结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP-10的原核表达

目的 构建结核分枝杆菌(MTB)早期分泌蛋白CFP-10原核表达载体并进行诱导表达.方法 通过PCR技术从结核分枝杆菌H37 Rv基因组中扩增出lhp基因片段,目的基因片段克隆至表达载体pET-32a(+),构建pET-32a-CFP-10重组表达质粒,将其转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达.结果 成功地构建原核表达载体pET-32a-CFP-10,以重组体转化E.coli BL21(DE3),成功进行诱导表达.结论 成功构建CFP10的原核表达质粒,高效表达目的蛋白CFP-10,为进一步研究其免疫学功能奠定了基础.     

A型流感病毒NP基因的克隆表达与鉴定

目的 构建人A型流感病毒NP基因原核重组表达载体并在E.coli BL21(DE3)中表达.方法 从流感患者咽分泌物中提取总RNA,设计特异性引物,经RT-PCR得到NP基因开放阅读框cDNA后定向克隆到原核表达载体pET28b(+),构建含目的 基因的pET28b(+)-NP重组质粒,经酶切、PCR和测序正确后转化E.coli BL21(DE3),0.1mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 ①成功构建了pET28b(+)-NP重组质粒;②在E.coli BL21(DE3)中表达了一分子量约55 kDa的融合蛋白,经Western blot鉴定正确.结论 重组质粒pET 28b(+)-NP构建成功并在E.coli BL21(DE3)中高效表达了人A型流感病毒NP蛋白,为后续该蛋白的功能研究奠定了基础.     

EV71亚单位VP1的原核表达、纯化及免疫原性分析

目的原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)亚单位VP1蛋白,分析其免疫原性。方法采用PCR技术扩增EV71 VP1(AB204852.1)基因序列,构建重组质粒p ET32a(+)-VP1并转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达6×His-VP1融合蛋白,将表达的蛋白用Ni2+-NTA树脂纯化、TGE液复性后免疫新西兰大白兔,制备抗VP1的抗血清,用间接ELISA法检测抗血清效价。结果重组工程菌p ET32a(+)-VP1/BL21(DE3)高效表达了相对分子质量约为42 k D的VP1融合蛋白,蛋白经纯化复性后免疫新西兰大白兔所得抗血清效价大于1︰625 000。结论原核表达系统p ET32a(+)/BL21(DE3)能高效表达EV71亚单位VP1融合蛋白,蛋白经纯化复性后具有良好的免疫原性,为进一步研制以双歧杆菌为抗原载体的新型疫苗奠定了基础。     

甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白fliC-a基因的克隆、原核表达及鉴定

目的:克隆甲型副伤寒沙门菌1相鞭毛蛋白抗原(H1抗原)fliC-a基因,构建原核表达系统并鉴定重组蛋白的抗原性。方法:PCR方法扩增fliC-a基因,克隆到质粒pET-42a构建原核表达载体pET-fliC-a,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导目的重组蛋白rfliC-a表达,用SDS-PAGE鉴定rfliC-a,Western blot和双向免疫扩散法鉴定rfliC-a的抗原性和免疫原性。结果:成功表达并纯化获得相对分子量为14.4 kDa的重组蛋白rfliC-a,rfliC-a能与兔抗甲型副伤寒沙门菌全菌血清发生特异性结合,免疫家兔获得高效价抗体。结论:成功构建了fliC-a基因原核表达系统,所表达的rfliC-a具有良好的抗原性。     

埃可病毒9型VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的原核表达并纯化埃可病毒9型(ECHO9)VP1蛋白,免疫兔子制备多克隆抗体,鉴定重组蛋白的免疫活性,为ECHO9血清学检测试剂和疫苗研究提供依据。方法 PCR方法扩增VP1基因,构建原核表达质粒p ET28a-VP1并转化到大肠杆菌(E.coli BL21),诱导表达并纯化VP1重组蛋白,免疫兔子制备抗VP1多克隆抗体,ELISA检测抗VP1抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性。病毒中和试验鉴定抗体中和ECHO9病毒的能力。结果 VP1重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VP1抗体效价为1∶105。Western blot检测结果显示,抗VP1多克隆抗体可以识别原核表达的VP1蛋白。中和试验显示抗体对ECHO9病毒有中和作用,其效价为1∶10。结论本研究成功原核表达了ECHO9的VP1蛋白并制备出抗VP1多克隆抗体,有助于ECHO9的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究。     

耐辐射奇球菌recF和recO基因的克隆表达与功能验证

目的 构建耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,Dr)recF和recO基因的原核表达重组子并在E.coli BL21(DE3)中表达,检测RecO和RecF蛋白能否提高Ecoli BL21(DE3)对紫外线辐射的抵抗能力.方法 采用PCR扩增Dr菌基因组中recF和recO基因片段,以质粒pET30b(+)为基础,构建重组质粒pET30b(+)-recF和pET30b(+)-recO,并转化到E.coliBL21(DE3)中,LPTG诱导重组RecF和RecO蛋白表达,表达产物采用SDS-PAGE鉴定;计算紫外辐照前后各组细菌生存率变化.结果 构建了pET30b(+)-recF和pET30b(+)-recO重组载体,经IPTG诱导后能在E.coli BL21(DE3)中表达RecF和RecO蛋白.结论 构建了原核表达重组质粒pET30b(+)-recF和pET30b(+)-recO,实现RecF和RecO在原核细胞中的表达,体外实验证明Rec0和RecF蛋白能提高E.coli BL21(DE3)对紫外线辐射的抵抗能力.

Abstract：

Objective To construct expressing recombinant of recF and recO from Deinococcus radiodurans Rland express the target protein in E.coli BL21(DE)3.Methods recF and recO gene were amplified by PCR from genomic DNA of Deinococcus radiodurans R1 and inserted into expression plasmid vector pET30b(+) to construct pET30b(+)-recF and pET30b(+)-recO.The recombinant plasmids were transformed into E.coli BL21(DE)3 and the recombinant proteins were expressed by the isopropyl-β-D-thingalactopyranoside(IPTG)and were analyzed with SDS-PAGE.The changes in the survival rate of bacteria in each group before and after UV-irradiation were calculated.Results The recombinant plasmid pET30b(+)-recO and pET30b(+)-recF was obtained and the recombinant protein could be highly expressed in E.coli BL21(DE)3.Conclusion This study has provided a foundation for further studies and applications of the recombinant RecF and RecO,and initial detection shows that recO and recF gene Can increase the resistant ability of E.coli.     

亚洲牛带绦虫NOMO1基因在原核细胞中表达

目的 构建亚洲牛带绦虫NOMO1基因原核重组质粒,进行原核表达、纯化及免疫学研究.方法 以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中含NOMO1基因的质粒作为模板,扩增该基因,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,测序鉴定重组质粒后再行诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,并用蛋白免疫印迹(Western-blotting)分析其免疫反应性.结果 成功建构了原核重组质粒pET28a(+)-NO-MI1.该基因在大肠埃希菌中以包涵体形式存在,破包涵体后纯化蛋白通过SDS-PAGE鉴定结果表明该基因在大肠埃希菌BL-21/DE3得到高效表达.Western blotting结果显示,该重组蛋白可被亚洲牛带绦虫、牛带绦虫病人血清识别,具有免疫反应性.结论 成功克隆亚洲牛带绦虫NOMO1基因、表达和纯化得到了该基因的重组蛋白并且证明该基因具有免疫反应性,为进一步研究该基因的功能提供条件.     

结核分枝杆菌Rv3914抗原的克隆表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv3914蛋白的重组质粒,并在大肠埃希菌中表达及纯化,为结核病血清学诊断提供候选抗原。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增Rv3914基因片段,插入到pET-28b(+)载体中,构建pET28b-Rv3914重组质粒,转化大肠埃希菌E.coli BL21plysS(DE3),经IPTG诱导表达后,应用Ni-NTA亲和柱纯化重组蛋白。结果 PCR扩增出Rv3914基因序列,重组质粒经测序并经BLAST分析后发现无点突变。pET28b-Rv3914重组质粒在大肠埃希菌E.coli BL21plysS(DE3)中主要以可溶性形式表达,重组蛋白占细胞蛋白总表达量的30%以上,经Ni-NTA柱纯化后,得到纯度超过90%、相对分子质量约为14.7×103的目的蛋白质。结论高纯度结核分枝杆菌Rv3914重组蛋白的获得为研究结核互补特异性抗原组合在结核病血清诊断中的价值奠定了基础。     

大鼠Clara细胞分泌蛋白CC16基因的克隆和原核表达及纯化

目的 克隆大鼠Clara细胞分泌蛋白(CC16)基因,原核表达并纯化重组的CC16蛋白,为进一步研究CC16蛋白的功能及对炎症性气道疾病的治疗作用奠定基础.方法 制备大鼠肺组织总RNA,根据大鼠CC16基因全长编码序列(GenBank登录号:NM_013051)的开放阅读框设计引物并进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli DH5α),阳性菌落经PCR和双酶切鉴定并测序.将重组质粒pET30a(+)-rCC16转化至E coli Rosetta(DE3)并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物,重组融合蛋白经Ni2+琼脂糖凝胶亲和纯化.分别以抗His标签抗体和山羊抗CC16抗体进行免疫印迹(Western blotting)分析并鉴定重组蛋白.结果 RT-PCR扩增产物约为290 bp.菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-rCC16构建成功.SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约16 kDa的可溶性重组蛋白.Western blotting结果表明,诱导表达的蛋白质为带His标签的重组融合蛋白,且能被山羊抗CC16抗体识别.结论 成功构建基因重组体pET30a(+)-rCC16,并制备出可溶性大鼠重组CC16蛋白.     

大鼠生精相关基因TSARG1原核表达载体的构建和表达

目的构建大鼠生精相关基因pGEX-KG/TSARG1重组载体并进行原核表达。方法应用RT-PCR技术从大鼠睾丸组织mRNA中扩增TSARG1的开放阅读框（ORF）,T-A克隆后将TSARG1插入到原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入宿主菌E.coliBL21,IPTG诱导表达GST/TSARG1融合蛋白。结果成功构建pGEX-KG/TSARG1重组质粒;转化重组质粒的E.coli BL21经IPTG 37℃诱导高效表达GST/TSARG1融合蛋白。结论 pGEX-KG/TSARG1原核表达载体的成功构建为进一步研究TSARG1的生物学功能奠定了基础。     

H7N9亚型禽流感病毒核蛋白NP原核表达载体的构建与表达

目的构建甲型H7N9禽流感病毒NP基因的原核表达载体,并表达其编码重组蛋白。方法 RT-PCR法扩增H7N9病毒NP基因,克隆至原核表达载体PET28a(+)中,构建表达载体PET28a(+)-NP质粒;经PCR、双酶切、测序鉴定后,将PET28a(+)-NP质粒转化表达菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达NP重组蛋白。应用western blot法鉴定NP蛋白的表达。结果成功构建NP基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达出分子量为56kD的NP重组蛋白。结论实现了禽流感病毒H7N9NP重组蛋白在原核系统中的高效表达,为禽流感诊断试剂及单抗的研发工作奠定了基础。     

空肠弯曲菌peblA基因的克隆表达及免疫性鉴定

目的：克隆空肠弯曲菌peblA基因，构建其原核表达载体；鉴定重组表达产物的免疫原性。方法：PCR扩增空肠弯曲菌peblA基因，构建pET-28a（＋）-peblA表达载体。转化E coli BL21（DE3）后诱导表达，用SDS—PAGE鉴定表达产物。采用Ni—NTA亲和层析法收集表达的目的重组蛋白PEBl。采用CJ全菌抗体的Western blot鉴定rPEBl免疫反应性，双向免疫扩散试验鉴定rPEBl免疫家兔的抗血清效价。结果：所克隆的基因与报道的核苷酸序列同源性为99．9％，转化E coli BL21（DE3）后，表达产物最高表达量占全菌总蛋白的33％左右，纯化后获得纯度为96％的重组蛋白。Western blot证实rPEBl能与CJ全菌抗体发生特异性免疫结合反应。兔抗rPEBl血清的双向免疫扩散效价为1：16。结论：成功地构建了高效表达载体pET-28a（＋）-peblA，并获得rPEBl，所表达的rPEBl具有良好的免疫原性和免疫反应性，为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

鹦鹉热衣原体Mip基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备

目的克隆鹦鹉热衣原体巨噬细胞感染增强蛋白(Microphage infectivity potentiator,Mip)基因,构建原核重组质粒,诱导表达重组蛋白,并免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定了基础。方法提取鹦鹉热衣原体6BC基因组DNA,PCR扩增Mip基因,克隆至p ET-30a(+),构建原核表达载体p ET-30a(+)-Cps Mip。PCR、酶切及测序鉴定后,IPTG诱导p ET-30a(+)-Cps Mip在E.coli BL21中表达目的蛋白。融合蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中抗Mip抗体的效价。结果 PCR扩增得到大小约为768 bp左右的Mip目的片段;经PCR、酶切及测序鉴定,证明构建的原核重组质粒中插入的片段为Cps Mip基因,测序结果经BLAST分析,与Genbank上登录序列完全一致。经IPTG诱导,重组工程菌表达一相对分子量(Mr)约为34 k D的目的蛋白;ELISA检测免疫小鼠血清效价为1:128 000。结论成功构建了鹦鹉热衣原体Mip基因原核表达载体,并表达了相应可溶性蛋白,制备了高效价的鼠抗Mip多克隆抗体。     

空肠弯曲菌peb1A基因的克隆表达及免疫性鉴定

目的:克隆空肠弯曲菌peb1A基因,构建其原核表达载体;鉴定重组表达产物的免疫原性。方法:PCR扩增空肠弯曲菌peb1A基因,构建pET-28a(+)-peb1A表达载体。转化E.coliBL21(DE3)后诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物。采用Ni-NTA亲和层析法收集表达的目的重组蛋白PEB1。采用CJ全菌抗体的Western blot鉴定rPEB1免疫反应性,双向免疫扩散试验鉴定rPEB1免疫家兔的抗血清效价。结果:所克隆的基因与报道的核苷酸序列同源性为99.9%,转化E.coliBL21(DE3)后,表达产物最高表达量占全菌总蛋白的33%左右,纯化后获得纯度为96%的重组蛋白。Western blot证实rPEB1能与CJ全菌抗体发生特异性免疫结合反应。兔抗rPEB1血清的双向免疫扩散效价为1:16。结论:成功地构建了高效表达载体pET-28a(+)-peb1A,并获得rPEB1,所表达的rPEB1具有良好的免疫原性和免疫反应性,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

重组多价人精子表位肽的原核表达及其条件优化

目的构建重组多价人精子表位肽原核表达质粒,优化其在大肠杆菌中的表达条件。方法用化学合成法合成多价人精子表位肽基因。该基因经PCR扩增,BamHI和XhoI双酶切后,克隆至GST融合表达载体PGEX-4T-1获得重组质粒。将该重组质粒转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统,观察在摇瓶发酵条件下改变培养基组成、诱导温度、诱导时机、诱导剂浓度和诱导时间等条件对GST-多价人精子表位肽融合蛋白表达量的影响。结果构建了重组多价人精子表位肽原核表达载体。在摇瓶实验中,优化的表达条件为:TB培养基,诱导温度37℃,在菌体对数生长的中后期进行诱导,IPTG诱导终浓度0.05 mmol/L,诱导时间5 h。优化后GST-多价人精子表位肽融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的30.2%,且主要以可溶形式表达。结论成功构建重组多价人精子表位肽原核表达质粒,重组表达载体在E.coli BL21(DE3)内主要表达可溶形式的GST-多价人精子表位肽融合蛋白,在优化条件下可获得较高的表达量。     

肠道病毒71型重组VP1蛋白的原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化肠道病毒71型(EV71)VP1蛋白,并对重组蛋白功能进行初步鉴定。方法 PCR扩增EV71VP1全长基因,在测序正确的基础上,将其插入表达载体pET28a(+),构建表达质粒pET28a(+)/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,利用Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经ELISA和Western Blot,验证EV71VP1的抗原性。结果成功构建pET28a(+)/VP1重组质粒,经大肠杆菌表达、纯化获得分子量约为43kDa的融合蛋白,经ELISA和Western Blot,结果显示该蛋白有良好的抗原性。结论实现了肠道病毒7l型VP1蛋白的原核高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定基础。     

利用大肠埃希菌分泌表达乙型肝炎病毒核心抗原

目的:研究乙型肝炎病毒核心(C)基因在大肠埃希菌(E.coli)中的表达,以期获得分泌表达的具有良好免疫反应性和特异性的HBcAg。方法:构建重组质粒pET-3c-cAg、pET-30a-cAg、pGEX-4T-1-cAg,转入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达HBcAg。SDS-PAGE、ELISA和Western blot对表达产物进行分析。结果:限制性内切酶酶切和DNA序列分析证实HBV C基因正确克隆到E.coli各表达载体中。ELISA和Western blot分析表明,以pET-3c和pET-30a为表达载体能在E.coli分泌表达HBcAg,而以pGEX-4T-1为载体只能胞内表达,其中以pET-3c为载体的分泌表达量最高,培养上清中其效价为1∶128;用分泌表达的HBcAg作为诊断抗原检测抗-HBc阴阳性血清及国家参考品,符合率为100%。结论:成功获得HBcAg在E.coli的分泌表达,且其具有较高的特异性和免疫反应性。     

尿道致病性大肠杆菌fimA基因的克隆与表达

目的 对尿道致病性大肠杆菌(UPEC)132编码Ⅰ型菌毛的结构基因fimA进行克隆与表达,建立免疫学检测方法.方法 采用PCR方法扩增fimA基因,定向克隆pET32a载体,原核表达获得FimA重组蛋白;免疫小鼠制备FimA多克隆抗体;建立全菌ELISA方法,检测UPEC 132的Ⅰ型菌毛表型.结果 PCR扩增imA全基因,构建重组质粒pET32a-fimA,经转化构建重组菌E.coli BL21(DE3)/pET32a-fimA;经IPTG诱导表达及镍亲和层析纯化获得重组蛋白FimA;制备的FimA多克隆抗体效价≥1:51 200,Western blot显示其良好的特异性;全菌ELISA获得满意结果.结论 成功地克隆UPEC Ⅰ型菌毛的结构基因fimA,制备的多克隆抗体为UPEC的检测和致病性的研究奠定了基础.     

葡萄球菌肠毒素A基因的克隆、原核表达和鉴定

目的克隆葡萄球菌肠毒索A(SEA)基因,构建其原核表达系统,鉴定重组蛋白(rSEA)免疫原性。方法采用PCR技术,从产SEA的葡萄球菌标准菌株ATCC13565基因组DNA中扩增全长SEA基因片段,T-A克隆后测序,构建pET32a-SEA表达质粒,转化入E.coli BL21DE3宿主菌,通过IPTG诱导表达,分离、纯化及Western印迹法鉴定。结果PCR获得SEA基因片段,DNA测序结果与已报道的SEA基因序列(GenBank No:L22566,AP004828)一致,构建了pET32a-SEA表达质粒,并成功地诱导、纯化了rSEA蛋白,rSEA表达量约为细菌总蛋白的40%。结论成功克隆了SEA全长基因,构建了rSEA原核表达系统,为进一步研制SEA的单克隆抗体及诊断试剂盒奠定了基础。     

登革2型病毒B株E基因部分序列原核蛋白表达及单克隆抗体制备

目的 通过构建登革2型病毒B株E基因区1～476 bp的原核表达载体,进行原核表达,并制备单克隆抗体,为研制登革病毒诊断试剂奠定基础.方法 将登革2型病毒B株E基因序列克隆入原核表达载体pET28a(+),构建原核表达重组体pET28a(+)-E,将重组表达载体转化BL21(DE3)菌株进行原核表达.纯化后的蛋白免疫B...