缺失C8-K3片段重组天坛痘苗病毒的免疫策略研究

目的探索不同的DNA疫苗初免-重组痘苗病毒加强免疫策略的效果,为建立最佳免疫方案提供依据。方法对小鼠进行DNA疫苗初免,之后分别加强免疫一针、两针和三针重组痘苗病毒VTT△C8-K3-gag,在不同时间点采取血样及制备脾细胞,检测针对痘苗病毒和HIV特异性体液免疫及细胞免疫应答。结果三种免疫策略中,DNA疫苗初免-VTT△C8-K3-gag加强免疫两次的效果最佳,诱导的针对p55的结合抗体滴度达到106,分泌IFN-γ的T细胞数为342/106细胞。针对痘苗病毒的体液和细胞免疫应答显著低于加强免疫三针诱导的免疫反应。结论DNA疫苗初免-VTT△C8-K3-gag加强免疫两针可诱导较高水平的HIV免疫应答,同时保证了较低水平的载体免疫反应。     

以痘苗病毒为辅助病毒生产慢病毒载体的探究

目的建立新型、高产量的慢病毒衍生载体的生产体系。方法构建主框架质粒pVECRNA、包装质粒pGAGPOL及包膜质粒pVSVG。通过脂质体将这三个质粒共转染至BHK21细胞,再用含有T7RNA聚合酶基因的重组痘苗病毒vTF-3感染细胞,培养4d后,收集培养上清,0.22μm滤膜过滤。结果将培养上清进行RT-PCR反应,结果能扩增出96bp长度的目的条带,将培养上清感染BHK21细胞,检测到BHK21细胞中GFP的表达,测定病毒载体滴度为(1.45±0.30)×107tu/ml。结论已初步生产出慢病毒载体,为下一步生产系统建立,系统产量优化奠定良好基础。     

小学生接种痘苗病毒重组乙肝疫苗的现场试验

作者报告了西安市８６名易感的小学生接种痘苗病毒重组乙肝疫苗一年的效果观察结果。受试者随机分成３组。免疫剂量分别为２．０，５．０，１０．０μｇ，按０，０，６程序接种。本实验疫苗的免疫原性良好，５．０μｇ与１０．０μｇ组的抗－ＨＢｓ在免疫后３年将能保持较高水平，因此，痘苗重组乙肝疫苗以５．０或１０．０μｇ剂量免疫为宜。     

痘苗病毒真核表达载体pMJ601的转化与鉴定

目的 对痘苗病毒表达载体ｐＭＪ６０１进行转化与鉴定,为进一步实施痘苗病毒为载体的基因治疗作必要的准备。方法 利用感受态细胞的制备及转化、质粒抽提、琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶酶切等多种基因工程技术对质粒ｐＭＪ６０１进行转化及鉴定。结果 琼脂糖凝胶电泳清楚地显示了ｐＭＪ６０１质粒３条带和Ｂａｍ ＨＩ或Ｈｉｎｄ Ⅲ酶切后的线性条带。结论 痘苗病毒表达ｐＭＪ６０１的转化与鉴定,为痘苗病毒载体系统的基因治     

水泡性口膜炎病毒有望成为艾滋病疫苗的载体

耶鲁大学医学院的Rose博士最近在2001年AIDS疫苗大会上报道,一种可以表达HIV env和gag基因的减毒重组水泡性口膜炎活病毒(VSV)载体,将有望成为理想的人类AIDS疫苗载体。Rose博士利用该疫苗进行免疫接种后14个月发现,7只接种猴均未发展为AIDS,而对照组的8只猴中,有7只发展为AIDS,平均病程为     

痘苗病毒载体介导爱泼斯坦-巴尔病毒潜伏期膜蛋白2A基因转染树突状细胞对其功能的影响

目的：探讨痘苗病毒载体介导爱泼斯坦－巴尔病毒（EBV）潜伏期膜蛋白2A（LMP2A）基因转染树突状细胞（DC）对DC的表型和功能的影响，以及EBV相关肿瘤免疫治疗性疫苗的可行性，方法：用EBV－LMP2A基因重组痘苗病毒（Vac-LMP2A)转染成熟的DC，流式细胞术（FACS）检测转染前后DC表面分子CD1a,CD83,CD40,CD80,HLA-DR变化，3H－TdR掺入法检测转染前后DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖等功能的改变。结果：转染后LMP2A蛋白在DC细胞内高表达，Vac-LMP2A转染成熟DC前后对其表面共刺激分子及特征性表面标志无影响，转染后的DC仍具有较强的刺激同种异体TI林巴细胞增殖的能力。结论：痘苗病毒载体是介导外源基因LMP2A转染DC的有效载体，Vac-LMP2A转染成熟DC对DC表型和功能无明显影响，是EBV相关肿瘤如鼻咽癌免疫治疗的理想载体。     

痘苗病毒致病蛋白的研究进展

包括痘苗病毒和猴痘病毒在内的正痘病毒可引起广泛传播的人畜共患病。目前正痘病毒与宿主免疫系统相互作用的机制未明。现从痘苗病毒的结构特征、入胞机制及致病蛋白作用等方面的研究进展进行综述,以助于了解痘苗病毒等正痘病毒入侵机体后可能的免疫相关机制,为免疫治疗提供一定的理论依据。     

痘病毒疫苗载体

1798年,Jenner的发现奠定了免疫学的基础并最终导致天花病毒在地球上根除。尽管天花病毒已被消灭,在20世纪80年代仍引起一场研究痘苗病毒的高潮,其中部分原因是分子遗传学应用于对重组牛痘病毒外源基因的克隆和表达,而生物恐怖又重新引起人们对牛痘的关注。这些重组病毒在研究和疫苗学中均有多方面用途,并促进载体疫苗的发展,例如重组牛痘狂犬病疫苗在西欧及最近在美国被用来消除狂犬病;选择性的痘病毒载体,例如禽痘病毒用于非禽类动物时被证明是安全有效的非复制型载体。     

共表达HPV16L1、L2、E67蛋白的重组非复制型痘苗病毒的构建

目的：构建共表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1、L2、E67蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。方法：以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术筛选共表达HPV16L1、L2、E67蛋白的重组痘苗病毒并对其进行鉴定。结果：该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交结果表明重组病毒基因组中有L1、L2、E6、E7基因插人;经Western blot检测,重组病毒能稳定表达HPV16L1、L2、E67蛋白。结论：非复制型重组痘苗病毒NTVJE67CKL IL2可作为预防和治疗HPV16相关肿瘤及其癌前病变的候选疫苗。     

HPV58型E7基因重组痘苗疫苗保护作用的实验研究

目的：制备含人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）58型E7基因的重组痘苗病毒疫苗，并利用动物肿瘤模型观察疫苗接种效果。方法：利用PCR方法扩增HPV58 E7 DNA片段，在消除其转化活性的基础上，构建表达HPV58 E7的重组痘苗病毒疫苗并免疫小鼠，观察该疫苗对E7阳性肿瘤细胞生长的抑制作用，体外诱导、测定细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）活性。结果：经定点突变的HPV58 E7基因转化活性显著降低，用突变的E7基因构建的重组痘苗病毒免疫小鼠后，能抑制E7阳性肿瘤细胞在小鼠体内的生长并延长小鼠的生存期；免疫小鼠脾淋巴细胞体外可诱导产生针对E7阳性肿瘤的CTL细胞。结论：在消除转化活性的基础上，HPV58E7可用于治疗与HPV58感染有关的肿瘤。     

Construction of a vaccinia virus vectored multi--epitope live vaccine candidate for Plasmodium falciparum

Theemergenceandrapidspreadofdrug--resistantPlasmodiumfalciparumandinsecticide--resistantmosquitoeshaveseriouslyimpairedtheeffectivenessofthecommontoolsformalariacontrol.Theneedsforaneffectivevaccineisthusurgentandofprimeimportancetothepreventionofmalaria[lj.Inconsiderationofseveralmajorobstaclestothedevelopmentofaneffectivevaccine,especiallythevariabilityofantigensandthespecifityofstageandspecies(strain)ofmalariaparasites,thelivevaccinebasedoneukeryoticexpressionandmultiplegenesispaidattention…     

痘苗病毒弱毒株广9株对动物的致病力研究

目的了解经痘苗病毒天坛株(VTT)3次挑斑纯化筛选出的痘苗病毒减毒株广9株(VG9)的神经毒性和致病性。方法对痘苗病毒VG9和其亲代病毒VTT进行小鼠和乳鼠及家兔脑内毒力测定、裸鼠腹腔毒力测定及家兔皮内反应性实验,并观察实验动物的发病率和死亡率及皮肤坏死情况。结果两株病毒对小鼠和乳鼠的脑内毒力(icLD50)值显示,VTT株较VG9株分别强约100倍和18倍;对家兔脑内的毒力虽然icLD50值显示两株病毒相同,但VTT致家兔发病的数量较VG9多,其50%发病剂量较VG9多32倍。家兔皮内接种病毒后,较低病毒滴度(6.63 lg PFU)的VTT接种点出现严重的皮肤坏死,而VG9仅在较高滴度(7.54 lg PFU)接种点皮肤出现轻微坏死。结论通过不同途径接种几种实验动物均显示VG9的毒力较其母株VTT明显减弱。可以预测VG9痘苗在人体可能产生的不良反应较VTT痘苗低,并且有可能比VTT更适合作为痘苗病毒载体应用于新的重组疫苗(如HIV疫苗)的研发。     

犬腺病毒1型疫苗株E3缺失表达载体的构建

目的：探索以犬腺病毒1型疫苗株（Cannaught Laboratory Limited,CLL）作为病毒重组疫苗和基因转移载体的可行性。方法：构建带增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的E3缺失重组病毒CLLEGFP,将CLLEGFP感染各种人源细胞,并以灌胃,腹腔注射,尾静脉注射和肌肉注射等不同途径接种昆明小鼠,多时间点取小鼠组织标本,冷冻干燥切片,观察EGFP的表达,4周后采集小鼠血清,以Western blot分析抗EGFP抗体的产生,结果：CLLEGFP能够感染各种人源细胞并表达EGFP,在腹腔接种CLLEGFP3d的小鼠肝细胞细胞中可见转导的EGFP。Western blot分析显示,以各种途径免疫接种重组病毒4周后的小鼠血清中均存在抗EGFP特异抗体,结论：CLL具有开发成为病毒重组疫苗和苈转移载体的潜力。     

表达幽门螺杆菌过氧化氢酶的减毒沙门氏菌疫苗株的构建及其免疫保护作用的观察

目的 探讨表达幽门螺杆菌（Hp)过氧化氢酶（KatA)的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株在防御Hp感染中的作用。方法 构建表达KatA的重组质粒,用IPTG进行诱导表达,再将其转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261株中构建成口服活疫苗株,经口服免疫C57BL/6小鼠,并以Hp翻尼株进行攻击,用快速尿素酶试验和Hp定量培养对胃粘膜中的Hp进行检测。结果 SDS-PAGE凝胶电泳上显示一条相对分子质量约79000的新生蛋白带,占细菌总蛋白的19%,并能与抗谷胱甘肽-s-转移酶（GST）抗体发生特异性反应,动物实验结果显示;免疫小鼠能有效防御Hp的感染,结论 表达KatA的减毒沙门氏菌疫苗株能诱导抗Hp保护性免疫反应,有望在Hp感染及其相关性疾病的防治中发挥积极作用。     

提高重组腺病毒载体提纯和滴定效率的研究

目的探讨提取、纯化和滴定重组腺病毒表达载体的有效方法.方法将已用含报告基因β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的重组5型腺病毒载体(Ad5CMVLacZ)转染的人胚肾293细胞从-70℃转移至37℃,反复冻融使细胞发生破溃,病毒从细胞内释放至上清液.在上清液中加入氯化铯,进行密度梯度超速离心,收集和透析病毒液,用空斑形成实验确定病毒的滴度.结果经提取和纯化的Ad5CMVLacZ病毒液清晰无色,用系列稀释法将其配制成10-2～10-13的稀释度,分别转染100%汇合的293细胞,连续追踪观察空斑的形成及其数目变化,直至转染后第10天,10-10稀释度的空斑数不再增加为止,计数其空斑,从而确定出mL病毒的滴度,即空斑形成单位(pfu),最终测定得到的结果是3.0×1010pfu/mL.结论用上述方法能制备出优质的重组腺病毒载体,后者足以达到对中枢神经系统损伤和疾病进行基因治疗的要求.     

靶向树突状细胞的肿瘤疫苗OVA慢病毒载体构建及其体外抗肿瘤效应

目的构建靶向树突状细胞(dendritic cell,DC)的肿瘤疫苗pHR-CMV-EGFP-OVA慢病毒表达载体,并观察肿瘤抗原特异性DC激活T细胞对小鼠Lewis肺癌细胞(lewis lung carcinoma cell,LLC)的抗肿瘤效应,为肺癌的临床治疗提供实验依据。方法以分子克隆方法构建携带模拟肿瘤抗原鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)的慢病毒表达载体,经XhoⅠ及XbaⅠ双酶切后电泳和DNA测序验证;应用脂质体法三质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,转导LLC,进行单克隆化筛选培养后,经RT-PCR、Western blot检测所获得的OVA稳定表达细胞株中OVA的表达;分离纯化小鼠骨髓DC;用慢病毒感染DC;分离纯化小鼠脾T淋巴细胞;应用MLR和MTT法检测肿瘤抗原负载的DC刺激T淋巴细胞对LLC的杀伤作用。结果 (1)构建的pHR-CMV-EGFP-OVA慢病毒表达载体经酶切后电泳和DNA测序,结果显示载体构建正确;(2)获得了纯化的小鼠骨髓来源的DC;(3)获得了携带肿瘤抗原OVA的LLC和DC;(4)负载肿瘤抗原的DC刺激T淋巴细胞能有效地杀伤负载相同肿瘤抗原的LLC。结论本研究成功地构建了携带肿瘤模拟抗原OVA的慢病毒表达载体pHR-CMV-EGFP-OVA,并成功地转导LLC与DC,获得了稳定表达OVA的肺癌细胞株和携带OVA的DC,基于肿瘤抗原靶向DC的抗肿瘤策略能有效地杀伤LLC,为靶向DC的肺癌免疫治疗提供了体外实验依据。     

接种麻腮风联合减毒活疫苗引起一例病毒性脑炎的调查分析

接种疫苗是预防、控制针对传染病的有效措施，但是任何一种疫苗都不是绝对安全的，极个别人在获得免疫的同时，会发生一些除正常反应之外的预防接种异常反应。本文报告接种麻腮风减毒活疫苗引起病毒性脑炎病例比较罕见，由此提示我们接种任何疫苗都应考虑到不良反应的存在，特别是少见或罕见反应，接种人员必须引起足够的重视，掌握预防接种不良反应的知识，切实落实预诊、告知制度。     

变形链球菌亚单位疫苗SBR制备及经颌下腺免疫小鼠的抗体应答

目的:探讨变形链球菌(S.mutans)唾液结合区段(SBR)作为亚单位防龋疫苗的免疫原性,并评价经涎腺接种诱导有效免疫应答的可行性。方法:构建含S.mutansSBR基因的重组原核表达质粒pTriEx-4-SBR,用该质粒转化大肠杆菌E.coliJM109DE3,培养转化后的E.coli并诱导其表达SBR蛋白;以SBR蛋白作为亚单位防龋疫苗经颌下腺免疫BALBC小鼠,ELISA检测特异性抗体指标。结果:纯化得到的SBR蛋白与预期相符;ELISA结果表明,SBR蛋白经颌下腺免疫小鼠能够诱导血清抗SBR特异IgG(P<0.01)、唾液抗SBR特异IgGP<0.01、唾液抗SBR特异IgAP<0.01显著应答。结论:本实验所表达及纯化的SBR蛋白经涎腺接种途径可诱导明显的免疫应答。     

吉安市特定人群冻干风疹减毒活疫苗接种反应及免疫效果观察

目的了解江西省吉安市幼儿和育龄期妇女的风疹抗体水平及免疫后效果。方法接种风疹疫苗和采用风疹血凝抑制试验检测风疹血凝抗体(HI)。结果儿童和育龄妇女的自然感染率分别为5.19%和75.13%,接种风疹疫苗后无不良反应,儿童组抗体全部转为阳性,育龄妇女仅1例为阴性,几何平均滴度增高,接种疫苗后显著提升抗体水平。结论吉安市存在着较大数量的易感人群,有可能发生大规模的风疹流行,其中24.77%育龄妇女存在感染风疹导致CRS的可能;国产风疹病毒减毒株(BRDⅡ株)疫苗免疫原性效果较好,安全性高,适用于老区等经济相对落后的地方大范围内推广使用。吉安市防治风疹的免疫策略具体是,首先对1～14岁人群进行普及免疫,同时对育龄期妇女进行选择性免疫,随后将风疹的免疫纳入计划免疫管理。