核外p53通过AMPK/mTOR信号抑制自噬并促进热打击诱导的血管内皮细胞损伤

目的 阐明核外p53通过调控蛋白激酶（AMPK）/雷帕霉素靶体（mTOR）信号通路介导自噬抑制在热打击后血管内皮细胞（VECs）损伤的分子机制。方法 实验分为：对照组、热打击组、热打击组+Compound C组、热打击组+rapamycin组、热打击组+PFT组,并分别使用AMPK抑制剂Compound C、mTOR抑制剂（自噬激活剂）rapamycin、p53线粒体转位抑制剂PFT预处理细胞或C57BL/6小鼠,通过CCK8法检测细胞活力,Western blot观察p53线粒体移位、自噬关键蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62以及AMPK/mTOR信号通路的激活情况,HE染色观察各组小鼠主动内皮血管病理改变,TUNEL染色观察各组小鼠动内皮血管凋亡情况。结果 与对照组相比,热打击后主动脉内皮细胞（MAECs）活力显著下降（P<0.05）,热打击后小鼠主动脉血管内皮细胞肿胀、脱落,内弹力膜断裂,平滑肌排列紊乱,可见大量凋亡细胞;热打击后随着复温时间（0、3、6、9 h）延长,MAECs胞浆中p53表达逐渐减弱,而线粒体p53表达逐渐增强;热打击后（6 h）LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达被抑制,p62蛋白表达增加（P<0.05）;热打击后（6 h）AMPK的磷酸化被抑制,mTOR、4EBP1和p70S6K的磷酸化表达增加（P<0.05）。AMPK抑制剂Compound C明显抑制了热打击后MAECs中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达,促进了p62蛋白表达,并加重了热打击后小鼠主动脉血管的损伤以及促进了凋亡的增加,而mTOR抑制剂rapamycin均呈现相反作用。p53线粒体转位抑制剂PFT促进了AMPK的磷酸化激活,并抑制mTOR、4EBP1和p70S6K的磷酸化（P<0.05）;使用PFT后促进了LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达,抑制了P62的表达（P<0.05）;使 用PFT后明显提高了MAECs的细胞活力（P<0.05）,也减轻了热打击后小鼠主动脉血管的损伤和凋亡的发生。结论 核外p53主要通过抑制AMPK活性,激活mTOR信号,继而介导细胞自噬抑制,参与热打击诱导的MAECs损伤。     

基于AKT/mTOR信号通路探讨复方七芍降压片治疗自发性高血压大鼠的作用机制

目的探讨复方七芍降压片通过调控蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对自发性高血压(SHR)大鼠血压、炎症因子及胸主动脉自噬相关蛋白表达的影响。方法 SHR大鼠30只,随机分为模型组、厄贝沙坦片组(27 mg/kg)、复方七芍降压片组(1.73 g/kg),连续给药6周,另设10只WKY大鼠为正常组,灌胃生理盐水。分别在给药前及给药1、2、3、4、5、6周,测量各组大鼠尾动脉血压。给药6周后取材,电镜观察胸主动脉超微结构及自噬情况;ELISA法检测血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)水平;免疫组化法检测胸主动脉中Beclin-1、Bcl-2、AKT、mTOR蛋白表达;Western-blot检测胸主动脉中Beclin-1、Bcl-2蛋白表达。结果与正常组比较,模型组大鼠血清IL-1β、IL-6水平升高(P0.01);胸主动脉Bcl-2、AKT、mTOR蛋白表达升高(P0.01或P0.05),Beclin-1表达降低(P0.01),且未见明显的自噬体结构。与模型组比较,复方七芍降压片组大鼠各周血压均降低(P0.01);血清IL-1β、IL-6水平降低(P0.05);胸主动脉中AKT、mTOR蛋白表达均降低(P0.05),Beclin-1表达升高(P0.05),且可见明显的自噬体结构。结论复方七芍降压片能够降低SHR大鼠血压,其机制可能与抑制胸主动脉中自噬相关信号通路蛋白AKT、mTOR的表达,促进主动脉自噬,改善炎症反应有关。     

天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠p38 MAPK/HSP27通路影响的研究

目的 探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)/热休克蛋白27(HSP27)通路在天麻钩藤饮干预自发性高血压大鼠(SHR)中的作用机制。方法 将30只SHR按随机数字表法分为模型组、缬沙坦组(0.03 g/kg)和天麻钩藤饮组(1 g/kg),每组各10只，WKY大鼠10只为正常组，缬沙坦组和天麻钩藤饮组大鼠分别给予相应药物灌胃，正常组与模型组大鼠灌胃等量生理盐水，连续8周。测量第0、14、28、42、56天各组大鼠的血压；给药结束后，观察各组大鼠的行为学变化；采用苏木精-伊红染色法观察血管形态结构变化，天狼星红染色法观察血管纤维化程度；采用电子显微镜观察细胞自噬超微结构；采用免疫荧光法检测血管组织中磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)和磷酸化HSP27(p-HSP27)的平均荧光强度；采用分光光度法检测血浆丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和血管组织抗超氧阴离子的含量；采用β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法观察血管衰老改变；采用实时荧光PCR法检测血管组织中p38 MAPK、MAP激酶活化蛋白激酶-2(MAPKAPK-2)、HSP27、自噬相关蛋白5(...     

天麻钩藤饮对肾血管性高血压大鼠醛固酮和血管紧张素Ⅱ的影响

目的：观察天麻钩藤饮对肾血管性高血压大鼠醛固酮（aldosterone,ALDO）和血管紧张素Ⅱ（angiotension Ⅱ,AngⅡ）的影响。方法：将48只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、卡托普利组和天麻钩藤饮组,每组12只。模型复制后第5周开始给药,连续治疗8周。然后观察各组大鼠左室质量（left ventricular mass,LVM）、左室质量指数（lef tventrieular mass index,LVI）和心肌组织胶原（colloid,Coll）浓度,同时检测各组大鼠血浆和心肌组织中AngⅡ和ALDO水平。结果：12周后模型组大鼠的LVM、LVI和Coll均明显高于假手术组（P〈0．05,P〈0．01）;卡托普利组和天麻钩藤饮组大鼠的上述指标均有显著降低（P〈0．01）,而两药之间没有显著性差异（P〉0．05）。模型复制12周后,模型组大鼠血浆和心肌ALD0和AngⅡ水平显著高于假手术组（P〈0．01）;卡托普利显著降低血浆和心肌AngⅡ水平（P〈0．05）,而对血浆和心肌ALD0水平则无显著性影响（P〉0．05）;天麻钩藤饮则同时降低了血浆和心肌ALD0和AngⅡ水平（P〈0．05,P〈0．01）。结论：天麻钩藤饮能够缓解和逆转左室肥厚和心肌纤维化,其作用可能与降低血浆和心肌局部ALDO、AngⅡ水平有关。     

葛根素通过AMPK-mTOR通路激活自噬改善大鼠激素性股骨头坏死的研究

目的 探讨葛根素通过自噬信号通路对激素性股骨头坏死早期血管内皮细胞自噬的干预作用。方法 48只雄性SD大鼠随机分成4组（每组12只）。对照组：单纯肌肉注射生理盐水，2ml/只/次，共3次，间隔24h；模型组：肌肉注射甲基强的松龙，20mg/kg共3次，间隔24h。葛根素干预组：同模型组方法造模，在最后一次臀肌注射完甲基强的松龙后给予葛根素（100mg/kg?d)腹腔注射。雷帕霉素干预组：同模型组方法造模，在最后一次臀肌注射完甲基强的松龙后同时给予雷帕霉素（1.2mg/kg?d，自噬特异性激动剂)腹腔注射。造模后二周、四周后处死实验动物，取出双侧后肢的股骨头及主要供血血管。HE染色光镜下观察股骨头坏死情况；利用免疫组化法和RT-PCR方法检测Beclin1、LC3、P62、AMPK,mTOR和ULK1的mRNA与蛋白的表达；采用ELISA法检测血管内皮损伤标记物6-keto-PGF1a的表达。结果 与对照组比较，模型组大鼠骨细胞坏死加重，血管内皮细胞6-keto-PGF1a的表达增加（P<0.05），血管内皮细胞中自噬相关蛋白AMPK、ULK1、Beclin1、LC3表达降低（P<0.05）、mTOR、P62表达增高（P<0.05）；与模型组比较，葛根素干预组大鼠的骨坏死程度明显改善，6-keto-PGF1a的表达降低（P<0.05），自噬相关蛋白AMPK、ULK1、Beclin1、LC3表达增高（P<0.05）、mTOR、P62表达降低（P<0.05）。结论 葛根素可能通过AMPK-mTOR-Ulk1 信号通路激活血管内皮细胞的自噬，从而减轻激素所造成的股骨头坏死。     

天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠心脏Bax及Caspase-3蛋白表达的影响

[目的] 探讨天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠(SHR)的降压机制及对心肌组织B细胞淋巴瘤-2基因相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达的影响。[方法] 20只14周龄自发性高血压大鼠(SHR)随机分为空白组6只、中药组7只、西药组7只。中药组灌服天麻钩藤饮20 mL/(kg·d),相当生药20g/(kg·d).西药组灌服雷米普利1 mg/(kg·d).空白组灌服同体积的纯净水。连续灌胃4周。分别于给药0、1、2、3、4周测量血压和心率。给药4周后,腹主动脉取血处死,用酶联免疫吸附实验法测定血清血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)含量,用Western blot方法检测心肌组织Bax及Caspase-3蛋白表达。[结果] 1)从给药3周后开始,与空白组比较,天麻钩藤饮能明显降低收缩压(P<0.05,P<0.01).天麻钩藤饮降压效果虽没有西药明显,但整体上能控制收缩压的升高,并有逐渐降低的趋势。2)天麻钩藤饮和西药雷米普利对心率的变化均没有明显影响。3)与空白组比较,天麻钩藤饮和西药均能明显降低血清的AngⅡ和ALD含量(P<0.01).4)与空白组比较,天麻钩藤饮和西药均能明显降低心肌组织的Bax、Caspase-3蛋白表达(P<0.01).[结论] 天麻钩藤饮能有效控制SHR大鼠收缩压的升高。天麻钩藤饮的降压机制可能与降低AngⅡ和ALD含量有关,并且还可能通过减少Bax、Caspase-3蛋白表达来抑制心肌细胞的凋亡,实现对心肌细胞的保护功能。     

芹菜素通过AMPK/mTOR通路调控肺癌A549细胞自噬

目的 探讨芹菜素（APG）对肺癌A549细胞增殖及自噬的影响及其与AMPK/mTOR通路的关系。方法 体外培养肺癌A549细胞,采用CCK-8法检测不同浓度芹菜素处理A549细胞不同时间后对细胞增殖的影响。后续实验分为空白对照组(0 μmol/L APG),低、中、高浓度实验组和抑制剂组5组,采用MDC染色法检测各组对细胞自噬的影响,免疫印迹法检测自噬相关蛋白以及AMPK/mTOR通路相关蛋白表达情况。结果 芹菜素可显著抑制A549细胞增殖,且呈浓度依赖性（P<0.05）;20、40、80 μmol/L芹菜素组随作用时间延长,对A549细胞的增殖抑制率逐渐增加,呈时间依赖关系（P<0.05）。与空白对照组比较,实验组A549细胞中含高亮点状荧光的自噬小泡数量及IOD值逐渐增加（P<0.05）,芹菜素可浓度依赖性上调LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p-AMPKα蛋白表达水平及p-AMPKα/AMPKα比值（P<0.05）,下调p-mTOR、p62蛋白表达水平及p-mTOR/mTOR比值（P<0.05）。与高浓度实验组比较,抑制剂组细胞中含高亮点状荧光的自噬小泡减少,IOD值下降,LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p-AMPKα蛋白表达水平及p-AMPKα/AMPKα比值降低,而P62、p-mTOR蛋白表达水平及p-mTOR/mTOR比值升高（P<0.05）。结论 芹菜素能抑制肺癌A549细胞增殖,诱导其自噬,作用机制可能与AMPK/mTOR通路有关     

脑缺血再灌注不同时间对大鼠海马神经元自噬及PI3K/mTOR通路的影响

目的：探讨脑缺血再灌注不同时间对大鼠海马神经元自噬及PI3K/mTOR通路的影响。方法：72只大鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注组（分别再灌0、6、12、24、36 h）,每组12只。采用四血管阻断法建立大鼠全脑缺血再灌注损伤模型。神经功能缺损评分评价大鼠海马神经功能,HE染色检测大鼠海马神经细胞损伤,透射电镜下观察海马神经元内自噬小体,Western blot检测Beclin-1、LC3 II、p62、p-PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白表达。结果：与假手术组比,随着脑缺血再灌注的时间延长,脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损评分、脑梗死面积、自噬小体数量均增加（均P＜0.05）;随着脑缺血再灌注的时间延长,大鼠海马组织自噬相关蛋白Beclin-1和LC3 II表达显著上调、p62表达下调（P＜0.05）;PI3K/mTOR通路相关蛋白p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表达显著下调（P＜0.05）。结论：脑缺血再灌注可增强大鼠海马神经元自噬,抑制PI3K/mTOR信号通路。     

银杏内酯K调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨银杏内酯K（GK）调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响。方法 取对数生长期的MCF-7细胞,设置分组为对照组、GK低浓度（GK-L,12.5 μg/mL）组、GK中浓度（GK-M,25 μg/mL）组、GK高浓度（GK-H,50 μg/mL）组、GK-H+AMPK抑制剂（Compound C,50 μg/mL GK+50 μmol/L Compound C）组。观察各组细胞形态以及细胞增殖、凋亡、自噬状况并分析自噬相关基因LC3、P62、Beclin1 mRNA表达以及AMPK、p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、LC3、P62、Beclin1表达。结果 与对照组相比,GK-L、GK-M、GK-H组细胞自噬泡数量增多,增殖率、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、p62表达显著下降,凋亡率、LC3、Beclin1表达、AMPK蛋白表达显著增加（P＜0.05）;与GK-H组相比,GK-H+Compound C组细胞自噬泡数量减少,增殖率、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、p62显著增加,凋亡率、LC3、Beclin1表达、AMPK蛋白表达显著降低（P＜0.05）。结论 GK可以诱导乳腺癌细胞自噬和凋亡、抑制其增殖,可能与激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路有关     

Apelin-13对急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺组织中自噬的影响

目的探讨Apelin-13对大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)时自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1的影响。方法取健康清洁SD大鼠54只,随机分为对照组、造模组、给药组,每组18只。每组大鼠分别对应处理后第3、6、12 h检测血清淀粉酶,并取部分胰腺组织做常规病理切片、HE染色观察其病理变化,Western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1的表达情况。结果造模组各时间点血清淀粉酶、LC3-Ⅱ、Beclin-1表达水平较对照组显著提高,给药组各时间点血清淀粉酶、LC3-Ⅱ、Beclin-1表达较造模组显著降低(P均＜0.05),ANP时自噬相关蛋白表达会随着病理损伤程度加重而增加,且Apelin-13可以显著抑制自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达。结论Apelin-13在ANP中通过下调自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达发挥对胰腺组织的保护作用。     

天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠心肌纤维化的影响

[目的]研究天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠(SHR)心肌纤维化的影响及可能的作用机制.[方法]将24只8周龄SHR随机分成3组:即天麻钩藤饮组(剂量为20 g/kg)、卡托普利阳性对照组(剂量为100mg/kg)及高血压模型组(SHR组),并设正常对照组(同周龄正常血压大鼠8只),实验期24周.比较各组收缩压、左室质量(mLV)及左室质量指数(WLV)、心肌胶原含量,并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测心肌胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的表达.[结果]天麻钩藤饮可显著降低SHR收缩压、mLV及wLV、心肌胶原含量及心肌组织中IGF-1表达水平(P<0.01).[结论]天麻钩藤饮可降低血压,抑制左室肥厚及心肌纤维化,其机制可能与减少心肌组织IGF-1表达有关.     

BQ-123 对蛛网膜下腔出血大鼠神经功能的保护作用研究

目的 探讨BQ-123 对蛛网膜下腔出血（SAH）的治疗作用及其机制。方法 160 只雄性SD 大鼠,随机分为假手术（Sham）组、SAH 组、雷帕霉素组、低剂量BQ-123 组、高剂量BQ-123 组。2 次 注血法复制SAH 大鼠模型;光镜观察海马区形态结构变化;免疫组织化学法检测海马区雷帕霉素靶蛋白 （mTOR）、自噬相关基因Beclin-1 和微管相关蛋白1 轻链（LC3）- Ⅱ的表达;实时逆转录聚合酶链反应 （real-time RT-PCR）检测mTOR、Beclin-1 和LC3 的mRNA 表达;抓力测定实验评价各时间点大鼠前肢 拉力情况;穿梭箱实验测试动物的学习功能。结果 与Sham 组比较,SAH 组海马区mTOR、Beclin-1 和 LC3 mRNA 表达增加,存活神经元细胞数量减少,大鼠的学习功能和拉力值下降,差异有统计学意义（P < 0.05）;与SAH 组比较,雷帕霉素组海马区mTOR mRNA 表达降低、Beclin-1 和LC3 mRNA 表达增高,存活神经元细 胞数量增多,大鼠的学习功能和拉力值改善,差异有统计学意义（P <0.05）;与SAH 组比较,BQ-123 组海马区 mTOR mRNA 降低、Beclin-1 和LC3 mRNA 表达增高,存活神经元细胞数量增多,动物学习功能指标和拉力值 改善,差异有统计学意义（P <0.05）,且上述变化在高剂量BQ-123 更为明显。结论 BQ-123 可改善SAH 大鼠 神经功能缺陷,抑制mTOR 激活,从而提高海马区神经细胞自噬程度。     

自发性高血压大鼠代谢物轮廓分析及天麻钩藤饮干预研究

目的：观察自发性高血压大鼠（SHR）血压、血清儿茶酚胺水平、尿液代谢物的改变及天麻钩藤饮的影响,并初步探讨其降压机制。方法：12周龄正常大鼠10只作为空白对照,同周龄雄性SHR大鼠20只随机分为SHR对照组、天麻钩藤饮组。采用尾动脉搏动法测量血压值、酶联免疫法（ELISA）检测用药前后各组大鼠血清儿茶酚胺的变化、气相色谱一质谱联用法检测大鼠尿液代谢物。结论：三组大鼠尿液代谢物没有明显不同,天麻钩藤饮对尿液代谢物无明显影响,但天麻钩藤饮具有一定的降低大鼠血压及明显降低血清儿茶酚胺浓度的作用。     

天麻钩藤饮联合福辛普利对H型高血压阴虚阳亢证患者的影响

目的：探讨天麻钩藤饮联合福辛普利对H型高血压阴虚阳亢证患者的影响。方法：将120例H型高血压阴虚阳亢证患者随机分为A组60例,服用天麻钩藤饮和福辛普利片;B组60例,服用福辛普利及叶酸片。4周为1疗程。检测治疗前后患者的血压、血清同型半胱氨酸及症状改善情况。结果：经治疗后两组患者血清同型半胱氨酸的浓度无显著性差异。A组降压疗效及症状疗效均优于B组,具有统计学意义。结论：天麻钩藤饮联合福辛普利组降低高同型半胱氨酸血症具有与B组同样的干预作用,但在改善临床症状等方面,疗效优于B组。     

天麻舒心方对自发性高血压大鼠动脉管壁形态、AngⅡ、Ang(1-7)的影响

【目的】观察天麻舒心方对自发性高血压大鼠(SHR)动脉管壁形态及血浆和肠系膜动脉组织中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、血管紧张素1-7[Ang(1-7)]含量的影响。【方法】将75只SHR大鼠随机分为模型对照组,西药对照组,中药高、中、低剂量组,每组15只;另将16只Wistar大鼠设为正常对照组。中药高、中、低剂量组给予天麻舒心浸膏液(分别对应剂量为11.16、5.58、2.79 g·kg^-1·d^-1)灌胃;西药对照组给予氯沙坦钾混悬液(剂量为17.5 mg·kg^-1·d^-1)灌胃;模型对照组及正常对照组给予同体积蒸馏水灌胃。共18周。期间给予动态血压监测。给药结束后,采用苏木素-伊红(HE)染色观察肠系膜动脉形态学变化,125I放射免疫分析法测定血浆及血管组织的AngⅡ、Ang(1-7)水平。【结果】给药前,模型对照组血压水平高于正常对照组(P<0.01);给药2周后,中药高、中剂量组及西药对照组血压均显著低于模型组(P<0.01),给药14周后,各中药组及西药对照组血压均显著低于模型组(P<0.01)。SHR肠系膜动脉形态学明显改变;而各中药组及西药对照组可明显改善SHR肠系膜动脉形态学变化。与正常对照组比较,模型对照组血浆和血管AngⅡ水平显著增高(P<0.01),血浆和血管Ang(1-7)水平均显著降低(P<0.05或P<0.01);与模型对照组比较,各中药组及西药对照组血浆及血管局部AngⅡ水平均无显著差异(P>0.05),中药高、中剂量组血浆Ang(1-7)显著升高(P<0.01),各中药组及西药对照组血管局部Ang(1-7)均显著升高(P<0.05或P<0.01)。【结论】SHR大鼠存在血管重塑。组织局部AngⅡ增高可能是高血压阻力血管重塑的可能机制之一。天麻舒心方可能通过增加整体及阻力血管局部Ang(1-7)发挥降低血压、改善SHR阻力血管富营养重塑的作用。     

天麻钩藤饮加减方联合硝苯地平缓释片治疗高血压临床疗效观察

目的观察天麻钩藤饮加减方联合硝苯地平缓释片治疗高血压的临床疗效。方法 75例高血压患者经中医辨证均为肝阳上亢型,随机分为治疗组38例和对照组37例。两组均给予硝苯地平缓释片,每次20 mg,2次·d-1。治疗组同时给予天麻钩藤饮加减方,水煎服,1剂·d-1。两组均治疗8周,8周后观察疗效。结果治疗组总有效率为94.7%(36/38),明显高于对照组总有效率83.8%(31/37)(P0.05);治疗后治疗组收缩压和舒张压分别为(129.8±4.3)mm Hg和(84.9±4.7)mm Hg,较治疗前明显降低(P0.05);治疗后对照组收缩压和舒张压与治疗前比较虽下降但差异无统计学意义(P0.05)。结论天麻钩藤饮加减方联合硝苯地平缓释片治疗肝阳上亢型高血压,降压效果明显,能显著改善高血压引起的相关症状,安全性高,适合临床推广。