TaqMan探针双重荧光PCR法检测副溶血性弧菌毒力基因

目的建立同时检测副溶血性弧菌毒力基因tdh和trh的双重荧光PCR方法。方法筛选副溶血性弧菌tdh和trh毒力基因的特异性引物和探针,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR扩增体系,进行特异性、灵敏度实验,并对本实验室保存的54株副溶血性弧菌进行tdh、trh毒力基因的检测,以了解不同来源的副溶血性弧菌携带毒力基因的状况。结果建立的双重荧光PCR方法特异度强(100%),最低检测浓度达到20 cfu/ml,对本实验室保存的副溶血性弧菌进行毒力基因的检测结果显示,从临床分离的10株副溶血性弧菌和海产品样品中分离的1株副溶血性弧菌均为tdh扩增阳性,trh扩增阴性。结论所建立的方法特异性好,灵敏度高,适用于副溶血性弧菌的毒力基因检测。     

MPCR-DHPLC检测大肠杆菌O157研究

目的:建立多重PCR(Multiplex PCR,MPCR)结合变性高效液相色谱(Denaturing High-PerformanceLiquid Chromatography,DHPLC)检测大肠杆菌O157的方法,并了解食品中分离的O157毒力基因携带情况。方法:针对大肠杆菌O157的rfbE、flicH7、eaeA、stx1、stx2基因设计引物,其单一PCR扩增产物在DHPLC上出现的色谱峰为标准色谱峰,建立MPCR-DHPLC检测方法。结果:MPCR扩增产物在DHPLC上的色谱峰,在位置和峰型上与标准色谱峰有较好的对应性。DHPLC能分离大小4个碱基差异的DNA片段。4株分离株检测结果,O157-1出现rfbE、flicH7、eaeA基因色谱峰,O157-2、O157-3、O157-4只出现rfbE基因色谱峰。结论:建立的MPCR-DHPLC方法可用于大肠杆菌O157及其毒力基因的检测。     

携带双毒力基因的副溶血性弧菌tdh、trh基因分子特征研究

目的了解广西境内海产品牡蛎中分离到的携带tdh和trh两种毒力基因的副溶血性弧菌GX21的基因分子特征,分析与各地副溶血性弧菌的相关性,探讨水产品中副溶血性弧菌流行趋势。方法将监测海产品牡蛎中分离到的一株携带两毒素基因的副溶血性弧菌应用双重PCR的方法检测该菌tdh和trh两种毒力基因。把扩增产物切胶纯化后测序,将测序序列在GenBank DNA序列数据库上BLAST比对,分析比较结果。结果两扩增产物tdh-A和trh-A的序列与GenBank数据库中的多个序列有极高的相似度,最高达99%,只有一个碱基的错配或一个gaps。结论扩增产物tdh-A为副溶血性弧菌GX21的tdh基因不完全cds,trh-A为副溶血性弧菌GX21的trh基因不完全cds。比对表明副溶血性弧菌GX21与日本学者在1994年公布的副溶血性弧菌(TH3766)有很高的同源性。     

2006年-2013年四川省副溶血性弧菌毒力基因及耐药分析

目的研究四川省副溶血性弧菌毒力基因携带及抗生素的耐药情况,为副溶血性弧菌疾病防治提供科学依据。方法运用多重荧光定量PCR对2006年-2013年共计290株副溶血性弧菌,进行耐热直接溶血素基因(tdh)和相关溶血素基因(trh)检测,用肉汤稀释法测定8种抗生素的耐药性。结果 290株菌中有22.4%的菌株仅携带tdh基因,0.7%的菌株仅携带trh基因,0.3%的菌株同时携带tdh和trh毒力基因。59株临床分离株中57株均仅携带tdh基因,检出率为96.6%。290株副溶血性弧菌仅有11株(3.8%的菌株)出现耐药。结论四川省副溶血性弧菌临床分离株多携带tdh毒力基因,食品分离株毒力基因携带率低,副溶血性弧菌分离株对抗生素敏感性较高,大多数现行临床使用的抗生素药物都是有效的,菌株的毒力基因携带与否和耐药无必然联系。     

广西不同来源副溶血性弧菌毒力基因分子特征研究

目的 了解广西境内不同来源的副溶血性弧菌的血清学分型及这些分离株存在毒力基因的情况,从毒力基因的分子特征分析水产品中的副溶血性弧菌与临床分离株的相关性,为对水产品中副溶血性弧菌进行风险性评估和开展食品安全性检测研究提供理论依据. 方法以2007年广西食源性疾病监测网36株副溶血性弧菌分离株(水产品来源株和临床株)为研究对象,利用O抗标准血清分型的基础上,应用PCR的方法检测该菌tdh和trh两种毒力基因. 结果水产品分离株血清分型呈多样性,毒力基因阳性率低;临床分离株血清型集中为O1和O3,均存在tdh毒力基因. 结论广西境内的副溶血性弧菌感染主要与携带tdh毒力基因的该菌有关,监测时不仅要关注水产品中该菌的高分离率,更要关注和防范携带毒力基因的副溶血性弧菌.     

武汉市64株副溶血性弧菌水产品分离株分子特征的研究

目的了解武汉地区水产品中副溶血性弧菌的分子特征,为防止副溶血性弧菌引起的食源性疾病提供基础数据。方法采用PCR的方法,对武汉市2008年-2013年从水产品中分离的64株副溶血性弧菌进行了耐热性溶血毒素基因tdh、耐热性溶血毒素相关溶血素基因trh、不耐热溶血素基因tlh、毒力表达基因toxR和大流行株O3:K6特征基因片段orf8进行检测,并进行统计分析。结果在64株副溶血性弧菌中,tdh、trh基因的阳性率为14.06%和4.69%,orf8基因的阳性率为7.81%,而toxR和tlh基因的阳性率为100.00%。结论 tlh和toxR基因可作为副溶血性弧菌的快速初筛和辅助鉴定手段。武汉地区水产品中副溶血性弧菌tdh,orf8阳性率较高,建议卫生监督部门加强水产品监管,提防公共卫生事件的发生。     

进、出口海产品中副溶血性弧菌整合子与毒力基因调查

目的了解宁波口岸进、出口海产品中副溶血性弧菌的整合子和毒力基因分布情况。方法将来自宁波口岸海产品中分离的120株副溶血性弧菌作为研究对象,利用PCR技术检测其整合子和6个毒力基因(tdh、tlh、trh、toxR、Ure C和T3SS2)携带率。结果 120株副溶血性弧菌中,Ⅰ类整合子总携带率为34.2%、出口海产品中的携带率为31.7%、进口海产品中的携带率为36.7%,Ⅱ类和Ⅲ类整合子都为阴性;毒力基因tlh、toxR的携带率为100%,Ure C的携带率为4.17%、T3SS2的携带率为5.83%、tdh的携带率为2.50%,trh全部阴性。结论进、出口海产品中副溶血性弧菌存在携带毒力基因的风险不高,进口和出口海产品中毒力基因携带率差异很小,整合子携带率高,但对食品安全具有潜在的威胁,仍需要加强监测。     

2008年-2010年台州市食源性副溶血性弧菌分子特征研究

目的:分析2008年-2010年台州市食源性副溶血性弧菌的主要毒力基因分布情况及分子分型特征,为建立台州市副溶血性弧菌的DNA指纹图谱数据库提供基础。方法:利用PCR方法对52株食源性副溶血性弧菌检测主要毒力基因(tdh、trh、tlh、ureC、T3SS-2(vscC2、vcrD2)),并用PFGE分析部分菌株的基因分型特征。结果:在52株食源性副溶血性弧菌中检出同时携带tdh基因和vscC2基因1株;25株菌被分为25种PFGE图谱,聚类分析显示菌株间呈现明显多态性。结论:台州市食源性副溶血性弧菌主要毒力基因携带率低,菌株间基因呈多态性,没有发现优势菌群,提示本地食品中副溶血性弧菌不存在流行趋势。     

双重PCR快速检测副溶血弧菌

目的:建立一种快速、敏感、特异的双重PCR方法检测副溶血弧菌.方法:根据GenBank收录的副溶血弧菌tdh、trh、tlh基因序列用vtII软件分别设计引物,应用多重PCR技术同时扩增副溶血弧菌的特异性基因tdh、trh、flh.结果:副溶血弧菌标准株和实验菌株均能扩增一条或两条目的带,扩增产物tdh、trh、tlh片段大小分别为224,466,381 bp.结论:tdh、trh基因分别存在于不同副溶血弧菌株中,而tlh基因在不同副溶血弧菌中都广泛存在,具有种属特异性,因此可以用来特异快速的检测副溶血弧菌.     

副溶血性弧菌毒力基因及耐药性检测分析

目的了解宁波市感染性腹泻病原菌中副溶血性弧菌的血清型分布、毒力基因特点和耐药性状况,为预防和控制由副溶血性弧菌引起的感染性腹泻提供科学依据。方法采用血清学试验对副溶血性弧菌进行血清分群;利用PCR扩增检测副溶血性弧菌的耐热溶血毒素基因（tdh）和耐热溶血毒素相关基因（trh）;采用K-B纸片扩散法检测抗生素敏感性。结果宁波地区引起感染性腹泻的副溶血性弧菌的89.19%是O3血清群,tdh基因携带率达到89.19%,trh基因全部阴性,对除氨苄西林外的大多数抗菌药物敏感。结论宁波地区引起感染性腹泻的副溶血性弧菌的血清群主要是O3群,且携带tdh基因,对大多数抗菌药物敏感。     

利用多重PCR检测食品中副溶血性弧菌的方法研究

目的:建立食品中副溶血性弧菌的简便、快速、准确地检测方法。方法:根据副溶血性弧菌的tl、tdh、trh基因设计引物,多重PCR扩增,进行特异性和标准菌株的验证,并用经典方法做平行试验。结果:本实验设计的引物能特异性地扩增副溶血性弧菌的450、269、500 bp的片断,而对其它种类的菌无特异性扩增。结论:本实验方法可在增菌后8 h快速、简单、准确的检测出食品中的副溶血性弧菌,灵敏度可达15 cfu/ml。     

应用SYBR Green Ⅰ荧光PCR快速检测副溶血弧菌及其毒力基因

目的利用SYBR Green Ⅰ荧光PCR反应检测副溶血弧菌及其trh和tdh毒力基因。方法根据副溶血弧菌tlh基因设计引物,建立检测副溶血弧菌SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,利用33株副溶血弧菌分离株以及22株其他种属细菌进行特异性和灵敏度评价。根据副溶血弧菌trh和tdh毒力基因序列设计引物,建立检测副溶血弧菌毒力基因的单重和双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,并对这两种方法进行特异性和灵敏度评价。结果本研究中基于tlh基因的荧光PCR检测对全部33株副溶血弧菌检测为阳性,检测下限为5×101拷贝/μl,而22株其他种属细菌均为阴性。毒力基因trh和tdh均能特异性检测,其单重荧光PCR检测下限为5×101拷贝/μl,双重荧光PCR检测下限为5×102拷贝/μl。结论本研究建立了tlh作为靶基因检测副溶血弧菌的单重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法和同时检测副溶血弧菌trh和tdh毒力基因的双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,简化了毒力基因检测,有良好的实际应用前景。     

大连沿海贝类产品副溶血性弧菌基因检测

目的 了解辽宁大连沿海地区贝类产品中副溶血性弧菌的污染状况及3种毒力基因的携带情况。方法 采集大连周边海域养殖场及农贸市场132份贝类样品,用实时荧光PCR检测方法进行副溶血性弧菌标靶基因tl基因检测,同时检测tdh、trh和orf8毒力基因并进行分析。结果 在132份贝类样品中,检测出携带有副溶血性弧菌标靶基因43份,检出率为32.6%(43/132),其中携带有tdh基因阳性2份4.7%(2/43),trh基因阳性2份4.7%(2/43), orf8基因阳性1份2.3%(1/43),同时携带有tdh、orf8基因阳性1份2.3%(1/43),同时携带tdh、trh基因阳性16份37.2%(16/43);牡蛎中副溶血性弧菌标靶基因tl检出率为28.8%(23/80),毒力基因同时携带10株。结论 大连贝类海产品中携带副溶血性弧菌情况比较严重。     

福建不同来源副溶血性弧菌的毒力因子检测

目的 了解福建省不同来源副溶血性弧菌携带毒力因子情况,为副溶血性弧菌食物中毒的检测和研究提供参考依据.方法 用PCR方法检测从食品及食物中毒病人分离菌株的毒力因子.结果 食品和临床病人分离菌株均含t/h基因,不含trh基因;临床分离菌株均含tdh基因,而食品分离菌株均不含tdh基因或含量少.结论 福建省副溶血性弧菌食物...     

甬沪两地海产品中副溶血性弧菌携带与分型

目的:了解宁波和上海两地市售海产品中副溶血性弧菌污染情况以及菌株的流行优势型和毒力等.方法:用PCR快速筛检与GB法相结合方法分离海产品中副溶血性弧菌;用血清学和PFGE方法对菌株进行分群和基因分型;用PCR方法检测tdh和trh毒力基因;结果:从3 740份海产品中分离出1 507株疑似副溶血性弧菌,检出率为40.29％,其中宁波地区检出率为41.42％,上海地区检出率为21.86％;菌株的生化反应典型,560株副溶血性弧菌分出10个血清群,有30株VP未被分型,分型率为95.06％,377株副溶血性弧菌分出29个PFGE型;497株副溶血性弧菌检出7株带tdh毒力基因的副溶血性弧菌,均未检出trh毒力基因,检出率为1.41％.结论:宁波、上海海产品中副溶血性弧菌携带率较高,是诱发副溶血性弧菌疾病的原因食品.菌株的血清型和PFGE型较分散,其流行优势群与致病性副溶血性弧菌的相关性不明显;菌株带tdh和trh毒力基因较低,与病人分离株有明显差别,根据该特征,可将副溶血性弧菌分为致病的和非致病两类,便于分析和检测.     

一起副溶血性弧菌食物中毒的调查与分析

目的分析食物中毒的原因,查明致病菌。方法对14例食物中毒患者进行流行病学调查,3例食物中毒患者肛拭子、1份粪便标本及7份剩余菜肴进行病原菌的分离、鉴定,并对分离菌株进行血清学分型、毒力基因多重PCR检测tdh、trh和toxR基因试验、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型。结果 3份食物中毒患者肛拭子、1份粪便标本中均检出副溶血性弧菌,经血清学分型、毒力基因多重PCR检测、PFGE分子分型试验,4份患者标本的分离株试验结果完全一致。均为副溶血性弧菌,血清型为O4∶K9,毒力基因tdh阳性、trh阴性和toxR阳性,脉冲场凝胶电泳图谱的聚类分析结果显示:4株副溶血性弧菌的带型相似度为100%。7份剩余菜肴均未检出相关致病菌。结论根据流行病学调查,实验室检测分析,这是一起由副溶血性弧菌污染食物所致的食物中毒。     

长沙地区8起副溶血性弧菌食物中毒的病原学特征分析

目的了解长沙地区副溶血性弧菌食物中毒的病原学特征,为预防和控制由副溶血性弧菌引起的食源性疾病提供科学依据。方法对2015年长沙地区8起食物中毒事件中分离的21株副溶血性弧菌进行血清学分型,PCR检测毒力基因tdh和trh,微量肉汤稀释法测定抗生素敏感性,脉冲场凝胶电泳进行分子分型。结果 21株副溶血性弧菌均为O3∶K6血清型;tdh携带率为100%,未检测到trh阳性菌株;分离菌株对氨苄青霉素耐药率为14.29%,对四环素、氯霉素等其他7种抗生素均敏感;分离株PFGE带型相似度高(85%)。结论长沙地区引起食物中毒的副溶血性弧菌主要为O3∶K6血清型,菌株都携带tdh毒力基因且相似度高。     

嘉定地区副溶血性弧菌溶血毒素基因特征的研究

目的了解嘉定地区从患者肛拭和食品中分离的副溶血性弧菌菌株的溶血毒素基因特征。方法收集近年来嘉定地区从腹泻患者肛拭和食品中分离到的282株副溶血性弧菌菌株,应用PCR技术进行tdh基因、trh基因、tlh基因的检测。结果肛拭来源的226株副溶血性弧菌,其tdh基因携带率为96.90%,而分离自食品的56株菌株未见有tdh基因携带;肛拭和食品分离到的菌株trh基因携带率分别为2.21%、5.36%;肛拭和食品分离到的菌株tlh基因携带率分别为99.56%、98.21%。结论引起嘉定地区食物中毒及散发腹泻的副溶血性弧菌主要为tdh阳性、trh阴性菌株,而食品中主要是tdh阴性、trh阴性菌株。     

应用多重实时荧光PCR方法检测副溶血性弧菌及其毒力基因

目的应用多重实时荧光PCR方法检测113株食物中毒副溶血性弧菌分离株多种毒力基因携带情况。方法用水煮法提取菌株DNA后,利用四重实时荧光PCR方法对DNA同时进行4种基因的检测。结果所有的菌株均携带tlh基因,96株菌株(84.96%)携带tdh基因,9株菌株(7.96%)携带trh基因及62株菌株(54.87%)携带orf8基因的菌株同时tdh基因检测为阳性,无同时携带trh基因和orf8基因的菌株。trh、tdh基因和orf8基因阳性的菌株分布在O1~O4血清群。结论本市大部分食物中毒菌株携带除tlh基因外的1种或1种以上的毒力基因,一半以上的菌株为大流行株;四重实时荧光PCR方法可以同时鉴定和检测副溶血性弧菌及毒力基因,建议作为食源性暴发事件的常规检测方法,获得更快速、准确、完整的结果。     

双重PCR检测副溶血性弧菌的tlh和tdh基因方法建立与初步应用

目的 建立同时检测副溶血性弧菌的tlh和tdh基因的双重聚合酶链式反应(PCR)法. 方法 根据副溶血性弧菌的tlh、tdh基因序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测.同时优化反应体系,测定稳定性、重复性、特异性及灵敏度. 结果 本实验设计的引物能特异性地扩增副溶血性弧菌的450、269 bp的片段,而对其它种类的菌物无特异性扩增,结果表明该方法特异性好,双重PCR检测灵敏度为100 cfu/ml.并进行了肛门拭子样品的检测. 结论 初步建立能在8h内快速、灵敏、特异地检出副溶血性弧菌毒力菌株的双重PCR技术.