脂质体介导端粒酶基因转染人口腔黏膜角化细胞的实验研究

目的:将端粒酶基因转染人人正常口腔黏膜角化细胞,观察人端粒酶反转录酶(hTRT)的表达情况.方法:采用脂质体LipofectAMINE 2000与转铁蛋白共同将含有hTRT基因的pEGFP-hTRT质粒转染人正常口腔黏膜角化细胞,经荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察荧光,并进行流式细胞仪检测转染效率,采用RT-PCR检测转染细胞中外源性hTRT的表达.并经G418筛选观察其稳定表达情况.结果:LipofectAMINE 2000与转铁蛋白共同将pEGFP-hTRT转染入人正常口腔黏膜角化细胞,转染率为15.34%.转染细胞表达外源性hTRT.结论:脂质体LipofectAMINE2000与转铁蛋白成功介导含有端粒酶基因的pEGFP-hTRT质粒转染人口腔黏膜角化细胞.     

成釉细胞瘤中MMP-2的表达及RNA干扰的抑制作用

目的：研究MMP-2存成釉细胞瘤中的表达和RNA干扰对成釉细胞瘤细胞中MMP-2基因的沉默效应。方法：培养成釉细胞瘤细胞，应用免疫组织化学方法检测成釉细胞瘤中MMP-2的表达；体外构建MMP-2靶向siRNA质粒表达载体，将siRNA质粘表达载体转染原代培养的成釉细胞瘤细胞，激光共聚焦显微镜检测siRNA质粒表达载体的转染效率，RT-PCR检测成釉细胞瘤细胞中MMP-2 mRNA的改变，明胶酶谱法检测MMP-2的变化．应用SPSSI 1．0统计软件中的t检验对结果进行统计学分析。结果：成釉细胞瘤中MMP-2呈阳性表达．siRNA质粒表达载体对原代培养的成釉细胞瘤细胞的转染半为41.8％；转染后，成釉细胞瘤细胞的MMP-2 mRNA表达水平显著降低，酶原性MMP-2和活性MMP-2显著减少，P〈0．05结论：体外构建的MMP-2靶向siRNA质粒表达载体可以转染体外培养的成釉细胞瘤细胞，并导致MMP-2基因沉默。     

两种转染方法介导质粒转染人舌鳞癌细胞的实验研究

目的:比较新型阳离子聚合物交联化聚乙烯亚胺(polyethylenimine-ethyleneglycol dimethacrylate,PEI-EGDMA)与阳离子脂质体TRANSfection转染人舌鳞癌(Tca8113)细胞的转染效率和细胞毒性.方法:将合成的含有绿色荧光蛋白报告基因的靶向血管内皮生长因子RNA干扰质粒,分别通过PEI-EGDMA和TRANSfection转染入Tca8113细胞中,每组设4 种浓度.转染后24 h,荧光显微镜下观察转染效果,计算各组的转染效率.48 h后四甲基偶氮唑盐(MTT)法行细胞毒性检测.结果:PEI-EGDMA与重组质粒质量比(W∶ W)控制在1.5∶ 1时转染效率最高,约为72%,与其余浓度组相比存在显著性差异(P<0.05).TRANSfection与重组质粒质量比控制在2∶ 1时,转染效率最高,约为55%,与其余各浓度组有显著性差异(P<0.05).在各自最佳转染条件下,PEI-EGDMA的转染效率明显提高.MTT结果显示在实验设定的浓度范围内,各组细胞的生长无显著性差异(P>0.05),细胞毒性较小.结论:新型阳离子聚合物PEI-EGDMA与TRANSfection相比转染效率更高,细胞毒性小,有望成为人舌鳞癌细胞基因转染的有效载体.     

小鼠骨质疏松模型成骨细胞的体外特征研究

目的：建立小鼠骨质疏松模型并观察研究模型小鼠成骨细胞体外特征。方法利用维甲酸灌胃法快速建立小鼠骨质疏松模型,进行成骨细胞培养。观察研究模型小鼠成骨细胞体外特征,包括细胞形态学、生长曲线、碱性磷酸酶染色、茜素红染色的情况。结果模型小鼠成骨细胞生长能力弱于对照组,碱性磷酸酶活性及茜素红染色强于对照组。结论维甲酸诱导的骨质疏松模型小鼠,其成骨细胞增殖能力减弱,成骨能力增强。     

VEGF基因体外转染肌卫星细胞的研究

目的:寻找一种改良组织工程种子细胞的新方法,检测人血管内皮生长因子-165(VEGF165)基因转染肌卫星细胞(muscle satellite cell,MSC)的效果及目的基因的表达情况。方法:取SD大鼠的胎鼠后肢及背部肌肉,差速贴壁法接种培养MSC,观察细胞生长特性。取第2代细胞,按3:1比例用Lipofectamin2000转染试剂介导,将重组真核表达质粒pEGFP-C1-VEGF165(pEGFP为增强绿色荧光蛋白)转染MSC,转染后24～72h和传代后分别用倒置荧光显微镜观察标志基因增强绿色荧光蛋白的表达情况,计算转染效率。转染细胞爬片行VEGF165免疫组织化学染色检测VEGF165的表达。提取转染后48h的细胞总RNA,RT-PCR检测VEGF165基因的表达。结果:MSC在接种后24h开始贴壁,伸展成长梭形,原代细胞呈集簇状分布。在转染后24h即有细胞表达绿色荧光蛋白,荧光强度和表达细胞总数在72h时达高峰,传代后仍可观察到pEGFP的表达,转染后部分细胞形态发生变化。VEGF165免疫组织化学染色证实在胞质中有大量棕黄色颗粒,RT-PCR证实有与VEGF165cDNA大小相符条带出现,荧光检测转染效率约22%。结论:使用Lipofectamin2000转染试剂可有效地转染体外培养的MSC。VEGF165基因转染的MSC可表达基因产物,有望作为组织工程骨研究中的基因工程化种子细胞。     

辛伐他汀对小鼠成骨细胞免疫相关基因表达的研究

目的 研究免疫相关基因在辛伐他汀(simvastatin)促进成骨过程中的作用.方法 用辛伐他汀处理小鼠成骨细胞后,采用基因芯片(BiostarM-140s)检测免疫相关基因的表达改变.结果 辛伐他汀处理小鼠成骨细胞后,基因芯片筛选出与免疫相关的差异表达基因16个,明显下调的基因有9个,明显上调的基因有7个.结论 辛伐他汀作用于小鼠成骨细胞后,促进炎性反应的相关基因表达下调,而抑制炎性反应的相关基因表达上调.     

小鼠重组Periostin对成骨细胞附着和伸展的影响

目的：观察小鼠重组Periostin对成骨细胞附着和伸展的作用。方法：采用固相结合分析实验和四唑盐比色（MTT）法等细胞生物学技术,观察成骨细胞在Periostin基质上的附着能力和伸展率。结果：成骨细胞在Periostin基质上附着和伸展良好,当浓度在20μg/ml以上时,作用尤其显著（P＜0．01）,与在纤维结合蛋白（Fn）基质上生长相似。结果：小鼠重组Periostin可有效促进成骨细胞的附着和伸展,但其作用的附着和伸展,但其作用的切分子机制还需深入研究。     

脂多糖刺激小鼠成骨细胞表达白细胞介素-23的实验研究

目的:研究小鼠成骨细胞能否在细菌毒素产物脂多糖刺激下表达白介素-23(IL-23).方法:分别以小鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)及小鼠成骨前体细胞系MC3T3-El体外诱导为成骨细胞后,加以l0ng/ml LPS刺激,采用ELISA法检测IL-23的蛋白表达.并采用RT-PCR方法检测脂多糖刺激下小鼠BMSCs诱导成骨...     

siRNA沉默小鼠原代成骨细胞LIMK2基因的实验研究

目的 探讨采用RNA干扰抑制原代成骨细胞中LIMK2的表达及其抑制效率,为进一步研究LIMK2基因的作用奠定基础.方法 针对小鼠LIMK2基因,化学合成3条siRNA,分别编号为R1、R2、R3,用脂质体分别介导转染到小鼠原代成骨细胞中,转染后24、48 h提取细胞的总RNA和总蛋白,分别进行RT-PCR和Western blot检测,研究3条siRNA 在不同时间点对LIMK2基因的抑制效率.结果 RT-PCR结果 显示编号为R3的siRNA对LIMK2 mRNA表达的抑制效率最高,两组应用R3 siRNA后的LIMK2 mRNA表达量分别为对照组的19.30%(转染后24 h)、18.63%(转染后48 h);Western blot检测显示编码为R3的siRNA对LIMK2蛋白表达的抑制效果最明显,两组应用R3 siRNA的LIMK2蛋白表达量分别仅为空白对照组的1.32%(转染后24 h)、1.19%(转染后48 h).结论 编号为R3的siRNA可以很好地抑制小鼠原代成骨细胞的LIMK2表达.     

人白细胞介素-10质粒转染抑制RANKL诱导的小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7分化形成破骨细胞

目的:探讨人白细胞介素-10(human interlenkin-10,hIL-10)质粒转染后的表达产物对RANKL诱导的破骨细胞形成的影响。方法:将hIL-10及相应的空载体质粒在脂质体介导下转染293T细胞,获取含hIL-10蛋白的培养液;通过TRAP染色及骨吸收实验观察转染产物对RANKL诱导的小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7分化形成破骨细胞的影响。结果:hIL-10质粒脂质体法瞬时转染293T及RAW264.7细胞获得成功,部分细胞发出绿色荧光,ELISA检测表明目的基因获得表达,RAW264.7细胞在RANKL诱导下可形成破骨细胞样细胞,在该培养体系中加入含hIL-10蛋白的培养液上清,TRAP染色阳性细胞及骨吸收陷窝面积显著减少(P<0.05)。结论:本实验所采用的hIL-10质粒可以成功转染293T及RAW264.7细胞,产生的hIL-10蛋白在体外具有抑制破骨细胞形成和骨吸收的生物学功能。     

构建TGF-βⅡR靶向siRNA真核表达载体并转染人T细胞的研究

目的:构建TGF-βⅡR靶向siRNA真核表达载体并转染T细胞,为进一步探索TGF-β、T细胞与牙周病的关系奠定基础。方法:以TGF-βⅡR为靶基因构建siRNA真核表达载体,转染成功分离培养的人T细胞,转染结果经RT-PCR和Western blot检测。结果:酶切鉴定正确的克隆测序结果与设计的目的序列完全一致,转染siRNA1的T细胞组的TGF-βⅡR mRNA的表达被明显抑制。结论:成功构建了TGF-βⅡR靶向siRNA真核表达载体并成功转染T细胞。     

MMP-2靶向siRNA对成釉细胞瘤裸鼠移植瘤的抑制作用

目的:构建裸鼠皮下人成釉细胞瘤移植瘤模型,研究MMP-2靶向siRNA对成釉细胞瘤侵袭性的抑制作用。方法:取新鲜成釉细胞瘤组织标本,剪切成1～2mm3组织小块,接种于裸鼠前肢根部的背侧皮下。实验分为3组:空白对照组不加任何处理因素;脂质体组注射脂质体混合物;siRNA组注射MMP-2靶向siRNA表达质粒混合物。组织块接种后第2周末开始施加处理因素,记录移植瘤体积和实验终止时的肿瘤重量。采用SPSS10.0统计软件包对数据进行t检验,并对移植瘤进行组织病理学分析。结果:所有移植瘤均成活,病理证实移植瘤为成釉细胞瘤,siRNA组和对照组之间肿瘤的体积有显著性差异,P<0.05。结论:裸鼠皮下接种成釉细胞瘤组织块构建成釉细胞瘤移植瘤动物模型是可行的,MMP-2靶向siRNA可在体内抑制成釉细胞瘤的侵袭性和生长。     

micRNA和siRNA基因调控技术研究进展

micRNA和siRNA基因调控技术不仅改变了基因的调控只有通过蛋白质与核酸的相互作用才能实现的认识，而且可以作为一种简单有效替代基因敲除的技术，在功能基因组研究、基因治疗等领域得到了越来越多的重视。本文就micRNA和siRNA基因调控技术的概念、原理与方法、应用的最新进展等方面进行综述。     

TRAF6沉默对LPS刺激牙周膜成纤维细胞增殖能力的影响

目的:使用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)沉默人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament cell, hPDLC) 肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6,TRAF6)的基因,观察细胞的增殖情况及脂多糖刺激时增殖能力的变化。方法:酶消化联合组织块法体外培养原代hPDLC,并进行免疫组化鉴定,将细胞分为TRAF6 siRNA组、control siRNA组、NONE组,脂质体法将TRAF6 siRNA、control siRNA分别转染入对应组中,NONE组只加入等量的转染试剂,再使用10 mg/L LPS刺激细胞,RT-PCR检测TRAF6mRNA的表达情况,CCK-8检测沉默前后及LPS刺激时细胞增殖能力的改变。结果:免疫组化鉴定hPDLC培养成功;TRAF6 siRNA组的TRAF6 mRNA的表达水平与NONE、control siRNA组相比显著下降(P<0.001);TRAF6 siRNA组在转染后36、48、72 h的A值均显著低于相同时间点的2个对照组(P<0.001);使用10 mg/L LPS刺激各组细胞24、48 h时,TRAF6 siRNA组细胞的A值显著低于相同时间点的2个对照组(P<0.001)。结论:沉默TRAF6基因能抑制LPS刺激时hPDLC的增殖,推测TRAF6可能影响牙周炎的发生发展进程,是牙周炎潜在的治疗靶点。     

RhoA小干扰RNA对舌癌细胞Tca8113增殖、侵袭影响的体外实验

目的 体外实验研究Ras基因家族同源物A(ras homolog gene family,member A,RhoA)小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)在舌癌转移中的作用.方法 登录Genebank确定人RhoA基因序列,利用RNA干扰技术针对RhoA的基因序列设计4条短链RNA,构建干扰表达载体,利用LipofectamineTM2000介导法将RhoA siRNA转染至舌癌细胞系Tca8113.转染细胞后48 h检测瞬时表达效率,经杀稻瘟菌素筛选及克隆化培养获得稳定抗性克隆转染株后,蛋白质印迹法检测RhoAsiRNA转染后的抑制效应,细胞计数绘制细胞生长曲线以观察RhoA siRNA转染前后细胞株的生长速度;划痕实验和Millicell小室实验检测转染细胞株的迁移力与侵袭力.结果 舌癌细胞转染RhoA siRNA后:RhoA蛋白表达下降;细胞倍增时间从38.0 h延长至45.7 h;细胞克隆形成率由35.2%降低至15.8%;细胞迁移能力减弱;细胞侵袭能力由100%降至58.9%,显著减弱.结论 RhoA siRNA能有效抑制舌癌Tca8113细胞中RhoA的表达,从而降低细胞增殖水平以及细胞侵袭力和迁移力,表明RhoA siRNA具有抑制舌癌细胞生物学特性的能力,提示RhoA在舌癌转移中可能发挥重要作用.     

siRNA抑制人Tca8113/CDDP细胞多药耐药相关蛋白表达的研究

目的:利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制人舌癌耐药细胞多药耐药相关蛋白(muhidrugresistance associated protein,MRP)的表达,观察其对培养细胞耐药性的干扰情况。方法:设计针对MRP基因的siRNA,转染人舌癌多药耐药细胞Tca8113/CDDP,用RT-PCR分析MRP mRNA的表达;免疫细胞化学技术检测MRP蛋白表达量;MTT法检测MRP siRNA的细胞毒作用。结果:Tca8113/CDDP细胞转染MRP siRNA后,MRPmRNA表达较对照组明显降低,降低率为61.3%;转染36 h后MRP siRNA组的MRP蛋白表达阳性率较对照组明显减低;MRP siRNA组中顺铂对Tca8113/CDDP细胞生长的抑制作用明显强于对照组,且抑制作用随时间的延长而增强。结论:MRP siRNA可以明显抑制口腔癌耐药细胞的多药耐药。     

MMP－2 siRNA促进口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡作用的研究

目的：研究基质金属蛋白酶－2（MMP－2）siRNA对口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡的作用。方法：采用MMP－2 siRNA慢病毒感染Tca8113,qPCR检测MMP－2表达,MTT检测细胞活性,Annexin－V单染检测细胞凋亡。结果：MMP－2 siRNA慢病毒成功抑制Tca8113中MMP－2 mRNA表达。MMP－2干扰组细胞活性显著低于阴性病毒组（P＜0．01）,且细胞凋亡率高于阴性对照组（P＜0．01）。结论：MMP－2干扰能促进Tca8113凋亡,起到抗肿瘤效应。     

沙门菌介导骨桥蛋白siRNA对Tca 8113细胞体外生长的影响

目的:研究应用减毒沙门菌感染性转基因骨桥蛋白siRNA(OPNsiRNA)抑制Tca 8113细胞生长和转移的可行性和作用。方法:人工合成OPNsiRNA,同时,合成无义ControlsiRNA作为对照,进行以下平行试验;合成siRNA,分别构建表达载体pIRES2-EGFP,转染减毒沙门菌SL7207,获得的重组菌SL-OPNsiRNA和SL-ControlsiRNA分别体外感染Tca 8113细胞,观察细胞感染率及对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭力的影响,同时以Western印迹检测转基因OPNsiRNA对细胞内源性OPN、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)蛋白表达的影响。采用SPSS15.0软件包进行组间t检验。结果:重组减毒沙门菌感染Tca 8113的效率可达80.0%以上,两者之间无显著差异(P>0.05);OPNsiRNA可显著抑制Tca 8113细胞的生长和诱导凋亡;感染后24h,细胞OPNsiRNA和Control-siRNA的迁移指数分别为0.56±0.10和0.82±0.05,侵袭力指数分别为0.53±0.13和0.83±0.06,2组之间均存在显著差异(n=12,P<0.01);同时,OPNsiRNA感染可显著降低细胞内OPN、MMP-2和uPA蛋白的表达量。结论:携带OPN-siRNA的减毒沙门菌可有效通过细菌感染方式,转入舌癌细胞,发挥抗肿瘤生长和转移的作用。     

siRNA干扰对变形链球菌耐氟菌ffh基因产酸能力的影响

目的:探讨变形链球菌耐氟菌(UA159-FR)ffh基因 siRNA干扰后对产酸能力的影响。方法:电穿孔法将siRNA转入UA159-FR与ffh基因序列靶向位点结合,将干扰前后细菌分别加入BHI培养液,含5%糖类的葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉中培养,pH调至7.5,24 h后测终末pH。结果:转染结果成功;干扰前后不同糖培养基中变形链球菌耐氟菌ffh基因对产酸有显著差异(P<0.05);干扰前后在常规、葡萄糖、及乳糖中差异极显著(P<0.01);蔗糖中差异显著(P<0.05);淀粉中无显著差异。结论:变形链球菌耐氟菌中基因ffh对产酸能力影响显著。     

壳聚糖包裹 siRNA 在小鼠牙胚发育研究中的应用

目的：探索局部注射siRNA对小鼠牙胚生长发育产生影响的实验方法。方法：选择健康新生昆明小鼠作为实验对象,将阴性对照siRNA进行壳聚糖（chitosan,CS）包裹,分别将其注入小鼠的两个不同部位：①．腹腔注射组,将Cy5．5标记的CS包裹的siRNA纳米粒注射于新生昆明小鼠腹腔,于不同时问点在动物活体成像仪下观察荧光分布情况。②．颌骨局部注射组,将Cy5．5标记的siRNA/CS纳米粒局部直接注射于新生小鼠左上颌第一磨牙牙胚,通过动物活体成像结合冰冻切片观察荧光分布情况,验证局部注射方法的可行性。结果：在腹腔注射组,随着时间延长,荧光开始在腹腔内扩散,随后在腹腔内淬灭,荧光始终局限于腹腔,腹腔外没有观察到荧光;颌骨局部注射组通过活体动物成像显示注射的牙胚处有荧光,进一步的冰冻切片验证在牙胚处有荧光,且牙胚结构无明显损伤。结论：本实验将CS包裹siRNA纳米粒技术应用于牙胚发育的相关研究,首次成功构建了新生昆明小鼠牙胚局部注射siRNA的方法,为研究牙胚发育相关基因的作用开辟了新的途径。