小鼠凋亡相关新基因TFAR19 cDNA的克隆化和序列分析

目的：了解一个细胞凋亡相关新基因ＴＦＡＲ１９在不同种属间的序列同源性。方法：利用表达序列标签（ｅｘｐｒｅｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ,ＥＳＴ）拼接技术、ＲＴＰＣＲ、ＤＮＡ序列测定技术及计算机分析技术。结果：首次成功进行了小鼠ＴＦＡＲ１９ｃＤＮＡ编码区的ｃＤＮＡ克隆化和序列分析,发现小鼠和人ＴＦＡＲ１９在核苷酸水平上有８１．４％的同源性,在氨基酸水平上有高达９６％的同源性。功能区分析发现,小鼠ＴＦＡＲ１９ｃＤＮＡ序列含编码１２６个氨基酸的开放性读码框架,含１个可能的ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ依赖的蛋白激酶磷酸化位点,４个可能的ＰＫＣ磷酸化位点。其Ｃ端的“ＥＤＤＡＤＹ”序列与人ＤＮＡ拓扑异构酶Ｉ１４１１４７位残基序列完全相同。结论：小鼠ＴＦＡＲ１９是与人ＴＦＡＲ１９高度同源的新基因,与ＤＮＡ拓扑异构酶Ｉ可能有功能相关性。     

小鼠凋亡相关新基因TFAR19 cDNA的克隆化和序列分析

目的;了解一个细胞凋亡相关新基因ＴＦＡＲ１９在不同种属间的序列同源性。方法;利用表达序列标签小鼠ＴＦＡＲ１９ ｃＤＮＡ拼接技术,ＲＴ－ＰＣＲ,ＤＮＡ序列测定技术及计算机分析技术。结果：首次成功进行了小鼠ＴＦＡＲ１９ ｃＤＮＡ编码区的ｃＤＮＡ克隆化和序列分析,发现小鼠和人ＴＦＡＲ１９在核苷酸水平上有８１．４％的同源性,在氨基酸水平上有高达９６％的同源性。功能区分析发现,小鼠ＴＦＡＲ１９ ｃＤＮＡ序列     

阿尔茨海默病淀粉样前体蛋白可与低密度脂蛋白受体相关蛋 …

目的：研究低密度脂蛋白受体相关蛋白６（ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｉｎ６，ＬＲＰ６）的胞内代谢及其与淀粉样前体蛋白（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＰＰ）的相关性。方法：构建含有ＡＰＰ羧基端１０６个氨基酸的配合表达质粒，用酵母双杂交系统筛选人胎脑ｃＤＮＡ文库。结果：发现ＬＲＰ６的羧基端可以和含有β淀粉样蛋白和胞内区     

人分泌型白细胞介素2受体α链基因的克隆及其在真核细胞…

删除人白细胞介素－２受体α链ｃＤＮＡ中编码胞质内１３个氨基酸及跨膜区１９个氨基酸残基的ＤＮＡ片段后，接上人工合成的终止寡核苷酸片段，改建后的ｃＤＮＡ与真核表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ重组成质粒ｐＣＭＶ／ｒｓＩＬ２Ｒ。用电打孔及磷酸钙法将此质粒转染ＣＨＯ细胞，经Ｇ４１８筛出表达Ｎｅｏ基因的克隆２０株，通过ｍＲＮＡ狭缝杂交及ＥＬＩＳＡ检测，有５株能稳定表达分泌型α链ｍＲＮＡ及蛋白，其中４株细胞培养上清中的Ｉ     

人分泌型白细胞介素2受体α链基因的克隆及其在真核细胞中的表达

删除人白细胞介素－２受体α链ｃＤＮＡ中编码胞质内１３个氨基酸及跨膜区１９个氨基酸残基的ＤＮＡ片段后，接上人工合成的终止寡核苷酸片段，改建后的ｃＤＮＡ与真核表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ重组成质粒ｐＣＭＶ／ｒｓＩＬ２Ｒ。用电打孔及磷酸钙法将此质粒转染ＣＨＯ细胞，经Ｇ４１８筛出表达Ｎｅｏ基因的克隆２０株，通过ｍＲＮＡ狭缝杂交及ＥＬＩＳＡ检测，有５株能稳定表达分泌型α链ｍＲＮＡ及蛋白，其中４株细胞培养上清中的ＩＬ２Ｒα链的含量达１４００Ｕ／ｍｌ以上。     

Dnmt3b cDNA及其在小鼠胚胎组织中选择剪接异构体的克隆

目的 克隆与小鼠胚胎发育相关的新的新的全长ｃＤＮＡ。方法 从小鼠胚胎ｃＤＮＡ文库中筛选出一个新的ＥＳＴ,以８～９ｄ齿小鼠胚胎组织ｍＲＮＡ为模板进行ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）,结合ＰＣＲ筛选ｃＤＮＡ文库,获得共全长ｃＤＮＡ序列后进行序列同源检索、结构分析和功能预测。整合后的ｃＤＮＡ两上物进行ＲＴ－ＰＣＲ,克隆ＰＣＲ产物,并对产物进行全序列测定,验证整     

人凝血因子Ⅸ基因（pKG5—Ⅸ）直接注入小鼠骨骼肌中瞬间表达的研究

我们将带凝血Ⅸ因子基因ｃＤＮＡ的ｐＫＧ５－Ⅸ裸ＤＮＡ直接注入小鼠骨骼肌内，注射后第１４天取小鼠血分离血清进行研究。结果显示：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析中能清晰地看到一与凝血因子ⅨｃＤＮＡ表达相关的特定蛋白带，进一步的实验Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ，ＥＬＩＳＡ及一期法有力地证实了ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果，人ＦⅨ基因转移小鼠出现５５ｋＤ特异带与人ＦⅨ相符，即证明它确系人ＦⅨ。     

人凝血因子Ⅸ基因（pKG_5－Ⅸ）直接注入小鼠骨骼肌中瞬间表达的研究

我们将带凝血Ⅸ因子基因ｃＤＮＡ的ｐＫＧ_５－Ⅸ裸ＤＮＡ直接注入小鼠骨骼肌内，注射后第１４天取小鼠血分离血清进行研究。结果显示：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析中能清晰地看到一与凝血因子ⅨｃＤＮＡ表达相关的特定蛋白带，进一步的实验ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ、ＥＬＩＳＡ及一期法有力地证实了ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果，人ＦⅨ基因转移小鼠出现５５ｋＤ特异带与人ＦⅨ相符，即证明它确系人ＦⅨ。     

鸡肌球蛋白轻链激酶在大肠杆菌中的表达

目的建立鸡肌球蛋白轻链激酶（ｍｙｏｓｉｎｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｋｉｎａｓｅ，ＭＬＣＫ）ｃＤＮＡ表达克隆。方法将ＭＬＣＫ功能区（自动抑制区、钙调蛋白识别区和活性催化区）的ｃＤＮＡ插入质粒ｐＢＫｒｓｖ中，重组质粒（ｐＢＫｒｓｖ－ＭＬＣＫ）转化入大肠杆菌中并获得表达。结果Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹试验表明表达产物的分子量与插入片段ｃＤＮＡ所含信息相一致。结论所获重组克隆在体外表达，表达蛋白具有使多肽底物磷酸化的活性     

人肝细胞总基因组DNA与c—myc,c—N—ras基因甲基化的改变

分别用两种方法研究了人原发性肝细胞癌基因组及特定癌基因片段的ＤＮＡ甲基化情况，并进行对比研究，以＾３Ｈ－ＳＡＭ掺入法研究总基团ＤＮＡ甲基化水平，以限制性内切酶切，Ｓｏｕｔｈ－ｅｒｎ吸印法对ｃ－ｍｙｃ，ｃ－Ｎ－ｒａｓ两种癌基因状况进行分析，结果：发现人肝细胞癌区和癌旁区组织内ｃ－ｍｙｃ，ｃ－Ｎ－ｒａｓ癌基因分别有不同程度的低甲基化，且有癌区总基因ＤＮＡ甲基化水平明显下降，本文结果提示，两种方法检测均     

树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶cDNA和蛋白质序列结构分析

目的克隆获得树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶cDNA序列并进行结构分析。方法以树鼩肝脏mRNA逆转录出的Ⅰ链cDNA为模板,运用SMARTRACEPCR扩增技术,扩增得到树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)cDNA序列,并推导出LCAT氨基酸序列。利用分子生物学软件DNAMAN对氨基酸序列的一、二级结构及主要结构域进行分析和比较。结果树鼩LCATcDNA序列由1340个核苷酸构成,开放阅读框架1320bp,编码440个氨基酸的LCAT前体(含24个氨基酸构成的信号肽和416个氨基酸组成的成熟蛋白)熏3'非翻译区18bp,终止密码TAA,加尾信号AATAAA和一个25bp的poly(A)尾。树鼩LCATcDNA序列已作为新基因被GenBank接受,登记号AF272861。树鼩与人和狒狒LCATcDNA的同源性分别为90%和89%。结论树鼩LCATcDNA序列与人及其他实验动物高度同源。     

树Qu胆固醇酯转运蛋白的cDNA和蛋白质结构分析

目的 获得不易感动脉粥样硬化动物树Qu胆固醇酯转运蛋白（CETP）的cDNA和蛋白质序列,分析其结构特点,寻找其可能的抗动脉粥样硬化分子机制。方法 以从树Qu肝脏mRNA反转录获得的cDNA一链为模板,应用SMART－RACE技术,获得了树QuCETP的cDNA序列,并推导出其蛋白质氨基酸序列,应用分子生物学软件对该蛋白的一级、二级结构进行分析和比较。结果 获得的树QuCETP cDNA（在GenBank中的注册号为AF334033）长1636bp,编码485个氨基酸,其成熟蛋白由477个氨基酸组成,比人多一个氨基酸（Gly318),该蛋白与人、家兔的同源性分别为88％和82％。序列中与CETP结合和转运中性脂质功能相关的区域均非常保守,但在Asm342位的N－糖基化位点缺失,可能使其转运胆固醇酯的活性增加,利于外周组织和血浆中的胆固醇及其酯的清除。通过对不同种属蛋白序列的比较,初步分析了树QuCETP蛋白与功能相关的结构特点。结论 树QuCETP糖基化的特点有可能是该动物对动脉粥样硬化具有不易感性的分子机理之一。     

大鼠MIP3基因的电子克隆和特性分析

210 .seq是一个在大鼠心肌缺血预适应中表达上调的表达序列标签 (expressedsequencetag ,EST) ,用GENSCAN预测、Blast(Basiclocalalignmentsearchtool)比对、序列拼接、多序列比对等生物信息学方法克隆了该EST代表的大鼠MIP3基因的cDNA序列。大鼠MIP3基因的开放阅读框为 1332bp ,起始密码子前同一相位存在一个终止密码子 ,起始密码子邻近的序列符合Kozak规则 ;推测编码 4 4 3个氨基酸 ,与小鼠和人的MIP3基因or tholog的同源性很高 ,但是与数据库中其它蛋白质的同源性不高。TMpred分析显示该多肽有一个跨膜区域 ,氨基端位于膜内。Motifscan分析仅发现一个脯氨酸富集区域。以上结果显示MIP3基因是一个功能未知的新基因     

人干细胞因子在大肠杆菌中的表达研究

目的 经过改造重组人干细胞因子（ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ,ｈＳＣＦ）,提高其表达量。方法 应用人工合成寡核苷酸引物及ＰＣＲ技术,改变人工干细胞因子ｈＳＣＦ ｃＤＮＡ起始密码子ＡＴＧ与ＳＤ序列之间的距离及在翻译起始区（即Ｎ端氨基酸）部分采用大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）喜用型密码子的策略,使重组表达质粒ｐＢＶ２２０－ｈＳＣＦ在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得高效稳定表达。结果 ＤＮＡ序列测量证明基因     

杜氏盐藻RbcS基因cDNA片段的克隆和序列分析

目的：克隆杜氏盐藻-，5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶(RuBisCO)小亚基RbcS cDNA片段。方法：根据莱茵衣藻、团藻、玉米等真核生物的RuBisCO小亚基RbcS氨基酸的高度保守序列ETRSYLPP和MNKLPMFG，设计一对简并引物，采用RT—PCR方法及该简并引物克隆杜氏盐藻RbcS cDNA。PCR产物经T—A克隆与T-vector相连，转化大肠杆菌JM109，随机挑取数个菌落，筛选鉴定，对阳性克隆进行测序分析。将测序结果推导成氦基酸序列进行同源性比较。结果：得到的cDNA长度为209bp，编码69个氨基酸。推导的氦基酸序列与团藻、Chloromonas sp．ANT3、衣藻、伞藻、菠菜、玉米的Rbc S相比较，同源性分刖为85％、84％、82％、76％、70％、69％。结论：所克隆的序列为杜氏盐藻RbcS DNA片段。     

一种新的五步蛇蛇毒类凝血酶Cdna的克隆和序列分析

目的：克隆出五步蛇的类凝血酶cDNA，为研究其结构和功能的关系。并为下一步基因表达开发抗血栓药物提供依据和基础。方法：从五步蛇蛇腺中提取了总RNA，通过反转录合成第一链cDNA，经PCR扩增出五步蛇毒腺中类凝血酶TLE1的cDNA片段，并将其连接到质粒载体扩增，然后进行DNA测序。结果：成功克隆出一种新的五步蛇类凝血酶的cDNA片段。此片段全长794bp，包括编码部分的全长为777bp。推导其编码的蛋白质序列为258个氨基酸，其中包括18个氨基酸的信号肽，6个氨基权的前肽和234个氨基酸的成熟氨基酸顺序。TLE1成熟肽与其它蛇毒类凝血酶相比，蛋白质一级结构具有较高的同源性。结论：从五步蛇中成功克隆出一 种新的类凝血酶cDNA，并确定了它的DNA顺序。     

人类肝脏细胞色素P-450 4F新基因的分离与表达

目的 从人类胎肝ｃＤＮＡ基因文库中分离细胞色素Ｐ－４５０４Ｆ新基因并在体外表达。方法 用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）方法从人类胎肝ＣＤＮＡ基因文库分离中全长ｃＤＮＡ克 ，用ＤＮＡ自动测序仪双方测序，体外酵经平细胞中表达蛋白质。结果 ＤＮＡ序列分析示ＣＤＮＡ全长１９８０碱基对，编码一个５２０个氨基酸的蛋白质，相对分子量５９７００，ｃＤＮＡ编码的氨基酸序列与人类白细胞的白三烯Ｂ４Ｗ－羟化酶不（ＣＹＰ４Ｆ３     

短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白β亚基的基因克隆和序列分析

目的：克隆短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白（PBAP）β亚基基因,并对该基因进行序列分析。方法：从短尾蝮蛇的毒腺中提取总RNA,设计引物并采用RT-PCR技术进行体外扩增PBAPβ亚基cDNA序列,将PCR扩增产物克隆至载体PMD-19T,通过PCR进行鉴定后,提取阳性克隆菌体质粒进行测序。结果：序列分析结果显示：PBAPβ亚基cDNA序列长度为441bp,编码框由146个氨基酸组成,其中包括由23个氨基酸的信号肽,以及123个氨基酸组成的成熟肽。结论：PBAPβ亚基基因及其氨基酸序列和已报道的一些蛇毒凝集素β亚基的基因以及氨基酸序列相比较,有88%～99%的同源性。