荧光探针结合区序列突变对HBV DNA检测的影响

目的探讨标本荧光探针结合区序列突变对荧光定量PCR检测HBV DNA的影响。方法采用3种国产荧光定量PCR试剂对200例标本进行平行检测HBV DNA,分析3种试剂检测结果的差异,并对6例3种试剂检测结果无差异的标本和6例达安试剂检测结果明显降低或漏检标本进行测序。结果 3种试剂检测结果相差30倍以上的标本47例,且3种试剂均有不同程度的漏检;6例3种试剂检测结果无差异的标本荧光探针结合区序列无突变,6例达安试剂检测结果明显降低或漏检的标本荧光探针结合区序列均有突变。结论标本荧光探针结合区序列突变是造成达安试剂检测HBV DNA结果明显降低或漏检的原因。     

无偿献血者HBsAg阴性HBV DNA阳性标本的病毒载量及基因型分析

目的 分析邯郸地区核酸检测无偿献血者低病毒载量HBV DNA标本的血清学及基因型情况。方法 选取邯郸市中心血站2020年1—8月乙肝病毒表面抗原(HBsAg)阴性或单试剂阳性合并华益美核酸检测(nucleic acid testing, NAT)阳性的献血者标本,经罗氏核酸定性检测为HBV DNA阳性的标本,对其进行化学发光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay, CLIA)、核酸定量及基因型测序试验,并对其血清学及基因型进行分析。结果 77 351份献血者标本中,定性检测HBV DNA阳性28份,核酸定量检测数值<5～1 371.00 IU/ml,其中25份<100 IU/ml,占89.29%。基因型分布：C型18份,占64.29%;B型5份,占17.86%;未定型5份,占17.86%。6份血清学检测全阴性的窗口期标本中,C型5份;22份隐匿性乙肝病毒感染(occult hepatitis B infection, OBI)标本中,C型13份、B型5份。结论 邯郸地区无偿献血者核酸检测HBV DNA标本大多呈病毒低水平复制,且基因型以C型和...     

国产荧光定量PCR与COBAS Amplicor检测HBV DNA的结果比较

目的比较国产实时荧光定量PCR（FQ PCR）试剂与罗氏COBAS Amplicor方法检测乙型肝炎病毒（HBV）DNA的结果。方法据COBAS Amplicor 的FQ PCR试剂（A）的检测结果,抽取151份慢性乙型肝炎（慢乙肝）血清标本,采用两种国产实时FQ PCR试剂B、C对血清标本进行HBV DNA平行检测,以分析国产试剂的敏感度、特异度及与试剂A的相关性。结果试剂A、B、C测得的HBV DNA结果分别为（5.87±1.64）、（5.11±1.34）、（4.93±1.35）log10?copies/mL,试剂B、C与试剂A的相关系数分别为0.947、0.937。3种试剂检测结果总体差异有统计学意义（P＜0.05）,试剂B、C与试剂A检测结果相比差异有统计学意义（P＜0.05）。低HBV载量标本,试剂B、C与试剂A相关性较低。以试剂A为准,总体灵敏度、特异度分别为试剂B 90.4％、56.3%,试剂C 77.0%、100%。结论试剂B、C与试剂A在检测HBV DNA方面有较好一致性,但在低HBV载量时可靠性较低。试剂B灵敏度高,试剂C特异度高。     

两种HBV—DNA核酸提取法对荧光定量PCR结果的影响

目的比较免核酸提取法与煮沸裂解法对HBV—DNA提取后荧光定量PCR检测结果的影响。方法用两种前处理方法不同的试剂盒检测7．0×102～7．0×107IU／ml的HBV—DNA阳性标准品和84例临床小三阳患者血清,对结果进行重复性、相关性分析。并计算两种方法对低浓度HBV—DNA值的阳性检出率。结果阳性标准品HBV—DNA浓度大于103IU／ml样本的均值两种方法比较,相关性良好（线性相关,r=0．993）,CV比较发现,免核酸提取比煮沸裂解的CV要小。临床小三阳患者84例HBV—DNA浓度在1酽～103IU／ml的标本,免核酸提取法阳性检出率为25％高于煮沸裂解法的11．9％（P=0．015）。结论免核酸提取法操作简单,结果稳定可靠,线性范围宽,有益于乙肝病毒感染窗口期的早期诊断。     

临床研究3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙型肝炎患者血清中HBV DNA的比较

目的 比较3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒(HBV) DNA的灵敏度和特异度,初步探讨其用于HBV DNA检测的临床价值.方法 用3种免核酸提取PCR试剂盒分别检测30例慢性乙型肝炎患者及30例阴性参比血清标本中的HBV DNA,以荧光定量PCR结果为标准,比较3种试剂检测灵敏度和特异度.结果 3种试剂盒的HBV DNA阳性检出率分别为93.3%(28/30)、96.7%(29/30)、100%(30/30);3种试剂检测HBV阴性的特异度均为100%;3种试剂检测灵敏度A公司为103 IU/mL,B、C公司均为102 IU/mL.结论 使用免核酸提取PCR试剂检测HBV快速、简便、高效,可用于临床HBV DNA快速检测.     

不同ELISA试剂HBsAg阳性反应献血者样品的PCR检测与分析

目的探讨ELISA法筛查呈HBsAg阳性反应样品与PCR检测HBV DNA结果的相关性。方法分别采用2家国产和1家进口HBsAg ELISA试剂对无偿献血者血液标本作平行检测,并判定其最低检出量;所有ELISA试验呈HBsAg阳性反应的样品,采用荧光PCR扩增HBV DNA作重复验证。结果34724份献血者样品中,3种ELISA试剂共检出HBsAg阳性者236份,其中国产试剂A为201份,国产试剂B为156份,进口试剂C为131份,而3种试剂均为阳性者121份,不同ELISA试剂对相同样品的检测结果存在差异。定值质控血清检测表明,进口试剂C的最低检出量为0.0625ng/ml,而2种国产试剂的最低检出量则均为0.5ng/ml。结论不同ELISA试剂在献血者血液HBsAg筛查试验中表现了不同的敏感性和特异性,其中进口ELISA试剂的检测结果与PCR检测具有较好的相关性,而国产试剂与PCR检测的阳性吻合度较低。     

新型HBV-DNA实时荧光定量PCR试剂盒的应用

目的:观察新型HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒的临床应用价值。方法:采用荧光定量PCR检测法,用10份正常血清、10份HBV高滴度(106 IU/ml)血清和梯度稀释的HBV克隆质粒标准品,验证该试剂盒检测结果的重复性、特异性和灵敏度;并将该10份HBV高滴度(106 IU/ml)血清结果与同时用传统方法所测结果进行配对检验。结果:10份正常血清标本均无假阳性HBV-DNA检测结果,特异性极好;灵敏度可达到103 IU/ml,重复性和准确性两者之间差异无显著性(t=1.15,P>0.05)。结论:该方法特异性和灵敏度高,方便、快捷,可替代传统试剂盒用于HBV的临床检测和科学研究。     

全自动多重检测试剂同时检测HBV DNA、HCV RNA和HIV-1 RNA

目的 寻找一种有效实用的全自动多重检测试剂同时检测HBV DNA，HCV RNA和HIV-1 RNA系统MPLC-COBAS。方法笔者采用ACR OMETRIX公司的NAC^TM HBV DNA。HCV RNA及HIV-1 RNA核酸对照品，卫生部临床检验中心的HBV DNA，HCV RNA质控对照品，检测该系统的灵敏度；同时采用我中心酶免法(ELISA)初筛检结果阳性，经中和实验确认HBsAg阳性标本10份，经RIBA确认抗-HCV阳性标本3份。经Western Blot确认抗-HIV阳性标本3份，检测该系统的阳性符合率；检测大量临床ELISA筛检结果为阴性的标本来检测其特异性，并且每次实验设立内对照，阴阳性对照以进行临床标本检测。结果该系统的检测灵敏度(95％可信限)为HBV病毒为24-60IU／mL，HCV病毒为78-125IU／mL，HIV-1 RNA病毒为45-67IU／mL。阳性符合率为100％，假阳性率为0.13％。结论全自动多重检测试剂同时检测HBV DNA。HCV RNA和HIV-1 RNA系统MPLC-COBAS用于检测临床标本是有效实用的，可进一步加大临床标本检测数量，将该系统更好地用于酶联阴性结果的大规模筛查。     

Taqman荧光定量PCR是核酸水平对管家基因GAPDH进行定量的好方法

目的比较Taqman荧光定量PCR法、SYBR Green I荧光定量PCR法和普通PCR法制作3-磷酸甘油醛(GAPDH)标准曲线的检出下限、线性范围的差异,确定一种较好的GAPDH绝对定量方法。方法构建含GAPDH全长的质粒,经PCR和EcoR I限制性酶切鉴定确认后,紫外定量并连续稀释10倍作为标准品。分别用Taqman法和SYBR Green I法于荧光定量PCR仪上制作标准曲线,同时用普通PCR结合琼脂糖凝胶电泳利用Quantity One软件定量并制作标准曲线。结果Taqman法检出GAPDH的下限为2.0×104拷贝,线性范围:2.0×104~2.0×1010拷贝;SYBR Green I法检出GAPDH的下限为2.0×107拷贝,线性范围:2.0×107~2.0×1010拷贝;普通PCR检出GAPDH的下限为2.0×106拷贝,线性范围:2.0×107~2.0×109拷贝。结论Taqman荧光定量PCR法比SYBR Green I荧光定量PCR法和普通PCR法的灵敏度高,线性范围宽,是核酸水平对GAPDH定量的好方法。     

荧光定量聚合酶链反应检测乙肝病毒DNA的临床意义

目的　研究荧光定量聚合酶链反应 (FQ -PCR)检测血清中乙型肝炎病毒 (HBV)DNA的临床意义。方法　用FQ -PCR诊断试剂盒 ,以完全闭管式的PCR和荧光探针技术相结合所产生的实时检测定量PCR方法 ,检测了 489份临床血清标本。结果　 132例HBsAg、HBeAg、抗 -HBc均阳性的标本 ,HBVDNA也全部阳性 ,平均HBVDNA拷贝数为 2 .83× 10 8·ml-1。 85例HBsAg、抗 -HBe和抗 -HBc均阳性的标本 ,检出HBVDNA 6 1例 (72 % ) ,平均拷贝数 7.9× 10 5·ml-1;HBV血清标志物均阴性的 74例标本 ,HBVDNA也全阴。结论　FQ -PCR可以检测HBV的感染和复制情况     

探讨血红蛋白对PCR检测乙型肝炎的影响

目的 :探讨血红蛋白对弱阳性乙型肝炎 (HBV) PCR定量检测结果造成的影响。方法 :采用煮沸法处理血清 ,分别设置阴性对照和阳性对照 (含量 3.0× 10 4 copies/ m L HBV DNA)。取浓度分别为 0 .1μg/ L、0 .5 μg/ L、1.0μg/ L、2 .5 μg/ L、5 .0 μg/ L、2 5 .0 μg/ L、5 0 .0 μg/ L、10 0 .0 μg/ L、5 0 0 .0 μg/ L 的血红蛋白 10 μL 加入管中 ,补充血清 (含3.0× 10 4 copies/ m L HBV DNA)至总体积 4 0 μL。用煮沸法提取 ,荧光定量 PCR检测 HBV DNA。结果 :血清标本中加入血红蛋白浓度 <5 .0 μg/ L 的 HBV DNA PCR结果全为阳性 ,经配对 χ2检验与阳性对照差异无显著性 (P>0 .0 5 )。加入血红蛋白浓度≥ 5 .0μg/ L时出现假阴性 ,经配对χ2 检验与阳性对照的差异有显著性 (P<0 .0 5 )。从各浓度组的变异系数 CV观察 ,血红蛋白浓度越高出现假阴性的机率就越大。结论 :在 HBV DNA PCR检测时 ,应纯化核酸避免血红蛋白对结果造成的影响     

多位点ARMS-PCR法进行HBVS区检测分型

目的：建立一种准确有效的PCR法HBV分型的实验方案。方法对80例包含了 HBV不同型别（B/C/D型）的血清样本进行了 HBV S区测序，通过分析国人 HBV B/C/D型S区碱基固有差异位点，设计得针对各种HBV 型别的高度特异性A RM S引物与探针，并用于另外120例HBV样本的PCR检测实验，同时进行测序进行检测准确度验证。结果多位点ARMS-PCR法与测序法的型别检出吻合率为99．5％，其中一例HBV B/C型混合感染由ARMS-PCR法检出并经追溯确认。结论经验证可见设计于S区型别固有差异位点之上的ARMS引物与探针于PCR检测中能以极高的特异性对 HBV 血清样本进分型，并能检出 HBV 混合型中的劣势病毒株。PCR法以其低成本、结果容易判定以及高灵敏度等优点，于临床HBV分型上是更为推荐的分子诊断学方法。     

江苏地区不同类型乙型肝炎患者HBV基因分型研究

目的:了解江苏地区乙型肝炎病毒基因型分布特征,探讨HBV各基因型与血清HBV DNA水平的关系.方法:采用荧光定量PCR结合Taqman MGB探针技术,对江苏地区176份乙型肝炎患者血清中的HBV DNA进行基因分型和定量检测.结果:176例血清中,C型117人(66.5%),B, C型40人(22.7%),B型9人(5.1%),D型1人(0.6%),A型1人(0.6%).C型与B, C混合型在HBV DNA水平上存在统计学差异(P＜0.05),B, C混合型的HBV DNA水平明显高于C型.C基因型在慢性乙型肝炎患者中的所占比例(71.4%)比在急性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者中所占的比例较高,但差异无统计学意义.结论:江苏地区HBV基因型以C型为主, B, C混合型次之,B型较少,D型,A型极少;B, C混合型患者的HBV DNA数量水平高于C型.     

乙肝患者158例血清HBV DNA含量变化对比分析

目的：比较实时荧光PCR法与COBAS Amplicor法定量检测血清HBV DNA的准确性。方法：本研究参比血清来自国家药品生物制品鉴定所与国家临检中心,临床血清标本共158例。比较了两种方法的线性范围、准确度、重复性、实验时间及成本。结果：实时PCR的批内差和批间差分别为0.3%～3.8%和1.4%～8.1%。实时荧光PCR法与COBAS Amplicor法具有良好的相关性（r=0.948）,实时荧光PCR法成本低且检测范围更宽。结论：实时PCR是监测慢性乙肝患者HBV DNA水平的有效方法。     

检测淋病柰瑟菌、沙眼衣原体、解脲支原体的临床方法评价

目的：评价Taqman技术检测临床标本中主要性病病原体的应用价值。应用：Taqman技术，常规PCR技术及培养法检测100份性病科门诊患者生殖泌尿道拭予标本，比较3种方法检测淋病票瑟菌（NG）、沙眼衣原体（CT）、解脲支原体（Uu）的灵敏度。500份性病科门诊患者生殖泌尿道拭子标本同时经Taqman技术及常规PCR技术检测，结果不符者使用培养法验证，以比较Taqman技术及常规PCR技术的特异性。结果：在100份临床标本检测中，Taqman技术，常规PCR及培养法检出阳性率分别为41％，35％，21％，在500份送检标本中，Taqman技术检出阳标本204份。常规PCR检出性标本181份，其中结果不符的41例分标本经重复培养验证。37例与Taqman技术测结果相符。结论：Taqman技术具有良好的敏感性和特异性，集PCR扩增，杂交及荧光自动化检测于一体，实验过程简便，快速，易于质控，是检测性病病原体的有效方法。     

乙型肝炎病毒耐药变异与基因型检测在临床上的应用

目的 建立直接测序法检测HBV P区耐药变异情况并分析基因型.探讨HBV基因型与临床病情的关系.方法 检测46例乙肝患者血清样本,采用特异的引物对待检标本HBV P区进行PCR扩增后作基因序列检测,利用Chromas2.23软件对测序结果 进行分析有无突变产生,测序结果 用软件clustalx1.81进行基因分型分析.结果 可通过一次测序反应完成对HBV.DNA P区的基因检测及基因型分析.检出YMDD变异株8例,其中YIDD 5例,YVDD 3例.在检测的46例标本中23例为B基因型,阳性率为50.0%;有21例为C基因型,其阳性率45.6;D基因型2例,阳性率4.4%.B基因型HBV感染者中HCC 2例,占8.7%;C基因型HBV感染者中HCC 8例,占38.1%.结论 直接测序法分析HBV常见耐药突变位点及基因型准确可行,B基因型乙肝患者预后优于C基因型患者.     

乙型肝炎病毒P区耐药突变与基因型及临床相关性分析

目的探讨HBV的P基因耐药突变的分布特征以及与基因型、临床的相关性。方法对慢性乙肝患者的血液样本进行P基因核苷类似物作用靶区进行聚合酶链反应,扩增产物进行测序,比较序列差异性,同时对其进行基因分型检测。结果 79例乙型肝炎患者共检测出B基因型61例（79.2%）,C基因型18例（20.8%）。通过对HBV-DNA进行P区测序表明耐药突变以拉米夫定耐药为主,为27例（51.9%）;其中B基因型对拉米夫定和阿德福韦的耐药率分别为31.1%（19/61）和9.8%（7/61）,二者交叉耐药率为6.6%（4/61）;而C基因型对拉米夫定和阿德福韦的耐药率分别为44.4%（8/18）和22.2%（4/18）,二者交叉耐药率为16.7%（3/18）,明显高于B型基因（P〈0.05）。慢性肝炎患者中,B型显著多于C型,为89.4%（59/66）;肝癌、肝硬化等重症中,B型感染者则明显少于C型感染者,为15.4%（2/13）（P〈0.05）。结论 79例患者HBV基因型以B型为主,C型次之,耐药突变主要以拉米夫定耐药为主,临床与基因型及耐药突变有显著性关联。     

Sybr greenⅠ实时定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的探讨

目的　选择以SybrgreenⅠ作为荧光指示剂做实时PCR (SYBR法 ) ,检测乙肝病毒 (hepatitisBvirus ,HBV )DNA ,并与国产TaqMan荧光实时定量PCR方法比较。 方法　对 189例临床血清标本DNA分别进行常规PCR和SybrgreenⅠ荧光PCR检测。 结果　使用国产TaqMan荧光实时定量PCR方法测得 10 6例HBVDNA阳性 ,67例阴性 ,16例判断困难。使用SybrgreenⅠ实时定量PCR方法测得 117例HBVDNA阳性 ,72例阴性 ,使用SybrgreenⅠ实时定量PCR方法测得HBVDNA阳性熔解曲线Tm值为 83 .67± 0 .95℃。其中 10 6例阳性和 67例阴性与使用国产TaqMan荧光实时定量PCR方法所测阴阳性一致 ,二者定量的回归系数为 0 .941。使用国产TaqMan荧光实时定量PCR方法判断困难的 16例中 ,11例SybrgreenⅠ实时定量PCR方法判断为阳性 ,但定量拷贝数很低 ,其中最大值为 1.68× 10 3 拷贝/ml,最小值为 4.3 7× 10 2 拷贝 /ml ,平均值为 83 9拷贝 /ml ;另 5例判断为阴性。结论　使用SybrgreenⅠ荧光素进行实时定量PCR检测HBVDNA的敏感度要高于国产TaqMan的荧光实时定量PCR方法 ,能够适合目前临床上及时有效准确检测标本的要求。     

双荧光标记定量PCR检测乙型肝炎病毒核酸

目的:探索SYBR GreenⅠ和TaqMan探针双标记荧光定量PCR(dFQ-PCR)检测乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)的意义。方法:选择浓度为1011.70,108.70,106.70和<1×106.00copies/L的4种血清各1份,进行dFQ-PCR,同时以TaqMan探针和SYBR GreenⅠ单荧光标记PCR(sFQ-PCR)为对照,设置同一扩增和熔解曲线的循环参数,检测HBV-DNA含量及其熔解温度(Tm),每种方法一次检测每份血清5次。结果:dFQ-PCR检测的HBV-DNA阳性血的平均含量为1011.55±0.32,108.79±0.29,106.81±0.30,与TaqMan探针sFQ-PCR的1011.49±0.31,108.69±0.30,106.72±0.25copies/L对应浓度值取10对数比较,无统计学意义(t=0.31,0.54和0.27,均为P>0.05);与SYBRGreenⅠ染料sFQ-PCR的1011.41±0.35,108.21±0.34和106.26±0.26copies/L(不含未检出的两次血清)比较,中低浓度有统计学意义(t=2.90和2.62,P<0.05)。dFQ-PCR和SYBR GreenⅠ染料sFQ-PCR均出现明显熔解曲线,HBV-DNA含量为1011.70,108.70和106.70copies/L的Tm分别为79.8,71.8和72℃。结论:dFQ-PCR能同时检测HBV-DNA含量和Tm,为HBV含量及其基因分型的同步检测提供了新思路。