聚乳酸乙醇酸/RNA Ⅲ抑制肽缓释微球的组织相容性

目的：通过实验评价聚乳酸乙醇酸/ RNA Ⅲ抑制肽缓释微球的组织相容性。 方法：采用Fmoc法由C端至N端先合成粗品肽;采用反相液相色谱法对RNA Ⅲ抑制肽粗品进行纯化分析,按紫外吸收峰收集组分,冷冻干燥,得到RNA Ⅲ抑制肽纯品。再采用液相复乳法制备直径50~70 μm的聚乳酸乙醇酸/RNA Ⅲ抑制肽微球。以急性全身毒性试验、MTT细胞毒性试验、肌肉内植入试验、过敏试验、热原试验对其组织相容性进行初步评价。 结果：①急性全身毒性试验结果显示3组动物无中毒反应,无动物死亡,体质量无明显变化。②MTT细胞毒性试验结果显示两种浸提液的平均细胞增殖率均大于85%,细胞毒等级1级,不具有细胞毒性。③肌肉内植入试验结果显示RNA Ⅲ抑制肽粉末和聚乳酸乙醇酸/RNA Ⅲ抑制肽微球植入4 周后,组织未见明显充血、变性或坏死。RNA Ⅲ抑制肽粉末完全降解,微球部分降解,主要细胞成分为纤维母细胞,未见中性粒细胞及多核巨细胞等炎症细胞浸润。④过敏试验结果显示3组动物的平均原发刺激指数分别为0.38、0.33和0.31,3组间无显著差别。⑤热原试验结果显示每种材料测试的3只新西兰大白兔中,体温升高均在0.5 ℃以下,并且体温升高总度数在1.3 ℃以下,符合热原实验的评价标准。 结论：聚乳酸乙醇酸/RNA Ⅲ抑制肽微球具有良好的组织相容性。 关键词：聚乳酸乙醇酸/RNA Ⅲ抑制肽微球;组织相容性;动物实验 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.03.044     

重症肌无力骨骼肌减少的25000蛋白分子鉴定

目的:解析重症肌无力(MG)骨骼肌特异减少的相对分子质量约25000的蛋白分子结构。方法:用双向电泳分离纯化骨骼肌25000蛋白,电喷射离子化质谱和Edman降解法分别测定其精确分子质量和N端部分氨基酸序列,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定其肽指纹图谱,在上述基础上,用ImmunoWesternblot分析骨骼肌蛋白与25000蛋白抗体及碳酸酐酶Ⅲ(CAⅢ)抗体的结合。结果:质谱和N端部分氨基酸序列的测定表明,电泳显示的表观相对分子质量为25000的蛋白其精确分子质量为29632.05,该蛋白的N端氨基酸可能是酰基化的;肽指纹图谱解析和蛋白资料库查询结果,结合对25000蛋白生化和生物学特征的了解,发现25000蛋白与CAⅢ的分子是非常相似的。结论:MG骨骼肌特异减少的相对分子质量约25000的蛋白分子很可能是已知的蛋白质CAⅢ,该活性物质与MG发病的关系值得进一步研究。     

以蛋白质芯片为中药蛋白质/肽相互作用载体分析中药地龙生干品和炮制品的生物学特征

背景：激光解析\离子化-飞行时间质谱技术为以蛋白质/肽为主要成分的中药蛋白质组学研究提供了重要的技术平台。 目的：对传统中药地龙蛋白/肽成分进行蛋白质组分析。 设计、时间及地点：对比实验,于2004-12/2005-10在中南大学生物科学与技术学院分子生物学实验中心完成。 材料：生干地龙和炮制品（沙烫）地龙，均购于湖南长沙九芝集团芝林大药房，源产地湖南。 方法：以蛋白质芯片为载体，激光解析\离子化-飞行时间质谱法获取两者所含蛋白质/肽成分信息。 主要观察指标：两种地龙Mr 1 500~13 000 区间蛋白质、肽分布及其相对分子质量。 结果：共获得29个蛋白质/肽相对分子质量峰，其中生干品地龙17个有意义峰，炮制品地龙获取12个峰；多个相邻蛋白质峰之间质量相差一个氨基酸残基。并且生地龙与炮地龙有多组相对分子质量分别极为相近，推测可能为相同的肽段。 结论：应用激光解析\离子化-飞行时间质谱技术可以形成生品地龙及炮地龙蛋白质/肽成分质量指纹图，可作为地龙数字化质控标准,并为进一步分离、纯化及验证中药地龙功能相关活性蛋白质/肽成分打下基础。     

聚乳酸乙醇酸/ RNA Ⅲ抑制肽缓释微球组织相容性评价

目的：在前期实验证实可防治葡萄球菌感染的RNA Ⅲ抑制肽（RNAⅢ inhibiting peptide, RIP）具有良好的组织相容性和安全性的基础上，进一步评价聚乳酸乙醇酸/ RIP(PLGA/ RIP)缓释微球的组织相容性。 方法: 实验于2005-10/2007-10在解放军总医院骨科研究所、临床药理研究所及医学动物实验中心完成。①PLGA/RIP微球制备：采用Fmoc法由C端至N端先合成粗品肽；采用反相液相色谱法对RIP粗品进行纯化分析,按紫外吸收峰收集组分,冷冻干燥,得到RIP纯品。再采用液相复乳法制备直径50~70 μm的PLGA/RIP微球。②组织相容性实验：以急性全身毒性实验观察 PLGA/RIP的全身毒性反应；MTT细胞毒性实验观察PLGA/RIP对细胞增殖的影响；肌肉内植入实验观察材料有无肌肉刺激反应；过敏实验观察PLGA/RIP的致敏情况；热原实验观察材料对体温的影响。 结果：①急性全身毒性实验结果：腹腔注射PLGA/RIP洗提原液和50%的PLGA/RIP洗提液后动物无中毒反应，无死亡，体质量无明显变化。②MTT细胞毒性实验结果：两种洗提液的平均细胞增殖率均大于85%，细胞毒等级1级，不具有细胞毒性。③肌肉内植入实验结果：RIP和PLGA/RIP植入4 周后，组织未见明显充血、变性或坏死。材料周围未见明显炎症细胞浸润, 材料已被纤维囊包裹。④过敏实验结果：3组动物的平均原发刺激指数分别为0.38，0.33和0.31，3组间无显著差别。⑤热原实验结果：各组动物体温升高均在0.5 ℃以下, 证实材料无热源性，符合热原实验的评价标准。 结论: PLGA/RIP不引起全身毒性反应，无细胞毒性，未见免疫排斥，不引起过敏反应，无热源性，具有良好的组织相容性和安全性。     

小干扰RNA在哺乳动物脑组织中的递送

背景：作为一种能够下调基因表达的新的基因治疗方法，RNA干扰在神经科学疾病的治疗中有很大的潜能。通过引入与内源靶基因具有相同序列的小干扰RNA，可以人为地诱导序列特异性的mRNA降解，达到阻止该基因表达的目的。 目的：针对RNA干扰在神经科学疾病治疗方面的应用，探讨小干扰RNA在哺乳动物脑组织中的递送情况。 方法：以“siRNA，delivery，brain”和“siRNA, delivery，vivo”为检索词，计算机检索PubMed home，按纳入和排除标准对文献进行筛选和质量评价，共纳入27篇文章。从小干扰RNA合成、脑组织中的递送及其抑制效率和不良反应3方面进行总结。 结果与结论：近来RNA干扰研究中，高精度预测小干扰RNA的方法能合成出高特异性的小干扰RNA；小干扰RNA在脑组织中的递送主要采用局部注射的方式，并且在递送载体的帮助下，抑制效率在不断地提高；随着RNA干扰技术研究的深入，其不良反应也逐渐受到人们重视。总之，作为一种新的治疗策略，RNA干扰在神经科学疾病的治疗中有着很大的潜能，并可能给药物研发带来新的变革。     

聚乳酸乙醇酸/RNAⅢ抑制肽缓释微球的血液相容性*☆

目的：研究表明RNA Ⅲ抑制肽(RNA Ⅲ inhibiting peptide,RIP)是葡萄球菌一种有效的全面抑制剂，作用机制与传统抗菌素明显不同，有着良好的应用前景。通过实验评价聚乳酸乙醇酸(polyaiticglycolic acid,PLGA)/RIP缓释微球的血液相容性。 方法: 实验于2005-10/2007-10在解放军总医院临床药理研究所及医学动物实验中心完成。选择成年健康新西兰大白兔30只，按随机数字表法分组，每组6只。药品及试剂: PLGA，二甲基亚砜、MTT，DMEM，二硝基氟苯。实验方法：①PLGA/RIP微球制备：采用Fmoc法由C端至N端先合成粗品肽；采用反相液相色谱法对RIP粗品进行纯化分析,按紫外吸收峰收集组分,冷冻干燥,得到RIP纯品。再采用液相复乳法制备直径50～70 mm的PLGA/RIP微球。②洗提液制备：PLGA/RIP微球粉末按1 g/L在37 ℃无菌条件下用生理盐水洗提72 h，制得洗提液原液；加入同体积的无菌生理盐水制得0.5 g/L的稀释液。③溶血实验：以蒸馏水和生理盐水分别为阳性、阴性对照，观察PLGA/RIP洗提液原液和0.5 g/L洗提液的溶血率。④凝血实验及PLGA/RIP对凝血酶原时间和活化部分凝血酶时间的影响实验：以生理盐水为阴性对照，观察PLGA/RIP洗提液原液和0.5 g/L洗提液对兔凝血时间的影响和凝血酶原时间和活化部分凝血酶时间的影响。⑤PLGA/RIP对兔白细胞、红细胞和血小板及血小板聚集的影响实验：观察PLGA/RIP洗提液原液和0.5 g/L洗提液对兔白细胞、红细胞和血小板及血小板聚集的影响。 结果：纳入动物30只, 均进入结果分析。①溶血实验结果显示PLGA/RIP洗提液原液和0.5 g/L洗提液的溶血率分别为3.24%和2.67%，两者的溶血率均 < 5%，符合医用生物材料的溶血实验要求。②凝血实验结果表明PLGA/RIP洗提液原液和0.5 g/L洗提液对兔凝血时间无明显影响。③PLGA/RIP对各时间点兔凝血酶原时间和活化部分凝血酶时间均无明显作用。④PLGA/RIP对兔白细胞、红细胞和血小板无明显影响。⑤PLGA/RIP对兔血小板聚集无明显影响。 结论: PLGA/RIP缓释微球具有良好的血液相容性。     

兔抗凋亡诱导因子多克隆抗体的制备、纯化与鉴定

背景：凋亡诱导因子是存在于线粒体膜间隙中的黄素蛋白,它不仅具有氧化还原和电子传递功能,还具有促细胞凋亡功能,从而在维持细胞正常生理活动中具有重要作用。 目的：制备抗凋亡诱导因子多克隆抗体并进行特性鉴定。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2006-09/2008-08在新乡医学院免疫学研究中心完成。 材料：新西兰大白兔雌性2只,体质量1.9~2.1 kg;Jurkat E6-1细胞系购自美国ATCC公司。食管癌组织取自新乡医学院普通外科手术患者。抗原肽-KLH由上海华大天源生物科技公司合成。CNBr活化的Sepharose 4B购自美国Pharmacia公司。 方法：利用美国过敏和感染疾病研究所(NIAID)主办的抗原表位分析网站(http://beta.immuneepitope.org/home.php)的在线软件对凋亡诱导因子蛋白的氨基酸序列进行分析设计凋亡诱导因子抗原肽,制备多克隆抗体并纯化。 主要观察指标：采用间接ELISA、Western blot、免疫组织化学3种方法对获得的多克隆抗体进行特性鉴定。 结果：间接ELISA法检测显示,血清抗凋亡诱导因子抗体的效价达到1∶128 000。Western blot结果显示,存在Mr67 000条带。免疫组织化学检测结果显示,在食管癌细胞的胞质中有棕黄色的阳性颗粒存在,说明此抗体也可以用于免疫组织化学染色。 结论：实验获得了高效价的特异性的抗凋亡诱导因子抗体。     

生长分化因子5基因原核表达质粒构建和表达及其体内成软骨的诱导活性

背景：生长分化因子5在软骨、四肢和关节的发育、形成中起着重要作用,是目前最常应用的研究早期关节发育的标志分子。克隆人生长分化因子5基因可为软骨、关节缺损的修复奠定研究基础。 目的：利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人生长分化因子5成熟肽,探讨重组蛋白的体内诱导活性。 设计、时间及地点：基因水平观察实验,于2006-01/06在南方医科大学分析测试中心完成。 材料：人流产胚胎膝关节区软骨组织取自解放军广州军区总医院妇产科,标本获取征得家属同意。10只KM小鼠购自南方医科大学实验动物中心,雌雄各半,体质量18~22 g,6~8周龄。 方法：通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 从人胚胎软骨组织克隆生长分化因子5完整成熟肽基因,将所得基因片段插入pET22b(+)载体构建重组原核表达载体pET22b(+)-GDF5,重组质粒转化大肠杆菌BL-21进行IPTG诱导表达。凝胶介质镍离子螯合法纯化目的蛋白,植入小鼠后肢股部肌袋内常规苏木精-伊红染色进行生物学活性鉴定。 主要观察指标：琼脂糖凝胶电泳观察目的基因表达条带,测序观察目的基因序列,SDS-PAGE电泳观察目的蛋白表达条带,组织学观察生长分化因子5诱导活性。 结果：RT-PCR产物长约350 bp,阳性克隆质粒经双酶切可切出约350 bp的片段,测序表明与Genbank中的序列完全一致。SDS-PAGE电泳显示重组子转化菌在相对分子质量14 100位置处出现特异外源蛋白表达带,和成熟肽相对分子质量 13 600接近。纯化后体内植入实验组织切片显示,大量的间充质干细胞聚集和增生,并分化成为成软骨细胞,分泌软骨基质并埋入其中变为软骨细胞。 结论：通过RT-PCR法从人胚胎软骨组织中成功克隆出人生长分化因子5完整成熟肽基因,可在大肠杆菌中得到高效表达,经纯化后在动物体内具有成软骨诱导活性。     

胆固醇改性普鲁兰纳米粒子的制备及其载药性质

背景：多糖引入疏水基团后,在水中能自组装成胶束,可作为疏水小分子药物及生物活性大分子(多肽、蛋白和基因)的载体,在医药和生物技术领域有着潜在的应用价值。 目的：系统考察胆固醇基取代度和普鲁兰多糖相对分子质量对改性普鲁兰纳米粒子性状的影响。 方法：将胆固醇修饰到不同相对分子质量的普鲁兰多糖长链上,合成了一系列取代度不同的胆固醇基-普鲁兰改性多糖,使其在水中自组装成纳米粒子,考察胆固醇取代度及多糖相对分子质量对纳米粒子形态的影响,以阿霉素为模型药物,研究了其在胆固醇基-普鲁兰改性多糖纳米粒子中的包封及体外释放行为。 结果与结论：随着相对分子质量和取代度的增加,粒子稳定性增强,临界胶束质量浓度降低。胆固醇基取代度越低、多糖相对分子质量越大,载药量和包封率越高;当取代度和相对分子质量相同时,随着投料比的增加,载药量增加而包封率降低。体外释放结果表明,相对分子质量越大,粒子越稳定,载药量越高,药物释放越慢。     

肿瘤血管抑制肽alphastatin基因克隆及序列分析

目的克隆获得编码具有生物学活性的肿瘤血管抑制肽alphastatin基因。方法采用非对称引物／模板法，依据基因库提供的alphastatin基因序列，设计合成alphastatin基因的引物／模板链，利用聚合酶链反应（PCR）法，从DNA中扩增出人肿瘤血管抑制肽alphastatin基因片段；将获得的基因片段插入质粒载体pGEM．TEasy中，转化到大肠杆菌DH5ct后挑选阳性克隆，利用限制性内切酶酶切鉴定重组质粒。结果经质粒DNA酶切分析及序列测定，获得了人肿瘤血管抑制肽alphastatin基因片段序列。结论首次体外克隆获得了人肿瘤血管抑制肽alphastatin基因，为肿瘤血管抑制肽alphastatin的基因治疗奠定了基础。     

疼痛及针刺镇痛时孤啡呔受体mRNA的变化

目的：观察大鼠在福尔马林致痛及针刺镇痛时孤啡肽受体mRNA在一些与镇痛有关核团的变化情况。方法：采用原位杂交组织化学技术。结果：电地后10h，导水管周围腹侧区，中缝背核及中缝大核内孤啡肽受体mRNA阳性神经元数增多；而在大鼠脚掌注射福尔马林后，上述核团内孤啡肽受体mRNA阳性神经元数却明显减少，电针并注射福尔马林，脑内孤啡肽受体mRNA水平介于单用电针和福尔马林之间。结论：电针能促进孤啡肽受体的合成而伤害性刺激抑制啡肽受体的合成。     

重症肌无力患者骨骼肌中减少的25000蛋白即为碳酸酐酶Ⅲ的论证

目的论证重症肌无力(MG)患者骨骼肌中特异性减少的25000蛋白为碳酸酐酶Ⅲ(CAⅢ)分子。方法用双向电泳结合免疫Western blot分析25000蛋白抗体和CAⅢ抗体有免疫反应的蛋白质分子的物化特征,分别用免疫Dot blot与免疫Western blot观察两种抗体对纯化的25000蛋白及骨骼肌蛋白匀浆的竞争结合,用免疫Western blot分析健康人与MG患者骨骼肌CAⅢ的蛋白表达。结果双向电泳结合免疫Western blot显示,25000蛋白抗体和CAⅢ抗体识别的蛋白质具有相同的相对分子质量和等电点;免疫Dot blot与免疫Western blot的竞争结合证实25000蛋白与CAⅢ为同一物质;免疫Western blot表明,用25000蛋白抗体与CAⅢ抗体检测健康人与MG患者骨骼肌25000蛋白表达的结果亦几乎是相同的。结论MG患者骨骼肌特异减少的25000蛋白分子就是CAⅢ,这为进一步深入研究CAⅢ与MG的发病奠定了基础。     

蛔虫过敏原ABA-1融合基因在大肠杆菌中的表达及鉴定****◆

背景：利用蛔虫基因融合技术,可将过敏原ABA-1的主要基因进行融合。 目的：利用大肠杆菌表达系统重组表达蛔虫主要过敏原ABA-1融合蛋白。 方法：从Gene Bank和Protein Database中获取蛔虫主要过敏原ABA-1基因和蛋白序列,选定其中的ABA-1B1,ABA-1A2与ABA-1A1基因重组为融合基因BAA,经密码子优化后,全基因合成目的基因BAA并构建于表达载体PET-44a上,经KCM法转化入大肠杆菌JM109中进行克隆,PET-44a/BAA经NdeⅠ和PstⅠ双酶切及DNA测序正确后,转化入大肠杆菌RosettaBlueTM中,经IPTG诱导表达。表达蛋白经Ni柱亲和层析纯化后,通过Western blot和氨基酸测序鉴定目的蛋白。 结果与结论：大肠杆菌的融合蛋白BAA表达量约占总蛋白的40%,纯化后蛋其白纯度可达90%左右。Western Blot结果显示在相对分子质量45 000处可见一特异目的条带,氨基酸测序显示N端15个氨基酸与目的蛋白完全相同。结果证实,融合蛋白BAA在大肠杆菌中得到高效的表达。     

瘢痕疙瘩成纤维细胞生长与小干扰RNA分子抑制细胞周期蛋白D1表达的影响☆

目的: 细胞周期蛋白是细胞周期调控的决定性因子,RNA干涉是一种高效特异的基因沉默技术,能诱使细胞表现出特定基因缺失表型。通过RNA干扰阻断细胞周期蛋白D1基因表达，观察瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和细胞周期的影响。 方法：实验于2006-07/2007-05在南方医科大学基因工程研究所（BSL-2级）完成。①实验材料：小干扰性RNA设计采用软件是ambion公司的在线软件siRNA target finder，合成采用化学合成法，委托上海吉凯基因有限公司合成，再经过变性退火处理后得到双链小干扰性RNA；瘢痕疙瘩成纤维细胞标本取自南方医院整形外科瘢痕疙瘩患者（均获得患者或其家属同意）。②实验过程及分组：将瘢痕疙瘩成纤维细胞应用脂质体法将针对细胞周期蛋白D1基因的小干扰RNA分子转染为实验组，细胞用等量脂质体处理为脂质体组，未处理组作为对照。③实验评估：于转染后24，48，72 h，光学显微镜观察细胞形态变化；流式细胞术分析细胞周期；MTT法检测成纤维细胞的活性并绘制细胞生长曲线。 结果：①转染特异性小干扰RNA后，细胞形态发生了异常改变，细胞由正常的长梭形变为圆形或椭圆形，提示可能是凋亡或坏死细胞。②转染后细胞周期G1期延长，S期缩短。转染特异性小干扰RNA 24，48，72 h后G1期细胞高于未处理组（依次为60.13%，66.22%，67.53%，54.53%）；S期细胞低于未处理组（依次为18.25%，17.11%，11.15%，22.31%），表明细胞阻滞在G1期，进入S期细胞减少。 ③小干扰RNA-细胞周期蛋白D1转染后MTT法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞增值明显受到抑制，细胞生长曲线图表明，转染特异性小干扰RNA组细胞生长明显减缓。 结论：特异性小干扰RNA分子能够抑制细胞周期蛋白D1基因的表达，使细胞阻滞于G1期，并诱导细胞凋亡。     

甲胎蛋白特异性小干扰RNA重组腺病毒载体的构建

背景：RNA干扰技术的应用，关键在于能够采用1个有效的基因转移系统将小干扰RNA转入至靶细胞，目前广泛应用的是构建小干扰RNA表达载体。 目的：利用AdMax腺病毒载体系统构建表达人甲胎蛋白-小干扰RNA的腺病毒载体。 设计、时间及地点：开放性实验，于2007-03/10在山东大学附属济南市中心医院中心实验室完成。 材料：穿梭质粒pDC316-EGFP-U6为本元正阳基因技术公司产品；AdMax KitD试剂盒与低代数HEK293细胞为Microbix Biosystems Inc.（Canada）公司产品。 方法：选择针对甲胎蛋白 mRNA的特异性小干扰RNA靶序列，设计合成为相应的双链DNA，并将其与酶切线性化的pDC316-EGFP-U6载体片段连接，构建好的穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-AFP-siRNA和腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞，同源重组产生重组腺病毒。 主要观察指标：对重组腺病毒进行聚合酶链反应鉴定及扩增、纯化、滴度测定。 结果：构建的穿梭质粒载体经聚合酶链反应鉴定和测序分析，证实与设计一致。重组腺病毒Ad-AFP-siRNA经聚合酶链反应和绿色荧光蛋白表达检测证实构建成功，测定滴度为1.4×109 nfu/L。 结论：实验成功构建了Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA重组腺病毒。     

重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP的构建与鉴定*☆

背景：基因治疗是目前脊髓损伤治疗的方向，目的基因和载体是基因治疗的关键。 目的：构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescence protein, EGFP)标志人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor，hBDNF)基因重组腺病毒载体。 设计、时间及地点：单一样本观察，实验于2007-09/2008-06在福建医科大学附属第一医院完成。 材料：感受态大肠杆菌DH-5α购自美国Stratagene公司；pDC316-hBDNF、载体质粒pDC316-mCMV-EGFP、腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre、腺病毒包装系统AdMax和包装细胞株293购自加拿大Mixcrobix-Biosystems公司。 方法：以pDC316-hBDNF为模板，聚合酶链反应扩增酶切获得hBDNF基因片段，连接到带有EGFP标记基因的载体质粒pDC316-mCMV-EGFP上，构建穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP。利用AdMax包装系统，穿梭质粒与骨架质粒pBHGlox_E1，3Cre共转染293包装细胞, 同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP，反复感染293细胞扩增病毒后，离子交换法纯化病毒，并测定病毒颗粒数及滴度。 主要观察指标：①hBDNF基因原始质粒聚合酶链反应鉴定。②穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP的构建及鉴定。③重组腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP的包装、扩增及纯化。④毒种目的基因的聚合酶链反应鉴定。⑤纯化病毒的滴度测定结果。 结果：经聚合酶链反应鉴定、限制性酶切分析及序列测定，证明已正确构建重组穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP和重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP；扩增纯化后，测得重组腺病毒颗粒数为2.4×1011VP / mL，A260/A280值约为2.0，滴度为0.8×1010 CCID50/ mL。 结论：已成功构建重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP，为hBDNF基因功能及基因治疗的进一步研究奠定实验基础。     

神经营养因子-3 cDNA的克隆以及在酿酒酵母中的分泌性表达

从原代培养人许旺细胞申提取总RNA，用RT－PCR方法获取了编码带向导肽和成熟的NT-3两个cDNA片段，经DNA序列测定表明其顺序与文献报道一致。将这两个cDNA片段克隆到大肠-酵母穿梭质粒pVT102U／α上。用酵母整体细胞法将重组质粒转化酵母宿主细胞，经筛选后，获得分泌性表达。这两种cDNA片段的表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定，大小都在15ku左右，说明带前导肽的NT-3在酵母细胞中获得了正确的加工。将这两种部分纯化的NT－3样品经鼠胚背根神经节生物活性分析，表明具有明显的促进细胞存活和突起生长的作用。人神经营子-3％在酿酒酵母系统获得有生物活性的表达。     

促血管内皮细胞生长的功能化自组装多肽框架材料的筛选和制备

背景：功能化多肽框架材料由于良好的生物相容性及生物活性,可以用来促进血管生成的研究。 目的：设计并筛选出能够促进内皮细胞血管生成的功能化多肽框架材料。 方法： 将设计和筛选出的功能多肽片断通过固相合成法复合在自组装多肽RADA16-I的C末端,将RADA16-I与功能化自主装多肽以1∶1的比例混合,加入无菌培养板在37 ℃下孵育过夜以促进其凝胶,通过换培养基调节pH值。在凝胶上对内皮细胞进行2D培养。观察功能化自组装多肽框架材料的圆二色谱、原子力显微镜照像,内皮细胞黏附、增殖情况。 结果与结论：功能化自组装多肽框架材料与Matrigel的形貌相似且是均一的纳米纤维材料。其中RAD/KLT和RAD/PRG具有促进内皮细胞黏附及增殖的功能。表明,功能化多肽框架材料RAD/KLT和RAD/PRG具有用于促内皮细胞血管生成的进一步研究的潜力。     

生物降解材料聚L乳酸的熔融缩聚合成☆

背景：通过对合成工艺和催化剂的优化和选择，合成较高相对分子质量的聚乳酸生物降解材料。 方法：实验于2003-02/2004-10在哈尔滨工业大学市政环境工程学院绿色化学与技术研究中心完成。以L-乳酸为原料，通过熔融缩聚的一步法合成可生物降解的聚L-乳酸。乳酸首先在无催化剂存在条件下发生自催化缩聚反应，生成较低相对分子质量的预聚物OLLA；然后将催化剂加入到OLLA中继续反应，最后得到较高相对分子质量的聚乳酸。实验考察了预聚条件、催化剂种类和用量、催化剂溶解程度、聚合温度及反应时间对聚乳酸分子量的影响。采用傅立叶变换红外光谱仪和核磁共振氢谱对聚合物结构进行了分析确认，通过凝胶气相色谱测定了聚合物的相对分子质量分布。 结果：L-乳酸在140 ℃下，先在30 kPa下脱水反应2 h；然后减压至5 kPa继续反应4 h，可得到黏均相对分子质量(Mη)为6 500左右的OLLA。以SnCl2-TSA复合体系为催化剂，按SnCl2与OLLA质量比= 0.4%，TSA:SnCl2=1.0(mol/mol)的用量和配比，将催化剂加入OLLA中并充分溶解后，在165 ℃左右，5 kPa下搅拌反应8 h左右，至反应物出现爬杆现象时终止反应，可得到Mη约为65 000的聚L-乳酸。 结论：在优化的工艺条件和催化剂下，能够在较短时间（8 h）内获得较高相对分子质量的聚L-乳酸，使该生物降解材料具备了一定的实用价值。     

低相对分子质量透明质酸脂质体的制备及透皮性能★

摘要 背景：透明质酸是一种用途广泛的高分子材料，在实际应用中，由于其相对分子质量较大，透皮吸收效果不理想，利用脂质体作为其载体可以改善其传输效果，具有较好的应用前景。 目的：观察包裹低相对分子质量透明质酸脂质体的透皮性能。 方法：采用薄膜法制备低相对分子质量透明质酸脂质体，设计正交实验，采用蛇蜕研究其透皮吸收性能。 结果与结论: 温度35 ℃、胆固醇与卵磷脂的比例为0.15∶1，透明质酸与卵磷脂的比例为0.03∶1、水合介质PBS的pH值为7.5，可制备包封率较高的低相对分子质量透明质酸脂质体；脂质体包裹低相对分子质量透明质酸，能有效得提高透明质酸透过蛇蜕的能力，达到了提高透明质酸透皮吸收率的作用。 关键词：低相对分子质量；透明质酸；脂质体；透皮吸收；包封率 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.03.021