改良组织块法培养SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞

目的应用改良植块法体外培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞。方法15只SD雄性大鼠,随机分成3组,每组5只,分别采用组织块法、酶消化法及改良组织块法分离大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,在含双抗及20%胎牛血清DMEM,37℃、5%CO2、95%空气的细胞培养箱静置中培养,相差显微镜观察细胞形态及扩增情况,用α-平滑肌肌动蛋白(a-SM-Actin)及结蛋白(desmin)免疫组织化学染色,鉴定细胞类型。结果α-平滑肌肌动蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为96.3%,在成纤维细胞中阳性率为23.8%,结蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为74.4%,在成纤维细胞中呈阴性。三组间结蛋白阳性细胞率具有显著差异,改良组织块法组结蛋白阳性细胞率高于组织块法和酶消化法组。结论结蛋白是鉴定海绵体平滑肌细胞的特异性指标,改良组织块法可获纯度更高、结构和功能良好的阴茎海绵体平滑肌细胞。     

牛蒡根化学成分对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞增殖的影响

目的：观察牛蒡根化学成分牛蒡低聚果糖和山奈素对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞增殖的影响,探讨牛蒡根对勃起功能障碍治疗作用的可能机制。方法：利用MTT体外药物筛选法测试受试样品对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞体外增殖活性的影响。结果：牛蒡低聚果糖100、50μg/ml能够明显促进细胞的增殖,且有时间依赖性;山奈素100、50μg/ml对细胞的增殖有抑制作用;25、12.5μg/ml能够明显促进细胞的增殖,且有时间依赖性。结论：牛蒡根化学成分对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞有增殖作用。     

自发性高血压大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞培养及鉴定

目的:探讨自发性高血压大鼠(SHR)阴茎海绵体平滑肌(CCSM)细胞体外培养的方法、生物学性状及与WKY大鼠CCSM细胞培养的区别.方法:采用组织块培养法并应用差速贴壁法进行纯化,倒置相差显微镜观察其形态,免疫荧光与流式细胞仪法进行鉴定.结果:镜下可见平滑肌细胞呈梭形生长、平行排列及部分区域峰-谷现象,免疫荧光显示胞浆α-肌动蛋白染色呈阳性.WKY大鼠CCSM细胞第4d开始从组织块边缘游离出,SHR大鼠CCSM细胞第8d开始游离出.WKY与SHR大鼠CCSM细胞经纯化一次后纯度(％):WKY=97.00±1.03,SHR=84.90±5.99,差异具有统计学意义(P＜0.01);WKY与SHR大鼠CCSM细胞经两次纯化后纯度(％):WKY=98.24±1.05,SHR=96.92±1.06,其差异无统计学意义(P＞0.05).结论:SHR与WKY大鼠CCSM细胞的原代培养在生长时间及纯化上存在显著差异,但可通过适当方式缩小其差异并在短期内获得大量高纯度SHR大鼠CCSM细胞,为高血压性勃起功能障碍的研究奠定基础.     

气道平滑肌细胞培养方法探讨

目的建立气道平滑肌体外稳定培养的方法。方法利用组织贴块法和胶原酶消化法培养大鼠气道平滑肌细胞,培养的细胞经形态学和免疫细胞化学染色鉴定。结果培养细胞呈典型的"谷峰状"生长,胞浆内特异性的平滑肌肌动蛋白阳性表达,符合平滑肌细胞的形态学特征和生物学特性。结论建立了高纯度、性能稳定且生长快速的大鼠ASMCs体外培养模型,为相关疾病的研究奠定良好的基础。     

气道平滑肌细胞培养的探讨

目的 建立气道平滑肌体外稳定培养的方法。方法 利用组织贴块法和胶原酶消化法培养大鼠气道平滑肌细胞,培养的细胞经形态学和免疫细胞化学染色鉴定。结果 培养细胞呈典型的"谷峰状"生长 ,胞浆内特异性的平滑肌肌动蛋白阳性表达,符合平滑肌细胞的形态学特征和生物学特性。结论 建立了高纯度、性能稳定且生长快速的大鼠ASMCs 体外培养模型,为相关疾病的研究奠定良好的基础。 【关键词】 气道 平滑肌细胞 细胞培养     

高血压大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化

目的 探讨高血压大鼠阴茎海绵体平滑肌是否存在表型转化及对勃起功能的影响.方法 16周龄雄性自发性高血压大鼠(SHR)及其同系正常血压大鼠(WKY),测量尾动脉收缩压,颈部皮下注射阿朴吗啡后检测阴茎勃起功能,然后将大鼠分为高血压勃起功能障碍组(HBP&ED)、高血压组(HBP)和正常对照组(Control).免疫组化染色和彩色图文分析系统分析各组大鼠阴茎海绵体中平滑肌细胞碱性调宁蛋白(calponin 1)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达,实时荧光定量RT-PCR分析各组大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞calponin 1 mRNA和OPN mRNA的相对表达量.结果 在大鼠阴茎海绵体中calponin 1和calponin 1 mRNA表达情况:HBP&ED组低于HBP组(P=0.021,P=0.006)和control组(P=0.000,P=0.001),HBP组低于control组(P=0.000,P=0.015);OPN和OPN mRNA表达情况:HBP&ED组高于HBP组(P=0.000,P=0.000)及control组(P=0.000,P=0.000),HBP组高于control组(PP=0.013,p=0.000).结论 高血压大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞存在表型由收缩型向合成型转化,这种转化达到一定程度最终可能导致大鼠勃起功能障碍.     

ATP合酶在糖尿病大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞病变中的作用机制

目的探讨三磷酸腺苷（ATP）合酶在糖尿病大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞病变中的作用机制。方法体内实验：40只SD大鼠随机分为正常对照组与糖尿病组（按60mg/kg腹腔内注射链脲佐菌素后72h、1周、2周随机血糖水平＞16.7mmol/L为造模成功）,饲养10周后比较大鼠阴茎勃起功能;处死后取阴茎海绵体组织,采用胶原纤维染色法检测纤维化程度,免疫组化法检测Caspase-3表达,Westernblot法检测F1-ATPase蛋白表达。体外实验：取正常大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞进行细胞培养,分为对照组（正常培养基培养）、高糖组（含30mmol/L葡萄糖的培养基培养）、高糖+ATP酶过表达组（ATPase高表达质粒转染阴茎海绵体平滑肌细胞24h后,再用含30mmol/L葡萄糖的培养基培养）。48h后采用Westernblot法检测F1-ATPase、转化生长因子茁1（TGF-茁1）、结缔组织生长因子（CTGF）蛋白表达。结果在体内实验中,与正常对照组比较,糖尿病组30min内阴茎勃起次数明显减少（P＜0.05）,阴茎海绵体胶原纤维/肌纤维比例明显增加（P＜0.05）,Caspase-3阳性的平滑肌细胞比例明显升高（P＜0.05）,阴茎海绵体F1-ATPase蛋白表达明显降低（P＜0.05）。在体外实验中,与高糖组比较,高糖+ATP酶过表达组F1-ATPase蛋白水平较高糖组明显升高（P＜0.05）,CTGF、TGF-茁1蛋白表达明显降低（P＜0.05）。结论高糖状态会导致阴茎海绵体纤维化,促进阴茎海绵体平滑肌细胞凋亡。通过线粒体ATP酶的上调,可以抑制TGF-茁1途径,改善阴茎海绵体平滑肌纤维化程度,恢复平滑肌的功能,促使阴茎勃起功能得到改善。     

糖尿病性大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞凋亡和增殖特征分析

目的了解糖尿病性大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞(CCSM)凋亡和增殖特征,探讨其对糖尿病性大鼠CCSM数量的影响。方法利用链脲佐菌素建立糖尿病性大鼠模型。CCSM原代培养,并进行免疫细胞化学染色鉴定。采用WST-1检测细胞增殖率,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,采用qRT-PCR检测阴茎海绵体组织增殖细胞核抗原(PCNA)和凋亡蛋白caspase-3mRNA的表达。结果造模后12周,糖尿病组和正常对照组大鼠体质量和随机血糖水平差异显著(P<0.001)。糖尿病组大鼠阴茎勃起功能较正常对照组大鼠差。原代培养所获细胞绝大部分为CCSM。糖尿病组CCSM的增殖速度明显低于正常对照组(P<0.001)。在生长因子刺激下,糖尿病组CCSM增殖速率也慢于正常对照组(P相似文献   

海绵体内注射shIGFBP-3对糖尿病性勃起功能障碍大鼠勃起功能的影响

目的:观察海绵体内注射shIGFBP-3后大鼠阴茎海绵体内压和海绵体平滑肌密度的变化,评价其对大鼠糖尿病性勃起功能障碍的治疗效果.方法:30只SD大鼠随机分为3组,每组10只.造模成功后,各组分别海绵体内注射pGPU6/GFP/Neo shIGFBP-3,pGPU6/GFP/Neo-randomer shRNA和生理盐水.注射3个月后测量大鼠海绵体内压评价大鼠勃起功能,Masson法检测大鼠阴茎海绵体平滑肌密度的变化,Western blot检测阴茎海绵体中IGFBP-3蛋白的表达.结果:shIGFBP-3组大鼠海绵体内压为(112±16) mmHg,高于randomer shRNA组(63±11) mmHg和对照组(59±12) mmHg,差异有统计学意义(P＜0.05).与randomer shRNA组和对照组相比,shIGFBP-3组大鼠阴茎海绵体平滑肌的密度明显上升,差异均有统计学意义(P＜0.05);Western blot显示shIGFBP-3组中IGFBP-3蛋白表达较其他两组明显减少.结论:shIGFBP 3基因注射可能提高糖尿病性勃起功能障碍大鼠的阴茎海绵体内压及改善阴茎海绵体平滑肌的密度.     

SD大鼠自体平滑肌细胞的获取和体外培养

目的建立从SD大鼠的输精管中提取、培养获得自体平滑肌细胞的方法.方法取SD大鼠的输精管,用酶消化法分离、提取平滑肌细胞,进行体外培养、扩增.倒置相差显微镜下观察体外培养的平滑肌细胞的生长情况,用平滑肌特异性的抗α-SMA做免疫组化染色,鉴定培养的细胞.结果平滑肌细胞体外培养呈长梭形,并出现"峰-谷"样生长特征.用抗α-SMA免疫组化染色的方法鉴定所培养为平滑肌细胞,其纯度为(91.3±5.2)%.结论成功建立了从SD大鼠的输精管中提取、培养获得自体平滑肌细胞的稳定模型.     

Differences in the primary culture, purification and biological characteristics between endothelial cells and smooth muscle cells from rat aorta

Objective: To investigate the differences of primary culture, purification and biological characteristics between endothelial cells and smooth muscle cells from rat aorta. Methods: Endothelial cells were obtained using the vascular ring adherence, collagenase digestion method and an improved vascular ring adherence method, while smooth muscle cells were separated from tissue sections of rat aorta. Clones of endothelial cells were selected by limiting dilution assay. Both cell types were identified using specific cell immunofluorescent markers,and phase contrast microscopy was used to observe the morphological disparity between endothelial cells and smooth muscle cells at the single cell and colony level. Cell proliferation was determined by the cell counting kit-8. Differences between endothelial cells and smooth muscle cells were evaluated in trypsin digestion 6me, attachment time and recovery after cryopreservation. Results: Endothelial cells were obtained by all three methods. The improved vascular ring method provided the most reproducible results. Cells were in good condition, and of high purity. Smooth muscle cells were cultured successfully by the tissue fragment culture method. Clonal expansion of singleendothelial cells was attained. The two cell types expressed their respective specific markers, and the rate of proliferation of smooth muscle cells exceeded that of endothelial cells. Endothelial cells were more sensitive to trypsin digestion than smooth muscle cells. In addition, they had a shorter adherence time and better recovery following cryopreservation than smooth muscle cells. Conclusion: The improved vascular ring method was optimal for yielding endothelial cells. Limiting dilution is a novel and valid method for purifying primary endothelial cells from rat aorta. Primary rat endothelial cell and vascular smooth muscle cell cultures exhibited different morphological characteristics, proliferation rate, adherence time, susceptibility to trypsin digestion and recovery after cryopreservation. Our research can be a good foundation for further application in the regeneration of blood vessel.     

人脐动脉平滑肌细胞体外培养的生物学特性及其永生株的初步建立

目的 建立人脐动脉血管平滑肌细胞（HUASMC）原代．传代培养的最佳方法，并初步建立其永生株。方法 采用人脐动脉血管中膜组织块贴壁法原代培养，比较不同培养养基对原代及传代细胞增殖的影响；选择标记为新霉素（G418）的带有端粒酶催化亚基（hTERT)基因的重组质粒导入人脐动脉血管平滑肌细胞。结果 经α肌动蛋白鉴定，组织块贴壁洒可获得高纯度的HUASMC。原代培养的HUASMC1－4代细胞增殖能力强，生长旺盛，此后细胞的增殖逐渐降低，到第10代几乎丧失增殖力。原代培养以MCDB131为最佳培养基。hTERT转染细胞克隆由长梭形变为短梭形，接触抑制消失，生长速度快，目前已传至20代，增殖能力与第1代无差别。转染前后平滑肌特异的α－肌动蛋白表达阳性。结论 hTERT转染的HUASMC保留了HUASMC的基本生物学特征，能保持较强的增殖能力持续传代。     

大鼠胃平滑肌细胞的体外分离与三维支架培养方法

目的:探讨复合胶原酶和胰蛋白酶解离大鼠胃平滑肌细胞,建立稳定的胃平滑肌细胞体外培养模型,并探讨其三维复合培养的可行性。方法:0.2%Ⅰ型胶原酶和0.05%胰蛋白酶酶解大鼠胃平滑肌,用相差显微镜观察细胞学形态与生长情况,免疫组化鉴定平滑肌细胞;采用纤维蛋白胶作为细胞外基质建立三维PLGA复合物培养模型,荧光显微镜观察复合物中的细胞活性。结果:平滑肌组织裂解充分均匀,细胞接种成功率高,1～2周细胞可传代,传代后细胞呈典型的"峰-谷"样生长;α-平滑肌肌动蛋白免疫组化染色证实所获得的平滑肌细胞,荧光显微镜下观察到PLGA支架内细胞均匀分布,存活率达90%以上。结论:酶解分离法可获得高纯度大鼠胃平滑肌细胞,三维支架培养在体外成功培养胃平滑肌细胞复合物,为深入研究胃组织工程再生奠定了基础。     

大鼠胸主动脉平滑肌细胞的组织贴块法培养及鉴定

目的:建立大鼠胸主动脉平滑肌细胞的组织贴块培养法.方法:取大鼠胸主动脉,切成1 mm×1 mm×1 mm的小块,均匀地种植于培养瓶壁上,约50 min后加入含有20%小牛血清的PRMI-1640培养基进行培养.结果:培养第5天时,可见少量梭形或长梭形细胞自组织块周围游出,至培养3周细胞融合成片,呈"峰、谷"状生长.肌动蛋白免疫组化染色,＞98%的细胞染色阳性,透射电镜观察,于基膜下和胞浆内可见密斑和密体.VG染色也证实几乎所有的细胞均为平滑肌细胞.结论:应用细胞贴块法培养大鼠平滑肌细胞,操作简单,结果稳定,纯度较高,具有应用价值.     

自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞的培养及鉴定

目的：培养、鉴定自发性高血压大鼠主动脉平滑肌细胞,了解生长特性,为血管增生性疾病的治疗研究提供试验材料。方法;采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,用倒置相差显微镜观察其生长情况,用免疫组化染色做鉴定,台盼蓝染色进行活力检测,绘制生长曲线、MTT法测定VSMC细胞的成活率、生长、增殖特征。结果：细胞生长曲线近似“S”形,VSMC传代周期为7-10d,呈典型“峰一谷”状生长,MTT法显示细胞生长第7～9天光密度值变化较明显,免疫组化染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达,第2代阳性结果强于4代。结论：正确的利用组织块可以简单、经济、高效地培养出VSCM,为VscM的治疗提供了理想的细胞模型。随传代过程细胞生物学特性发生改变。     

VEGF165真核表达载体的构建及其在鼠膀胱平滑肌细胞的表达

目的 构建血管内皮生长因子(VEGF165)真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165,转染鼠膀胱平滑肌细胞并检验其生物学活性.方法 将VEGF165 cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(-),构建真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165;并转染入鼠膀胱平滑肌细胞,采用RT-PCR和免疫荧光染色检测VEGF165基因在鼠膀胱平滑肌细胞中的表达,并用MTT法检测转染后细胞上清液中VEGF165的生物学活性.结果 和结论将构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165转染入鼠膀胱平滑肌细胞后,VEGF的表达增高,转染后细胞上清液具有促使内皮细胞增殖的生物学活性.     

成年鼠骨髓间质细胞在体外培养中分化为平滑肌细胞

目的　探讨小鼠骨髓间质细胞在体外经条件培养基诱导定向分化成平滑肌细胞的可行性 ,为研究血管损伤后新生内膜形成机制奠定基础。方法　采用骨髓干细胞培养基和贴壁法从骨髓中分离骨髓间质细胞 ,通过补加人血管平滑肌条件培养基诱导骨髓间质细胞分化成平滑肌细胞 ,采用形态学和免疫荧光染色分析分化后的细胞特异性标志物 ,并测定 1μmol/L血管紧张素Ⅱ对细胞胞液钙离子浓度及细胞收缩功能的影响 ,通过加入氯沙坦抑制血管紧张素Ⅱ受体验证血管紧张素Ⅱ特异性激活钙通道引发的细胞收缩。结果　骨髓间质细胞经诱导在体外可传代生长 ,稳定传代 6代后 ,分化的细胞形态呈梭形平滑肌样 ,融合后形成峰谷状排列。表达平滑肌特异性蛋白标志物α 肌动蛋白、肌钙结合蛋白和平滑肌肌球蛋白。分化后的细胞经血管紧张素Ⅱ刺激产生瞬间胞液钙离子转移并偶联细胞收缩反应 ,细胞 [Ca2 + ]i呈现瞬间增高变化 ,[Ca2 + ]i为 2 131nmol/L± 14 0nmol/L ,经用氯沙坦后 [Ca2 + ]i被阻断 ,为 4 0 2nmol/L± 31nmol/L。结论　骨髓间质细胞经体外诱导可分化为有收缩功能的平滑肌细胞 ,可用于平滑肌细胞分化和血管损伤后新生内膜形成起源等研究。     

芍药甙对大鼠空肠平滑肌细胞静息膜电位的作用研究

【目的】探讨芍药甙对大鼠空肠平滑肌细胞静息膜电位的调控作用。【方法】酶解法分离大鼠空肠环行平滑肌细胞,全细胞膜片钳方法测定膜电位。静息状态下,平滑肌细胞的膜电位为(-59.3±3.4)mV;加入芍药甙孵育后,膜电位降低至(-65.6±3.0)mV(P=0.007)。【结论】芍药甙可以通过开放Kv通道,使膜超极化,限制Ca2+内流,实现了对平滑肌细胞的舒张作用。