IL-37抑制缺氧诱导的细胞凋亡的研究

目的:IL-37是白细胞介素-1家族成员,可调节血管生成,抑制肿瘤生长,对I/R损伤、炎症性肠道疾病和类风湿性关节炎等有保护作用。由于炎症反应能导致组织氧供应失衡,使局部组织细胞处在缺氧的微环境,因而,本实验主要针对IL-37是否在缺氧环境中发挥细胞保护作用进行研究。方法:分别给予1%和21%O2培养上皮细胞。通过瞬时转染使细胞过表达IL-37,24 h后提取RNA和蛋白质。利用RT-PCR检测IL-37、TNF-α、IL-1、IL-6和CXCL2 m RNA的表达;利用Western blot检测PARP的总蛋白和剪切蛋白的表达量。利用流式细胞术检测细胞凋亡。结果:缺氧时,细胞凋亡增加1.63倍,内源性IL-37和促炎因子m RNA水平的表达均显著增加,PARP总蛋白表达增加2.1倍。IL-37可显著抑制缺氧诱导的细胞凋亡,并显著降低IL-6和CXCL2的m RNA水平,但其对可以修复DNA的PARP总蛋白的表达在缺氧时无明显作用,caspase-3剪切的PARP也无显著差异。结论:在缺氧环境中,IL-37作为固有免疫调节因子,可以通过抑制细胞凋亡,炎性因子IL-6和CXCL2的表达抑制局部的过度炎症反应。但TNF-αm RNA的表达和caspase-3剪切底物PARP的剪切蛋白无显著变化,提示IL-37不是通过减少TNF-α的表达、进而减少FADD和caspase-8的募集、再减少活化caspase-3的途径抑制细胞凋亡的。其具体抑制凋亡的机制有待进一步研究。     

乳杆菌对TNF-α诱导Caco-2细胞分泌IL-6和IL-8的影响

目的 研究嗜酸乳杆菌对TNF-α诱导Caco-2细胞表达细胞因子IL-6和IL-8的影响.方法 将嗜酸乳杆菌L050103-12与Caeo-2细胞共孵育,加入TNF-α-起温育2 h,收集细胞培养上清,ELISA检测IL-6和IL-8的水平;提取细胞总RNA,采用RT-PCR的方法检测IL-6和IL-8 mRNA的表达.结果 加入TNF-α(10 ng/ml)温育2 h后,与对照组相比,Caco-2细胞IL-6和IL-8的mRNA表达显著增强.IL-6和IL-8的分泌水平也显著增高(P＜0.01).提前给予嗜酸乳杆菌1950103-12与Caco-2细胞共孵育,与TNF-α处理组相比,TNF-α诱导Caco-2细胞IL-6和IL-8 mRNA表达相对减弱(P＜0.05),IL-6和IL-8的分泌水平也显著降低(P＜0.01).单独给予嗜酸乳杆菌1950103-12处理Caco-2细胞,其IL-6和IL-8 mRNA表达以及分泌与对照组相比,均无变化.结论 嗜酸乳杆菌1950103-12可以抑制TNF-α诱导Caco-2细胞表达促炎性细胞因子IL-6和IL-8.     

SARI基因促进急性髓性白血病细胞凋亡机制的探讨

目的：通过慢病毒载体过表达SARI（Suppressor of AP-1,regulated by IFN）基因,探讨SARI基因促进急性髓性白血病（Acute myeloid leukemia,AML）细胞凋亡的分子机制。方法：构建SARI基因过表达的慢病毒载体,感染AML细胞HL-60和NB4,应用实时荧光定量PCR和Western blot对感染后细胞进行过表达的鉴定。两株AML细胞均设空白对照组（CON组）、空载体对照组（NC组）及SARI组,应用Western blot检测SARI过表达后两株AML细胞组凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-xl、Bax和凋亡途径相关蛋白CytoC、Caspase8、Caspase9、Caspase3、Actived-Caspase3、PARP的表达变化。结果：SARI组细胞的SARI mRNA和蛋白表达水平均显著高于CON组和NC组（P＜0.05）,表明SARI过表达成功。SARI过表达的HL-60和NB4细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl表达均下调,促凋亡蛋白Bax表达上调。CytoC表达增加,Caspase8、Caspase9、Caspase3剪切激活,Actived-Caspase3上调,PARP下调,PARP剪切体上调。结论：SARI基因促进AML细胞凋亡可能是通过激活外源性凋亡途径及与外源性凋亡途径交叉的内源性凋亡途径。     

白细胞介素-17在慢性阻塞性肺疾病患者中的表达及作用机制

目的探讨白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者中的表达及作用机制。方法根据慢性阻塞性肺疾病患者的病情严重程度分为急性加重期组(AECOPD group)和稳定期组(COPD group),健康体检者作为对照组,各46例。酶联免疫吸附试验测定血清、肺泡灌洗液、呼出气冷凝液中的IL-17含量。香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)或IL-17处理A549,蛋白质免疫印迹、酶联免疫吸附试验、流式细胞术依次检测细胞中相关蛋白的表达、分泌与凋亡情况。结果 AECOPD组患者的血清、肺泡灌洗液和呼出气冷凝液中IL-17的含量均高于COPD组和对照组。CSE可促进肺泡上皮细胞表达IL-17RC,而且具有剂量依赖效应,使用PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002可部分降低IL-17RC的表达。IL-17A可促进肺泡上皮细胞分泌IL-8和TNF-α,可以诱导肺泡上皮细胞早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞比例增加,与CSE共同作用时具有协同效应。IL-17A可促进促凋亡蛋白Bax的表达,抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2表达,可促进Caspase 3和Caspase 9蛋白活化,与CSE共同作用时具有协同效应。结论 IL-17在COPD患者中高表达,且急性加重期高于稳定期。CSE可通过PI3K/AKT信号通路诱导IL-17RC表达,CSE可与IL-17协同诱导肺泡上皮细胞分泌炎症因子和并通过线粒体依赖的途径诱导其凋亡。     

具核梭杆菌促进食管癌细胞增殖的研究

目的研究具核梭杆菌（Fusobacteriumnucleatum,n）对食管癌细胞粘附入侵和增殖的作用,探讨其作用机制。方法本实验应用具核梭杆菌标准株ATCC25586与食管癌Eca-109细胞共培养,建立具核梭杆菌与食管癌细胞体外的肿瘤微环境模型。采用细胞免疫组化染色法检测细菌对细胞的粘附入侵能力[3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐]MTF及流式细胞仪检测Eca-109细胞的增殖,酶联免疫吸附试验方法（ELISA）检测观察正常对照组、细菌与细胞共培养模型组的细胞培养液中IL-6的浓度,Westernblot检测STAT3和p-STAT3的蛋白表达。结果具核梭杆菌可粘附和入侵到Eca-109细胞内。与对照组比较,加入具核梭杆菌的实验组作用后第1—4天Eca-109细胞增殖加快,48h内其细胞培养液内IL-6浓度也是对照组的4倍。Westernblot结果显示,与对照组相比,具核梭杆菌处理组p-STAT3蛋白表达增加,STAT3蛋白表达没有明显改变。中和IL-6受体蛋白后,具核梭杆菌处理组p-STAT3、STAT3蛋白表达量均不变。结论具核梭杆菌通过刺激IL．6的产生促进食管癌细胞的增殖。     

阿霉素通过调节MAPK/mTOR通路抑制弥漫大B细胞淋巴瘤的发生

目的探讨阿霉素(Adriamycin,ADM)抑制弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的发生过程,及MAPK/m TOR通路在此过程中的作用。方法 DLBCL细胞给予0、5和10μmol/L ADM培养12 h、24 h和48 h后,细胞计数CCK-8法检测DLBCL细胞的存活率;TUNEL法检测检测DLBCL细胞凋亡发生;Caspase 3活性检测试剂盒检测细胞凋亡蛋白Caspase 3活性;Western blot法检测DLBCL中磷酸化蛋白p38、JNK、ERK和m TOR蛋白表达水平。结果与对照组相比,阿霉素治疗组中DLBCL细胞存活率显著降低,而Caspase 3活性显著增加,差异具有统计学意义(P0.05);与对照组相比,阿霉素治疗组中p38和JNK mRNA水平和磷酸化蛋白表达含量均明显增加,ERK mRNA水平和磷酸化蛋白表达无明显变化,而AKT mRNA水平和磷酸化蛋白的表达含量均明显下降,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 MAPK/m TOR信号通路在阿霉素抑制DLBCL细胞生长,并诱导细胞凋亡发生的过程中起到重要作用。     

LXR-ABCA1/ABCG1通路对BCG感染的巨噬细胞凋亡和炎性反应的调控作用

目的 揭示LXR-ABCA1/ABCG1通路对BCG感染后巨噬细胞凋亡和炎性反应的调控作用。方法 采用T0901317预处理RAW264.7巨噬细胞2 h和BCG感染24 h,设置4个实验组：对照组、T0901317组、BCG感染组和T0901317+BCG感染组。采用Western blot方法检测凋亡相关蛋白cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase8、cleaved-Caspase9和TLR信号通路相关蛋白TLR2、TLR4、MyD88、TRAF6、p-NF-κB p65、IRF3、TBK1的表达,采用ELISA方法检测细胞培养上清中促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。结果 与对照组比较,BCG感染组凋亡相关蛋白cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase8、cleaved-Caspase9及依赖MyD88途径蛋白TLR2、TLR4、MyD88、TRAF6、p-NF-κBp65的表达均上调（P<0.01）,促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平上升（P<0.01）;与BCG感染组相比,T09013...     

PTPRO激活AKT促进脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤中肺泡上皮细胞的吞噬

目的 探讨受体O型蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPRO)在脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤中对肺泡上皮细胞吞噬功能的影响。方法 体内实验将小鼠随机分成正常对照组和LPS刺激组,通过LPS腹腔注射建立急性肺损伤模型,HE染色检测小鼠肺组织中炎性细胞的浸润情况,ELISA检测小鼠肺组织中细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达,Western blot法检测LPS对小鼠肺组织PTPRO蛋白表达的影响。体外实验利用小干涉RNA(siRNA)沉默MLE-12肺泡上皮细胞PTPRO的表达,流式细胞术检测LPS和PTPRO沉默对MLE-12细胞吞噬功能的影响;Western blot法检测LPS和PTPRO沉默对MLE-12细胞蛋白激酶B(AKT)和磷酸化AKT蛋白表达的影响。结果 LPS腹腔注射建立小鼠急性肺损伤模型后,小鼠肺中浸润的多形核白细胞显著增多,肺组织中TNF-α的表达也升高。小鼠肺组织和MLE-12细胞的PTPRO蛋白表达量随LPS刺激在24 h内呈时间依赖性上调。PTPRO沉默后,MLE-12细胞的吞噬能力显著下降,且其AKT磷酸化水平的表达较对照组显著降低。结论 PTPRO可能通过激活...     

MAPK/AKT在三氧化二砷诱导Jurkat淋巴瘤凋亡中的表达及意义

目的探讨MAPK/AKT在三氧化二砷(arsenic trioxide,As_2O_3)诱导Jurkat淋巴瘤凋亡中的表达及意义。方法 Jurkat淋巴瘤给予10μmol/L As_2O_3培养24 h、48 h和72 h后,细胞计数CCK-8法检测Jurkat淋巴瘤细胞的存活率;Caspase-3活性检测试剂盒检测细胞凋亡蛋白Caspase-3活性;Real-Time PCR法和Western blot法检测Jurkat淋巴瘤中p38、JNK、ERK和AKT的基因和磷酸化蛋白表达水平。结果与对照组相比,三氧化二砷治疗组中Jurket淋巴瘤细胞存活率显著降低,而Caspase-3活性显著增加,差异具有统计学意义(P0.05);与对照组相比,三氧化二砷治疗组中p38和JNK mRNA水平和磷酸化蛋白表达含量均明显增加,ERK mRNA水平和磷酸化蛋白表达无明显变化,而AKT mRNA水平和磷酸化蛋白的表达含量均明显下降,差异具有统计学意义(P0.05)。结论三氧化二砷可以显著抑制Jurkat淋巴瘤细胞生长,诱导细胞凋亡的发生,且MAPK/AKT信号通路在此过程中起到重要作用。     

IL-23通过PI3K/AKT途径诱导甲状腺上皮细胞凋亡

目的探讨白细胞介素23(IL-23)对人甲状腺上皮细胞增殖、凋亡的影响。方法用(10、50、100)ng/m L IL-23处理Nthy-ori 3-1甲状腺上皮细胞24 h后,用MTT法检测细胞增殖能力改变,藻红蛋白标记的膜联素Ⅴ/7-氨基放线菌素D(annexinⅤ-PE/7-AAD)双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡水平变化,Western blot法检测磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、Bcl-2、Bcl-x L、活化caspase-3蛋白的水平。结果与对照组相比,随着IL-23剂量增加,甲状腺上皮细胞的增殖能力逐渐下降;IL-23下调PI3K/AKT信号蛋白的磷酸化水平并促进甲状腺上皮细胞凋亡。结论 IL-23通过调节PI3K/AKT途径促进甲状腺上皮细胞凋亡。     

肠道病毒71型诱导Bax依赖的细胞凋亡

目的研究肠道病毒71型（EV71）诱导细胞凋亡的分子机制。方法采用CCK8比色法检测EVT1感染对于人横纹肌肉瘤细胞RD增殖的影响,通过Hoechst33342染色和Caspase3活性测定检测细胞凋亡特征,用WesternBlot方法检测凋亡相关蛋白Caspase3和8的激活。同时通过免疫共沉淀检测EV71感染后细胞内Bax的活化。结果EV71感染RD细胞可以明显抑制细胞增殖,引起Caspase3、8和PARP蛋白的激活,同时引起Bax蛋白表达增加并发生构象变化。结论EV71通过Bax构象变化诱导Caspase依赖的细胞凋亡。     

Annexin 1抑制BCG诱导的巨噬细胞RAW246.7细胞炎性应答及凋亡

目的建立体外结核分枝杆菌感染巨噬细胞模型,探讨膜联蛋白A1(ANXA1)对卡介苗(BCG)菌株诱导的RAW246.7细胞炎性反应及凋亡的调控作用。方法用BCG感染RAW246.7细胞。用RT-q PCR检测ANXA1、IL-6和TNF-αmRNA表达。Western blot检测ANXA1及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及caspase-3的表达;用MTT检测细胞存活率;用ELISA检测细胞的凋亡率;ELISA试剂盒检测细胞因子IL-6和TNF-α的含量。结果 ANXA1在BCG感染的巨噬细胞RAW246.7中明显下调(P0.05),并呈时间依赖性。ANXA1高表达显著降低BCG刺激诱导的炎性细胞因子IL-6和TNF-α的表达水平(P0.05)。此外,过表达ANXA1明显提高BCG感染的巨噬细胞的存活率(P0.05),并抑制细胞凋亡,通过上调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达同时下调促凋亡蛋白Bax的表达水平(P0.05),并降低caspase-3的蛋白表达量(P0.05)。结论 ANXA1能够抑制BCG刺激诱导巨噬细胞的炎性应答进程及凋亡,为结核病的临床研究和治疗提供了理论基础。     

13-甲基十四烷酸诱导膀胱癌细胞株T24 凋亡的机制研究

目的： 研究13-甲基十四烷酸诱导膀胱癌T24细胞凋亡的作用,探讨其可能的机制。方法：将不同浓度的13-甲基十四烷酸作用于膀胱癌T24细胞,用MTT法检测细胞增殖, 流式细胞仪（FCM）检测细胞周期,TUNEL法检测细胞凋亡指数,蛋白免疫印迹法分析参与凋亡的蛋白。结果：药物处理2 h后p38、JNK磷酸化增强,AKT磷酸化减弱,8 h后线粒体中细胞色素C释放,FADD及磷酸化FADD没有明显变化,caspase酶底物 PARP、lamin B、RB在12 h出现明显的裂解片段,且药物诱导T24细胞凋亡的过程有时间浓度依赖效应。结论：在13-MTD诱导T24细胞凋亡的过程中p38MAPK和JNK/SAPK信号通路被激活,PI3K/AKT信号通路被抑制,进而激活线粒体凋亡途径,使线粒体内的细胞色素C释放到胞浆,激活caspase酶,裂解相应的凋亡底物lamin B、Rb、PARP,促进T24细胞凋亡。     

人巨细胞病毒感染THP-1源性巨噬细胞对IL-1β表达的影响

目的 观察HCMV感染THP-1源性巨噬细胞后,促炎细胞因子IL-1β表达的时序性变化.方法 构建HCMV感染THP-1源性巨噬细胞模型,设立HCMV AD169标准毒株感染组、模拟感染对照组、LPS+ATP对照组和poly(dA:dT)对照组.用ELISA法测定THP-1源性巨噬细胞培养上清IL-1β水平在病毒感染细胞后lh、3h、6h、12h、24 h和48 h的时序性变化.分别用real-time PCR和western blot检测感染后6 h IL-1β基因和蛋白的表达水平.结果 HCMV感染THP-1源性巨噬细胞6h后,促炎细胞因子IL-1β基因的相对表达量是模拟感染组的7.77倍.HCMV感染THP-1源性巨噬细胞1h后,细胞上清IL-1β表达量逐渐显著增高,感染后3h和6h继续升高,感染后12h达到高峰,一直持续到48 h.HCMV感染THP-1源性巨噬细胞6h HCMV感染组IL-1β蛋白表达明显高于模拟感染对照组和poly(dA:dT)对照组,而与LPS+ATP对照组比较无统计学差异.结论 HCMV感染THP-1源性巨噬细胞可诱导IL-1β高表达,且呈时序性增高趋势.     

地塞米松和IL-10对hPBMC促炎细胞因子产生和核转录因子活化的影响

目的:观察地塞米松 (Dex)和白细胞介素 (IL)-10对培养的经脂多糖 (LPS)刺激的人外周血单个核细胞 (hPBMC)释放促炎细胞因子肿瘤坏死因子 (TNF)-α、IL-6及对转录因子核因子-κB(NF-κB)、活化蛋白-1(AP-1)、cAMP反应元件结合蛋白 (CREB)活化的影响。方法:用LPS刺激分离培养的hPBMC,分为正常对照组、LPS刺激组、IL-10和Dex干预组。ELISA法检测培养上清中TNF-α、IL-6含量。凝胶电泳迁移率改变分析法 (EMSA)检测核提取物中NF-κB、AP-1、CREB活性。结果:LPS刺激1h后TNF-α含量显著增加,Dex和IL-10干预后TNF-α含量增加被显著抑制;IL-6含量在LPS刺激后12h显著增加,Dex和IL-10显著抑制IL-6的产生;LPS刺激12h后IL-10含量显著增加,Dex对IL-10产生没有明显影响。LPS刺激1h后NF-κB、AP-1、CREB的DNA结合活性显著增加,Dex和IL-10显著抑制以上三种核因子的活性,但Dex对AP-1、CREB活性的抑制作用强于IL-10。结论:LPS诱导hPBMC释放多种促炎和抗炎细胞因子的产生,并诱导多种转录因子的活化;Dex、IL-10能抑制上述促炎细胞因子的产生和转录因子的活化。Dex对AP-1、CREB活性的抑制作用强于IL-10。     

肺炎嗜衣原体Cpn0810重组蛋白诱导THP-1细胞产生促炎因子和凋亡的研究

目的:在E.coliBL21中表达肺炎嗜衣原体Cpn0810,并研究该蛋白能否诱导人单核细胞( THP-1)产生TNF-α和IL-6等促炎因子和细胞凋亡.方法:PCR扩增Cpn0810蛋白编码基因,构建pGEX6p-2/Cpn0810重组质粒,在E.coliBL21中诱导表达,经ToxinEraser纯化柱纯化后,用不同浓度的GST-Cpn0810作用THP-1细胞,ELISA法检测TNF-α和IL-6的水平,Hoechst33258荧光染色、AnnexinV-F1TC-PI染色法检测细胞凋亡情况.结果:构建了重组质粒pGEX6p-2/Cpn0810,并在E.coliBL21菌中高效表达.该蛋白能诱导THP-1细胞以时间、剂量依赖方式表达TNF-α和IL-6;当10mg/L GST-Cpn08 10处理THP-1细胞24h后,形态学上,细胞表现为皱缩、核碎裂、细胞起泡及凋亡小体等凋亡特征.结论:表达并纯化的Cpn0810蛋白能诱导THP-1细胞分泌TNF-α和IL-6等促炎因子和诱导其发生凋亡.     

细胞因子信号传导抑制蛋白-1减轻细胞因子诱导胰岛β细胞促凋亡基因的表达

目的 构建稳定表达细胞因子信号传导抑制蛋白－1（SOCS-1）蛋白的细胞,探讨其在胰岛β细胞凋亡中的保护作用。方法 克隆大鼠SOCS-1基因,构建表达载体pEGFP-C1-SOCS1并转染入大鼠胰岛细胞系RINm5F中,构建稳定表达SOCS-1蛋白的细胞。分别用细胞因子IL-1β 、TNF-α、IFN-γ 、IL-1β联合IFN-r、IL-1β联合TNF-α及IFN-γ刺激24h,RT-PCR与Western blot检测凋亡相关指标。结果 成功构建了稳定表达SOCS-1蛋白的细胞。用IFN-γ、IL-1β联合IFN-r、IL-1β联合TNF-α及IFN-γ刺激后,未转染SOCS-1质粒的细胞iNOS转录水平显著升高。在用所有细胞因子刺激后,未转染SOCS-1质粒的细胞caspase-3表达及活性均显著升高。 结论 SOCS-1蛋白能减轻多种细胞因子诱导的胰岛β细胞促凋亡基因的表达。     

抗胰岛素蛋白(resistin)促进体外培养的牛肺泡巨噬细胞炎症因子的产生及其机制

目的探讨抗胰岛素蛋白(resistin)与过氧化物酶体激活物受体γ(PPARγ)的关系及其促炎效应。方法采用100 ng/m L牛resistin诱导牛肺泡巨噬细胞0、1. 5、3、6、12、24 h,采用实时荧光定量PCR检测牛肺泡巨噬细胞PPARγ、核因子κB(NF-κB)、resistin的mRNA水平,Western blot法检测PPARγ、NF-κB蛋白的表达变化,ELISA检测培养细胞上清液促炎细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平。结果 Resistin处理1. 5 h后,牛肺泡巨噬细胞PPARγmRNA水平显著降低,且存在时间依赖效应; NF-κB、resistin的mRNA水平在6 h后显著升高,12 h达到峰值; PPARγ蛋白水平在12 h显著降低,NF-κB蛋白在12 h显著升高; IL-1β、TNF-α于1. 5 h后呈时间依赖效应极显著升高。结论 Resistin能促进牛肺泡巨噬细胞产生IL-1β和TNF-α等炎症因子,这可能与抑制PPARγ和激活NF-κB途径有关。     

scFvCD20:sTRAIL蛋白诱导BJAB细胞凋亡的实验研究

研究融合蛋白scFvCD20:sTRAIL诱导B淋巴瘤细胞BJAB凋亡的发生以及凋亡相关蛋白的表达变化。采用PCR、重叠PCR、酶切、连接等方法构建pLentiR.scFvCD20:sTRAIL、pLentiR.ISZ-sTRAIL、pLentiR.scFvCD20及pLentiR.CopGFP慢病毒表达载体,瞬时转染293T细胞获得含有scFvCD20:sTRAIL融合蛋白的细胞培养上清,采用CCK8细胞增殖抑制实验检测scFvCD20:sTRAIL融合蛋白对CD20阳性BJAB细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测其对BJAB细胞诱导凋亡,Western blotting检测凋亡过程中内源性及外源性凋亡信号传导途径相关蛋白的变化。结果显示,成功构建了慢病毒表达载体pLentiR.scFvCD20:sTRAIL、pLentiR.ISZ-sTRAIL、pLentiR.scFvCD20及pLentiR.CopGFP,瞬时转染293T细胞后并可获得融合蛋白的表达。与ISZ-sTRAIL比较,融合蛋白scFvCD20:sTRAIL可不同程度地提高对CD20阳性BJAB细胞的生长抑制作用,凋亡细胞增多,其中Bcl-2表达下降、Bax表达升高,Caspase 8、Caspase 9、Caspase 3及PARP被特异性剪切活化。研究表明,融合蛋白scFvCD20:sTRAIL可诱导BJAB细胞凋亡,与bcl-2/bax的表达变化以及Caspase的剪切活化有关。     

创伤弧菌溶细胞素融合蛋白对人Caco-2细胞IL-8基因表达和IL-8分泌的影响

目的 研究创伤弧菌溶细胞素融合蛋白(rVvhA)对人肠上皮细胞(human intestinalepithelial cell,Caco-2)IL-8基因表达的影响.方法 IPTG诱导、表达、纯化、复性及Western blot鉴定rVvhA表达和纯化情况;CCK-8法检测rVvhA对Caco-2的细胞毒性作用;RT-PCR检测rVvhA诱导Caco-2细胞IL-8基因的表达情况;ELISA检测Caco-2细胞培养上清IL-8的分泌情况.结果 Ni~(2+)-NTA亲和层析柱对rVvhA进行纯化后纯度可达95%以上;CCK-8结果显示rVvhA活性蛋白显著降低了Caco-2细胞的存活率,有效浓度为1.5 HU/ml(P<0.05);RT-PCR结果显示,0.6 HU/ml rVvhA30 minllp可诱导Caco-2细胞IL-8 mRNA基因表达上调;ELISA结果显示,Caco-2细胞经rVvhA作用后,培养液上清中IL-8多肽的表达时相在4 h.RT-PCR与ELISA结果皆显示,IL-8基因的转录及IL-8表达皆具有时间-剂量依赖性.结论 rVvhA在转录水平上能诱导人Caco-2细胞IL-8 mRNA表达,促进IL-8的合成,在创伤弧菌引起的过度炎症反应和败血症的发生、发展中可能具有重要意义.