增殖能力；ALP和钙定量以及组织化学染色检测细胞体外成骨和成脂肪能力；^3H—TdR掺入法测定MSC—HGF对混合淋巴细胞反应中效应细胞增殖活性的抑制作用。结果：HGF基因转染后MSC表型、体外增殖和分化能力无改变；混合淋巴细胞反应中，MSC—HGF对异基因抗原诱导的淋巴细胞增殖活性的抑制效应存在剂量依赖关系；MSC—HGF／MSC与效应细胞比例为1：80时，MSC组淋巴细胞增殖活性（cpm值）降低19．8％，MSC—HGF组降低68．3％，抑制率是MSC组的3．45倍。结论：HGF基因转染的人骨髓MSC仍维持固有的增殖和分化能力，而对体外细胞免疫反应具有更强的抑制效果，提示MSC—HGF在造血干细胞移植和器官移植中的潜在应用价值。     

胶质细胞源性神经营养因子基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的：分离胶质细胞源性神经营养因子（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ,ＧＤＮＦ）基因,并在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得表达。方法：从人多形性成胶质细胞瘤细胞株ＢＴ３２５ 中提取总ＲＮＡ ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术分离ＧＤＮＦ基因,构建表达载体ｐＢＶ－ＧＤＮＦ,转化大肠杆菌,温控诱导ＧＤＮＦ的表达。结果与结论：分离得到的人ＧＤＮＦ基因,在大肠杆菌中得到高效表达,表达产物占全菌总蛋白的２４．７％ ,初步纯化后纯度达９０％ 以上。     

重组人干细胞因子对放射病患者造血细胞的体外作用

本文作者报道了用体外半固体培养方法测试重组人干细胞因子、重组人粒－单系集落刺激因子、重组人白细胞介素－３和重组人粒－单系集落刺激因子／白细胞介素－３的融合蛋白等４种造血生长因子对５例骨髓型急性放射病人远期造血细胞体外生长的作用．结果显示；用重组人干细胞因子对正常骨髓最佳刺激浓度为５×１０４ｎｇ／Ｌ的４例病人有不同程度的正向刺激作用，１例病人呈抑制作用，对重组人干细胞因子反应不均一性与受照剂量有关．细胞表面抗原和细胞形态，组化测定，重组人干细胞因子在本文体系中主要促进粒－单系集落生长．重组人干细胞因子与其它３种造血生长因子伍用可增加集落产率增大集落体积．作者对融合蛋白也作了比较分析，认为融合蛋白是一种非常有价值新的造血生长因子．     

人降钙素基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：利用大肠杆菌表达具有生物活性的人降钙素（ｈＣＴ）。方法：以人类基因组ＤＮＡ，为模板，经ＰＣＲ扩增获取ｈＣＴ基因片段，测序分析克隆到ｐＵＣ１９载体中的ＰＣＲ产物，确定得到两种ＣＴ基因序列，其中１＾＃与文献报道完全一致，２＾＃序列中含有（Ｇ６４／Ａ）点突变，采用带有热诱导启动子的高效表达载体ｐＢＶ２２０，对所获得的基因进行了表达，并利用大鼠降血钙实验，对表达产物的活性进行了检测。结果：所获得的ｒ     

肠毒素大肠杆菌定居因子CS6抗原基因在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建表达肠毒素大肠杆菌(ETEC)定居因子CS6的重组质粒，并在大肠杆菌DH5d中高效表达。方法：利用基因工程的方法，将含有cS6基因的质粒pMG233用限制性内切酶Cla Ⅰ酶切，得到长约3．1kb的CS6片段(含有cS6结构基因及调控基因的DNA片段)；并与用限制性内切酶Cla Ⅰ酶切的表达载体质粒pBV321连接．得到含有CS6片段的重组质粒pMG235，转化至大肠杆菌DH5a。结果：SDS-PAGE、Western印迹及免疫荧光观察的结果表明，重组菌DH5a／pMG235可高效表达相对分子质量为14600的CS6抗原蛋白，并在重组菌表面表达，表达产物可被抗CS6多克隆抗体识别。结论：重组菌可稳定表达肠毒素大肠杆菌定居因子抗原CS6。     

携带胶质细胞源性神经营养因子基因的骨髓间充质干细胞移植对兔坐骨神经缺损的治疗作用

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)局部长期高表达对坐骨神经缺损的治疗作用.方法 实验组以骨髓间充质干细胞(MSCs)作为种子细胞,以慢病毒介导的GDNF转染骨髓间充质干细胞后,结合细胞外基质凝胶构建神经移植复合体共同移植入兔20 mm坐骨神经缺损处.以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因.同时设基质凝胶对照组和基质凝胶+MSCs对照组,每组10只.结果 实验组部分兔坐骨神经连续性完全恢复,而两对照组坐骨神经连续性均未完全恢复.转染GDNF基因的MSC迁移距离可达20 mm,提示该移植细胞与宿主细胞具有较好的整合作用,且实验组绿色荧光蛋白(GFP)+胶质纤维酸性蛋白抗体(GFAP)、GFP+S100双标细胞占GFP阳性细胞的百分比分别高达70%和60%,而基质凝胶+MSCs对照组以上两种阳性细胞的百分比为40%和30%.结论 移植的基因工程MSCs能够明显促进损伤坐骨神经的再生,GDNF可能促进了MSCs向雪旺细胞样细胞分化.     

人源性角质细胞生长因子(KGF)的克隆及其表达分析

目的：克隆出正确的人源性角质细胞生长因子（KGF）并探讨影响其表达的因素。方法：应用RT－PCR技术克隆出KGF基因，并用pBV220表达质粒对其进行表达，然后用RNAdraw对其RNA进行分析。结果：带有信号肽的KGF基因在pBV220中表达量为10％左右，而去掉信号肽的KGF基因在pBV220中表达量估计只有1％－2％；利用RNAdraw分析的结果表明前者RNA前端没有形成茎环结构，而后者则形成了茎环结构，结论：KGF基因在细菌中表达量较低，信号肽是影响其表达量的重要因素。     

人脐带间充质干细胞对NOD/SCID小鼠造血重建的影响

目的探讨脐带间充质干细胞(MSC)对NOD/SCID小鼠造血重建的影响。方法以足月胎儿脐带分离的MSC和脐血单个核细胞作为供体,化疗预处理后NOD/SCID小鼠作为受体。将小鼠随机分为以下3组(每组10只):单纯化疗组,仅做化疗预处理,不输注任何细胞;单移植组,化疗后输注单纯脐血单个核细胞(1×107/只);共移植组,化疗后输注脐血单个核细胞(1×107/只)和脐带MSC(1×106/只)。移植后第3、7、14、21、28天分别计数小鼠外周血白细胞,观察其变化;移植后第6周计算小鼠的生存率,并用流式细胞仪检测小鼠骨髓内人CD45 细胞的表达(即植入率)。结果共移植组小鼠移植后第14、21天外周血白细胞[分别为(5.73±0.38)×109/L、(5.90±0.42)×109/L]明显高于单移植组[分别为(3.30±0.58)×109/L、(4.83±0.41)×109/L],差异有显著性(P<0.05)。移植后第6周,共移植组小鼠骨髓人CD45 细胞表达明显高于单移植组(P<0.05),而两组小鼠生存率无显著性差异(P>0.05)。结论成功地建立了异种异基因小鼠脐血移植模型,脐带MSC作为一种新来源的MSC,能够促进造血重建,提高植入率,有望应用于临床共移植治疗中。