体外拼装凋亡素基因

目的 以凋亡素基因为例,探讨用寡核苷酸片段体外拼装基因的方法。方法 按已知的凋亡素基因序列(GeneBank登录号：AY171617),设计40bp的凋亡素基因寡核苷酸片段,并将其中的172位(Bgl Ⅱ,agatct—agatcc)和306位碱基（Hind Ⅱ,aagctt→aatcct)进行同义突变,Taq消除这两个酶切位点。在pfu酶的PCR系统中,对寡核苷酸片段进行拼装和扩增。产物稀释后进一步纯化扩增,在Tag酶存在的条件下对产物两末端加T,然后TA克隆于pGEM—Teasy载体中。阳性克隆经测序鉴定。结果 凋亡素基因寡核苷酸片段第1次PCR拼装后,产物呈拖尾状。但产物经进一步稀释,并用两未端引物进行2次扩增后,即可见明确的产物带及其他梯形带状产物。目的产物TA克隆后,筛选得到阳性克隆．其经测序鉴定,与设计的凋亡素基因序列完全一致。结论 体外基因拼装法是一种非常有效的基因克隆方法,可用于基因或载体的合成,及一次性对基因进行广泛的突变。     

中华按蚊防御素基因的克隆、原核表达及其重组产物生物活性的初步评价

目的 克隆、原核表达中华按蚊的防御素基因,并对其表达产物的生物学活性进行评价。方法 根据已发表的埃及伊蚊和冈比亚按蚊防御素基因序列设计合成两对引物,以中华按蚊成蚊cDNA为模板进行PCR扩增,将预期片段克隆测序并进行分析;根据表达质粒pET32a(+)上的克隆位点及测序结果设计PCR引物,将截短的基因片段重组入质粒pET32a(+)中进行表达,纯化表达产物并进行体外抑菌试验。结果 PCR扩增产物大小约270bp,目的基因的序列与冈比亚按蚊防御素基因同源性为85%;截取其保守功能区域序列(162bp),构建成功重组表达质粒pET32a(+)-tDEF,含重组质粒的转化菌用IPTG诱导表达后,于M_r26000处可见一预期的特异表达带,该蛋白与抗6-His抗体有特异性的反应;琼脂扩散法显示,纯化的重组防御素融合蛋白未出现抑菌环。结论 首次克隆了中华按蚊防御素基因,其截短片段在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达,但重组融合蛋白不具备抑菌活性。     

乳链菌表达hGM-CSF基因的拼装及其载体pNCSF构建

目的 体外拼装适合在乳酸链球菌表达的人粒-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte—macrophage colony stimulatingfactor，hGM—CSF），并构建载体pNCSF。方法 根据hGM-CSF的氨基酸序列及乳酸链球菌偏好的密码子，将hGM—CSF基因外显子的全长碱基序列用DNAWORKS程序设计成16条互补的寡核苷酸片段，并且分别在第1条和第16条寡核苷酸片段上分别设计PstⅠ和BamHⅠ酶切位点，将相同终浓度的寡核苷酸混合进行PCR反应，完成hGM-CSF基因拼接，得到目的基因片段，对寡核苷酸片段进行拼装和扩增．产物稀释后进一步纯化扩增，在Tag酶存在的条件下对产物两末端加T，然后TA克隆于pGEM T easy载体中，经酶切鉴定得到阳性克隆并经测序验证。然后亚克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽的pNBC1000载体。结果通过PCR得到420左右目的DNA片段，获得了hGM—CSF和pNCSF阳性克隆。其DNA测序结果与设计序列完全一致。结论 运用基因拼装及克隆技术成功拼装了hGM—CSF基因及构建了载体pNCSF，为乳酸链球菌表达重组hGM—CSF奠定了基础。     

干扰素诱导的跨膜蛋白-1基因的扩增、克隆及蛋白表达

目的 研究干扰素诱导的跨膜蛋白-1(interferon-inducible transmembrane protein-1,IFITMP-1)基因的扩增、克隆及蛋白表达。方法 以含IFITMP-1基因的cDNA为模板,用Pfu酶做PCR扩增,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,将目的基因克隆到pUCm-T质粒测序。进一步克隆到pET-Trx蛋白表达载体质粒,优化蛋白表达条件。结果 含有IFITMP-1基因的PCR产物约1000bp。重组pUCm-T质粒经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,有相应大小的cDNA片段插入,测序结果显示其序列正确,证实目的基因的扩增、克隆成功,并成功克隆进pET-Trx蛋白表达载体,经IPTG诱导,在BL21(DE3)plysS中有融合蛋白表达。结论 成功扩增克隆IFITMP-1基因,并成功表达该基因编码的蛋白,为进一步研究IFITMP-1基因在大肠癌中的作用奠定了基础。     

小鼠CTLA4-Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建小鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4Fc融合基因（CTLA4-Fc）的真核表达质粒,并检测其在293T细胞中的表达,为后续在小鼠体内研究CTLA4-Fc抗肿瘤作用机制奠定基础。方法 Gene Runner 软件设计并合成互为搭桥、互为模板的CTLA4融合基因引物,利用重叠PCR方法扩增获得CTLA4基因片段,与pcDNA3.1(+)/Fc (Mouse IgG2a)质粒同时进行双酶切,连接合成CTLA4-Fc融合基因表达质粒;菌落PCR扩增、双酶切以及测序鉴定后,在293T细胞中瞬时转染表达融合基因的质粒,ELISA法检测其在293T细胞内的蛋白表达含量。结果 成功构建CTLA4-Fc融合基因。经菌落PCR和双酶切,琼脂糖电泳检测到CTLA4-Fc片段长度为1 200 bp,CTLA4片段长度为568 bp DNA。将阳性重组克隆菌落挑于液体LB培养基中扩大培养并将菌液送公司测序,测序结果证实DNA序列与GenBank同源性为100%。通过ELISA方法能够检测到CTLA4-Fc质粒在293T细胞中的表达。结论 CTLA4-Fc融合基因正确克隆入pcDNA3.1(+)/Fc (Mouse IgG2a)质粒中,该质粒能够在293T细胞中表达。本研究利用重叠PCR技术扩增获得CTLA4基因序列,能够快速获得目的 基因扩增产物,提高了实验的成功率。     

人尿酸转运蛋白基因的克隆与序列分析

目的 获得编码人尿酸转运蛋白(humanuricacidtransporter,hUAT)的全长基因。方法 从人肾小管上皮细胞株(HK-2)中提取总RNA,根据Genbank中hUAT基因序列设计特异性引物,然后通过RT-PCR法扩增目的片段。所得目的片段酶切后与载体pEGFP-C1连接,经酶切及序列分析鉴定。结果 成功扩增出980 bp的hUAT全长基因,克隆到pEGFP-C1载体后酶切分析结果与预期一致,序列分析结果与Genbank上公布的hUAT序列完全一致。结论 成功克隆出hUAT基因,序列分析结果完全正确,为对该基因进一步研究奠定了基础。     

降落式PCR和SSCP检测淋巴细胞白血病单克隆T细胞受体γ基因重排

目的 以降落式PCR和单链构型多态性(SSCP)方法检测淋巴细胞白血病单克隆T细胞受体(TCR)γ基因重排,探讨其在淋巴细胞白血病诊断中的价值。方法 盐析法提取淋巴细胞白血病患者外周血白细胞DNA,TCR-γ基因重排通用引物和降落式PCR扩增基因重排。分别采用琼脂糖凝胶电泳、SSCP和DNA直接测序方法检测PCR扩增产物。阳性细胞系DNA模板与反应增生性淋巴组织DNA按不同比例混合后扩增,检测降落式PCR的灵敏度。结果 琼脂糖电泳中,18例T淋巴细胞白血病中有15例、4例B淋巴细胞白血病中有2例为阳性,阳性标本经SSCP进一步分析,呈不连续条带。DNA直接测序证实扩增产物为TCR-γ基因重排。阳性对照模板占1%以上时可得到阳性扩增结果。结论 TCR-γ基因重排通用引物结合降落式PCR可有效扩增T淋巴细胞白血病基因重排,可用于T淋巴细胞白血病的辅助诊断。     

白纹伊蚊防御素基因的体外扩增及鉴定

目的 克隆白纹伊蚊的防御素基因并对其进行序列分析。方法 提取白纹伊蚊基因组DNA，根据埃及伊蚊防御素基因序列设计合成引物，PCR产物克隆到T载体中进行测序和分析。结果 从白纹伊蚊基因组DNA中扩增出了约375bP的片段，PCR产物经测序后与已发表的埃及伊蚊防御素基因比较，具有很高的同源性。结论 克隆了白纹伊蚊的防御素基因，为下一步蚊虫防御素蛋白的研究莫定了基础。     

PCR直接测序法检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒DNA

目的 探索检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒(HPV)DNA的有效手段。方法 采用HPV通用引物对宫颈癌标本中的HPVL1区基因序列进行PCR扩增,根据PCR产物序列分析对HPV分型。结果 50例宫颈癌组织HPVDNA检出率为78%,其中HPV16和HPV18型混合感染最多见。检测出1例HPV58型,其L1区基因序列与德国标准株58型比对,未发现碱基变异。结论 PCR直接测序法是对宫颈癌组织中HPV检测和分型的一种有效方法,并可检测到HPV少见的特殊类型,同时也能提供已知的HPV型别的突变信息。     

变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因dgk突变的检测及临床意义

目的：检测变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因dgk是否发生突变并推测该基因对变形链球菌耐氟菌株的影响。 方法：体外人工诱导变形链球菌耐氟菌株，根据GenBank发表的变形链球菌dgk基因序列设计引物，对其耐氟菌株基因组进行PCR扩增,对扩增产物用DNA回收试剂盒回收鉴定,对回收产物用PGEM-T 载体进行T-A克隆，构建重组质粒并测序。结果：PCR扩增获得与预期结果一致的特异性片段并发现8个碱基发生突变,突变位点分别在904(ATA→ATT)、940(GTG→GTC)、946(GAT→GAC)、952(GCC→GCT)、958(GAC→GAT)、964(CAT→CAC)、976(TTG→TTA)、991(AAG→AAA)。提交该序列到GenBank，获得登陆序列号为DQ272517。 结论：变形链球菌耐氟菌株耐酸相关基因dgk发生点突变并属于同义突变。     

复层猪小肠黏膜下层可吸收膜的降解性能

目的 通过体内外实验研究复层猪小肠黏膜下层(multi-laminated small intestinal submucosa,mSIS)可吸收膜的降解性能,并与应用最为广泛的Bio-Gide可吸收生物膜进行比较,为其进一步应用于临床提供实验依据。方法 体外模拟降解采用胶原酶配制降解液,对mSIS膜和Bio-Gide膜进行降解,分别于不同时间点观察二者在降解液中的形态并取出称重,计算降解率。体内皮下埋植采用9只新西兰兔,每只动物背部皮下制备6个皮囊,分别埋入mSIS膜和Bio-Gide膜。于术后4、8、12周取材,通过肉眼观察及HE染色观察不同时间二者的降解程度及组织相容性。结果 体外降解实验显示mSIS膜在第12天降解完全,而Bio-Gide膜在第7天降解完全,且mSIS在降解液中维持形状的时间更长。皮下埋植4周时,mSIS膜和Bio-Gide膜形态相对完整,镜下观二者胶原纤维连续,膜周围少许炎症细胞浸润,Bio-Gide膜部分胶原纤维与周围组织融合。术后8周,mSIS膜形态基本完整,镜下观部分区域与结缔组织融合;肉眼观Bio-Gide膜已破碎,镜下仅可见部分残留纤维与周围组织结合,无完整膜的形态。术后12周时肉眼仅见少量mSIS膜残留碎片,镜下可见mSIS膜残留纤维,与周围结缔组织基本融合;肉眼及镜下观Bio-Gide膜均已消失。结论 mSIS膜皮下埋植降解时间约为12周,Bio-Gide膜约为8周,植入体内生物相容性良好。体外降解mSIS比Bio-Gide膜降解时间延长,且空间维持能力更佳。     

复层猪小肠黏膜下层可吸收膜的降解性能

目的 通过体内外实验研究复层猪小肠黏膜下层(multi-laminated small intestinal submucosa,mSIS)可吸收膜的降解性能,并与应用最为广泛的Bio-Gide可吸收生物膜进行比较,为其进一步应用于临床提供实验依据。方法 体外模拟降解采用胶原酶配制降解液,对mSIS膜和Bio-Gide膜进行降解,分别于不同时间点观察二者在降解液中的形态并取出称重,计算降解率。体内皮下埋植采用9只新西兰兔,每只动物背部皮下制备6个皮囊,分别埋入mSIS膜和Bio-Gide膜。于术后4、8、12周取材,通过肉眼观察及HE染色观察不同时间二者的降解程度及组织相容性。结果 体外降解实验显示mSIS膜在第12天降解完全,而Bio-Gide膜在第7天降解完全,且mSIS在降解液中维持形状的时间更长。皮下埋植4周时,mSIS膜和Bio-Gide膜形态相对完整,镜下观二者胶原纤维连续,膜周围少许炎症细胞浸润,Bio-Gide膜部分胶原纤维与周围组织融合。术后8周,mSIS膜形态基本完整,镜下观部分区域与结缔组织融合;肉眼观Bio-Gide膜已破碎,镜下仅可见部分残留纤维与周围组织结合,无完整膜的形态。术后12周时肉眼仅见少量mSIS膜残留碎片,镜下可见mSIS膜残留纤维,与周围结缔组织基本融合;肉眼及镜下观Bio-Gide膜均已消失。结论 mSIS膜皮下埋植降解时间约为12周,Bio-Gide膜约为8周,植入体内生物相容性良好。体外降解mSIS比Bio-Gide膜降解时间延长,且空间维持能力更佳。     

人皮下和髌下脂肪垫干细胞治疗大鼠骨关节炎的疗效比较

 目的 比较人皮下和髌下脂肪垫干细胞体外增殖、成软骨分化潜能以及体内治疗大鼠骨关节炎的疗效差异。方法 获取上海市东方医院未患代谢性相关疾病患者的皮下和髌下脂肪垫组织,从髌下脂肪垫中分离原代脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ASCs）,体外诱导成脂、成骨、成软骨方向分化。EdU检测人皮下脂肪干细胞（subcutaneous ASCs,Sc-ASCs）和髌下脂肪垫干细胞（infrapatellar fat pad derived stem cells,IPFP-ASCs）体外增殖能力,流式细胞术检测干细胞表面标记蛋白CD34、血管相关标记蛋白CD31的表达。阿尔新蓝染色及Western blot检测Sc-ASCs和IPFP-ASCs体外成软骨潜能。体内实验采用8周SD大鼠随机分为对照（control,CON）组、内侧半月板不稳术（destabilisation of the medial meniscus,DMM）组和DMM手术后Sc-ASCs治疗组,DMM手术后IPFP-ASCs治疗组,通过大体观察、番红固绿染色及OARSI评分比较体内治疗效果。结果 人髌下脂肪垫组织中分离获得ASCs,形态呈长梭形,在体外具有成脂、成骨、成软骨分化潜能。Sc-ASCs和IPFP-ASCs表面标记蛋白CD34和血管相关标记蛋白CD31表达无显著性差异,但人IPFP-ASCs体外增殖能力较强。阿尔新蓝染色及Western blot显示IPFP-ASCs体外成软骨能力较强。体内大鼠实验大体形态学观察显示DMM组骨赘增多,软骨表面缺损,Sc-ASCs治疗组骨赘减少,IPFP-ASCs治疗组表面较光滑,无明显骨赘生成;番红固绿染色显示DMM组软骨层出现垂直裂缝且到达钙化软骨,Sc-ASCs治疗组关节面纤维化且软骨浅表层存在垂直裂隙,IPFP-ASCs治疗组软骨层较为连续,仅存在轻微纤维化;OARSI评分显示IPFP-ASCs治疗骨关节炎疗效更好。结论 人IPFP-ASCs体外增殖能力、成软骨分化潜能以及体内治疗大鼠骨关节炎的效果优于Sc-ASCs。     

三维微环境手性特征调控间充质干细胞线粒体功能

目的 解析手性微环境介导线粒体功能调控骨髓间充质干细胞成骨分化。方法 体外通过三维手性微环境培养间充质干细胞监测干细胞的线粒体膜电位功能,在体内观察凝胶植入后早期缺损区域关键调控线粒体功能趋化CXCL2因子的表达,体外高通量组学分析相关线粒体与代谢信号通路的差异。结果 免疫荧光染色显示右旋手性基质中线粒体线粒体深红色荧光探针染色比例降低,表明右旋手性基质中的干细胞线粒体膜电位出现损伤。大鼠颅骨缺损模型发现在早期植入三维手性凝胶后左旋组修复区域的CXCL2明显表达上调。京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析发现线粒体相关基因与多个信号通路发生了明显的差异表达。差异基因分析发现右旋组中间充质干细胞出现了线粒体降解相关基因的表达上调。左旋手性基质能上调干细胞线粒体NADH脱氢酶活性,右旋手性基质中间充质干细胞线粒体功能出现明显功能损伤。结论 生物植入材料基质手性具备调控干细胞线粒体功能能力。     

DRD2启动子低甲基化通过ERK通路调控乳腺癌细胞增殖

目的 研究肿瘤干细胞标志物多巴胺受体D2（dopamine receptor D2,DRD2）对乳腺癌细胞增殖的影响。方法 采用850K芯片对乳腺癌组织进行检测,并分析DRD2甲基化状态。采用基因筛选、基因敲除和甲基化抑制等技术和方法,进行体外和体内实验,筛选和验证可能存在的分子信号通路。结果 DRD2启动子区在乳腺癌组织中相较于正常组织表现为低甲基化。上调DRD2的表达后,乳腺癌细胞增殖增强,而下调DRD2的表达,乳腺癌细胞增殖显著降低。裸鼠实验发现,过表达DRD2可促进肿瘤生长和Ki67、CD31表达,下调DRD2可抑制肿瘤生长。体内外实验表明,细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）的表达受DRD2表达水平的影响,提示DRD2通过ERK信号通路发挥作用。甲基化抑制剂5-aza-2-脱氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine,5-AzadC）在小鼠体内部分逆转了DRD2表达的下调,失去了对肿瘤细胞增殖的抑制作用,提示抑制DRD2甲基化促进了肿瘤的发展。结论 乳腺癌中DRD2启动子区发生低甲基化。DRD2通过ERK通路在乳腺癌细胞的增殖和迁移中发挥作用。     

一种新型重组免疫毒素DT390-Rantes真核表达质粒的构建及功能

目的 构建一种新型重组免疫毒素DT390-Rantes的真核表达质粒,并对这种免疫毒素的功能进行初步研究。方法 通过RT-PCR的方法,从小鼠肝脏中获得Rantes基因;将Rantes基因插入到含有DT390片段的真核质粒SRα中,构建成重组质粒;重组质粒转入大肠杆菌JM109,筛选出含有正确插入片段的克隆;限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒,并进行DNA序列分析;用脂质体介导法转染NIH3T3细胞,免疫荧光检测重组质粒的表达情况;MTT法测定DT390-Rantes的表达活性。结果 经过酶切分析及DNA测序证实,Rantes基因正确插入到真核表达质粒SRα中,并在NIH3T3细胞中表达;MTT法证实,重组免疫毒素DT390-Rantes能在体外杀伤活化的T细胞。结论 成功地构建了一种新型重组免疫毒素真核表达质粒DT390-Rantes-SRα,该质粒可在真核细胞中瞬时表达,其转染上清对活化的T细胞具有杀伤作用。     

A型流感病毒株核蛋白基因的克隆与重组质粒的构建

目的克隆A型流感病毒株Swine/Henan/703/2001(H3N2)的核蛋白(NP)基因序列并构建重组质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应技术从病毒株基因组中扩增出编码核蛋白的基因序列,克隆至pGEM-TEasy载体,经蓝白筛选、菌落PCR及酶切鉴定挑取阳性克隆并测序。结果利用RT-PCR扩增到目的基因片段,并将其克隆至T载体。结论成功构建重组质粒pGEM-TEasy-NP,为NP相关功能及流感疫苗的进一步研究奠定实验基础。     

博落回总碱对肝癌细胞的毒性作用和体内抗肿瘤作用

目的 观察博落回总碱(TAPP)的体内外抗肿瘤活性作用。方法 MTT法检测TAPP体外对人肝癌Hep3B细胞、小鼠H22肝癌细胞的抑瘤作用;用小鼠移植性肿瘤法检测TAPP对小鼠H22肝癌细胞、S180肿瘤细胞的体内抑瘤作用。测3次重复实验结果。结果 (1)TAPP在体外有明显的细胞毒性作用,可抑制Hep3B、H22细胞增殖,且呈剂量依赖性:其对Hep3B细胞的半数抑制浓度(IC₅₀) 3次重复实验结果分别为3.04、3.98、2.98µg/ml,对H22细胞则分别为2.89、2.21、2.34µg/ml。(2)体内实验表明,TAPP可抑制H22细胞皮下移植瘤的生长,在剂量为每天1、2、4 mg/kg·b.w.时,3次腹腔注射给药实验测得抑瘤率分别为18.6%、35.1%、44.9%,而以每天4 mg/kg·b.w.时口服给药抑瘤率则为7.9%;另外,TAPP可明显延长S180腹水瘤小鼠存活时间,剂量为每天1、2、4 mg/kg·b.w. 时静脉注射给药生命延长率3次重复结果平均分别为24.8%、48.9%、52.7%。结论 TAPP在体内外均有明显的抗肿瘤活性。