辐射敏感性启动子调控CD基因表达联合125I照射对膀肤癌EJ细胞的杀伤作用

以脂质体介导的辐射敏感性基因联合胞嘧啶脱氨酶(cytosine deantinase,CD)基因转染膀胱癌EJ细胞,研究放射性核素125 I照射后5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)对转染膀胧癌EJ细胞的杀伤作用.人工合成辐射敏感性启动子E8,将启动子克隆至质粒pCD2的CD基因上游,构建以E8为...     

5-氟胞嘧啶对胞嘧啶脱氨酶基因修饰的胰腺癌细胞凋亡的诱导作用

目的:探讨5-氟胞嘧啶(5-FC)对基因修饰的胰腺癌细胞凋亡的影响及特征。方法: 以腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)基因转染胰腺癌SW1990细胞,以Western blot检测目标基因蛋白水平表达,通过细胞形态学、脱氧核糖核酸(DNA)凝胶电泳和流式细胞术观察5-FC对表达CD基因的SW1990细胞凋亡的影响作用。结果: 以含CD基因的重组腺病毒转染的SW1990细胞,给予5-FC100 μmol·L^-1, 培养48 h,细胞出现典型的凋亡形态、DNA梯形改变及凋亡峰, 细胞在G₁,S 和G₂/M各期分别为64%、11%和7%,凋亡率达34.6%。结论:5-FC的上述诱导凋亡作用可能是胰腺癌CD基因疗法的重要机制。     

AFP启动子驱动的yCD/TK双自杀基因靶向杀伤肝癌细胞的体内外研究

目的： 研究携带甲胎蛋白（AFP）启动子的酵母菌胞嘧啶脱氨酶/胸苷激酶（yCDglyTK）双自杀基因体内外靶向性杀伤肝癌细胞的效果和机制。方法: 构建携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因表达质粒。通过阳离子脂质体将携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因转染HepG2和SMMC7721细胞,用MTT法测定不同浓度氟胞嘧啶（5-FC）、更昔洛韦（GCV）及联合治疗的杀伤作用,用流式细胞仪检测细胞周期。建立裸鼠肝癌皮下种植瘤模型,观察自杀基因体内杀瘤效果以及细胞凋亡的情况。结果: 成功构建的携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因靶向性地在AFP阳性的HepG2细胞上表达,而AFP阴性的SMMC7721细胞无表达,GCV、5-FC及两者联合可有效抑制HepG2细胞生长,随药物浓度的增高而杀伤作用增强,药物间抑瘤效果比较是GCV＋5-FC＞5-FC＞GCV,而SMMC7721细胞的生长未受影响。体内实验可见GCV、5-FC及两药联合对转染后的HepG2细胞种植瘤有明显的抑制效果,并检测到明显的细胞凋亡,而对SMMC7721细胞种植瘤的生长无影响,种植瘤内极少凋亡细胞。结论: 携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因能有效地靶向性地杀伤AFP阳性的肝癌细胞,细胞凋亡可能是其杀伤的重要机制之一。     

bHLH家族基因对hTERT启动子转录活性的调节研究

目的：研究bHLH家族基因中c-myc和mad1对人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子的转录调节。 方法： 采用脂质体DOTAP转染法将装载有虫荧光素酶基因的野生型hTERT启动子(Tw)和突变型hTERT启动子(Td)质粒，与含c-myc或mad1基因的质粒，以不同方式组合分别转染至膀胱癌T24细胞、EJ细胞、猴肾母COS-7细胞和人成纤维细胞，培养48 h后检测各组虫荧光素酶活性。 结果： 在膀胱癌T24和EJ细胞中，Tw组转录活性显著高于对照组，亦高于Td组。在T24和EJ细胞中, c-myc可呈剂量依赖地上调Tw的转录活性，但负性调节Td转录; 而mad1负性调节Tw转录，但上调Td的转录活性。c-myc和mad1联合可下调膀胱癌细胞Tw的转录。 结论： c-myc和mad1可对hTERT启动子进行转录调节，并且高度依赖于bHLH家族基因的接合位点E-box的序列保守性。     

骨髓间充质干细胞-胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统的构建及效应

背景:体内研究已经证实骨髓间充质干细胞能够像神经干细胞一样在脑内迁移和整合,如果骨髓间充质干细胞用于系统途径移植成为可能,将会显著简化移植的步骤。目的:构建含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的重组表达质粒pEGFP-N3-CD,用脂质体Lipofectamine2000转染大鼠骨髓间充质干细胞,体外观察CD基因的表达及BMSCs-CD/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对C6胶质瘤细胞的杀伤作用。方法:构建pEGFP-N3-CD质粒,酶切、DNA测序鉴定。全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,脂质体Lipofectamine2000介导重组表达质粒pEGFP-N3-CD转染大鼠骨髓间充质干细胞。G418筛选培养获取阳性克隆(BMSCs-CD细胞),免疫细胞化学染色检测BMSCs-CD细胞的CD基因蛋白表达。Transwell小室共培养BMSCs-CD细胞和C6胶质瘤细胞,24h后加入前体药物5-氟胞嘧啶,72h后TUNEL、MTT、流式细胞术检测C6胶质瘤细胞的凋亡情况。结果与结论:构建的重组表达质粒pEGFP-N3-CD含完整的CD基因序列,CD基因转染至骨髓间充质干细胞并在基因及蛋白水平有完整表达。BMSCs-CD和C6胶质瘤细胞体外共培养条件下,C6胶质瘤的凋亡率呈剂量依赖性,与对照组相比差异有显著性意义(P0.01)。结果提示体外共培养条件下,BMSCs-CD/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对C6胶质瘤细胞生长有显著的抑制作用。     

腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因联合黄连素对直肠癌细胞的杀伤作用

目的:探讨黄连素联合腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因(Ad-CD)对直肠癌细胞的体外杀伤作用.方法:用重组腺病毒介导外源CD基因转染到人直肠癌细胞株HR-8348,检测病毒的转导效率和CD基因表达.用四甲基偶氮唑盐(MTT法)检测黄连素联合Ad-CD基因对HR-8348细胞存活率及体外旁观者效应的影响.结果:在250μg/ml 5-氟胞嘧啶(5-FC)浓度下,0 1、 0 3、 3 0、 30 0μmol/L浓度的黄连素联合5-FC对直肠癌细胞生长抑制率分别为27 7%、 42 4%、 52 3%、 56 3%.3 0μmol/L浓度的黄连素可作为参考用药浓度.在转染和未转染CD基因的HR-8348混合体系中,黄连素联合CD/5-FC对直肠癌细胞具有更强的抑制作用.结论:黄连素可以增强自杀基因系统对直肠癌细胞的杀伤作用,可作为一种增效剂应用于直肠癌的治疗.     

放射敏感性启动子调控Apoptin基因表达对肺腺癌细胞的杀伤作用研究

目的构建放射敏感性启动子调控的凋亡素(Apoptin)基因的真核表达质粒pE6-Apoptin-EGFP,探讨其在X线调控下对肺腺癌细胞A549的杀伤作用。方法分别以限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ双酶切质粒pE6-p53-EGFP及pApoptin-EGFP,电泳分离,回收目的线性DNA片段,T4连接酶连接,构建重组质粒pE6-Apoptin-EGFP,测序、鉴定。脂质体介导瞬时转染肺腺癌细胞A549,RT-PCR、荧光显微镜等检测照射前后融合蛋白表达,流式细胞仪检测放射诱导前后转染细胞的凋亡变化。结果成功构建重组质粒pE6-Apoptin-EGFP,并在被转染A549细胞中检测到Apoptin基因表达;经放射诱导的pE6-Apoptin-EGFP/A549细胞及对照组pE6-EGFP/A549细胞的凋亡率分别为(32.48±3.56)%和(10.67±2.42)%,未经放射诱导的pE6-Apoptin-EGFP/A549细胞及对照pE6-EGFP/A549细胞的凋亡率分别为(6.33±1.21)%、(4.25±0.87)%;与其它3组相比,放射诱导的pE6-Apoptin-EGFP/A549细胞凋亡率明显增高,具有非常显著统计学差异(P<0.01)。结论放射敏感性启动子调控的Apoptin基因表达可在放射线调控下在A549细胞中有效表达并诱导凋亡,为进一步研究非小细胞肺癌的放射-基因联合治疗奠定了基础。     

B7-2基因联合自杀基因治疗乳腺癌移植瘤模型

目的观察树突状细胞活化抗原B7-2基因联合自杀基因系统EC-CD/5-FC于实验性乳腺癌的体、内外治疗的协同作用。方法用重组腺病毒构建CD和B2-7载体,体外感染人乳腺癌MCF-7细胞,荧光显微镜观察其感染率。然后给与前药5-FC,通过MTT法检测MCF-7细胞的增殖情况;Annexi V-FTTC/PI双染流式细胞术检测MCF-7细胞的细胞周期。BALB/C小鼠腋窝下注射MCF-7细胞制备乳腺癌移植瘤模型,待肿瘤直径达0.5 cm大小,分别在肿瘤局部直接注射Ad CD/B7-2,然后连续10 d腹腔注射5-氟胞嘧啶(5-FC),免疫组化法检测肿瘤组织中CD8+T表达。结果 MTT法检测显示MCF-7细胞对前药有较高的敏感性,Ad CD/5-FC/Ad B7-2和Ad CD/5-FC组MCF-7细胞的增殖均受到明显抑制(P<0.05);而Ad B7-2治疗基因对MCF-7细胞的增殖没有任何影响。在感染复数为100时流式细胞仪检测,Ad CD/5-FC/Ad-B7-2组和Ad CD/5-FC组均出现典型的凋亡峰,细胞周期分析显示治疗后G0~G1期比率增多,G2~M及S期细胞减少。在MCF-7移植瘤模型中,Ad CD/5-FC/Ad-B7-2治疗后移植瘤的生长明显受到抑制;肿瘤瘤体内或瘤体周围CD8+T细胞浸润增加。结论 B7-2联合自杀基因系统对乳腺癌MCF-7细胞及其MCF-7细胞移植瘤均有明显的抑制作用,B7-2联合自杀基因Ad CD/5-FC系统时,共刺激分子B7-2可通过增强和诱导的特异抗肿瘤免疫,有效减少肿瘤负荷,增强Ad-CD/5-FC系统对肿瘤的杀伤作用。     

短发夹状RNA基因沉默补体受体C5aR及抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡

目的:探讨短发夹状RNA基因沉默补体受体C5aR及抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的作用效果。方法:构建针对大鼠补体受体C5aR基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-C5aR shRNA,采用电穿孔的方法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定的表达C5aR shRNA的细胞系。实验分为3组,①正常对照组:未转染的RK3E细胞;②阴性对照组:转染空载体pRNAT-U6.1的RK3E细胞系;③实验组:转染C5aR shRNA的RK3E细胞系。经脂多糖(LPS)孵育12小时后,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR检测mRNA的表达,γ计数仪测定125I标记的C5a与RK3E的结合情况。结果:与正常对照组和阴性对照组相比,实验组的细胞凋亡率显著降低(P0.01),C5aR mRNA水平显著降低(P0.01),125I标记的C5a与RK3E结合活性显著下降。结论:针对C5aR的特异性短发夹RNA可以明显引起靶基因的沉默,进而抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的发生。     

酵母菌胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因系统对人原代T细胞的作用

目的:酵母菌胞嘧啶脱氨酶基因(YCD)是新型自杀基因,利用重组逆转录病毒载体(RV),将YCD高效导入人原代T细胞,并在体内外探讨转基因T细胞的功能及"自杀"效应。方法:构建RV载体MSCV-YCD-puroR,瞬时质粒共转染法制备RV,流动感染法或Retronectin 离心法感染人原代T细胞,嘌呤霉素筛选获得T-YCD-puroR,检测转基因T细胞对肿瘤细胞的杀伤及细胞因子分泌功能,在体外和SCID小鼠体内,探讨前体药物5氟胞嘧啶(5-FC)对T-YCD-puroR细胞的杀伤效应等。结果:病毒滴度为(5.0±3.7)×106TU/mL。流动转染法对人原代T细胞的基因导入率46.0%±9.6%,2轮离心 Retronectin法的基因导入率为60.3%±7.6%(n=3)。经嘌呤霉素筛选48h获得T-YCD-puroR细胞,其基因阳性率96.7%±1.5%,并可大量扩增。与野生T细胞比较,T-YCD-puroR细胞杀伤K562肿瘤细胞的能力及细胞因子分泌功能无统计学意义。体外实验显示,与野生T细胞比较,T-YCD-puroR细胞对puromycin的IC50上升了304.9倍(0.071mg/Lvs22.3mg/L),对5-FC的IC50下降了133.3倍(656.0μmoL/Lvs4.9μmoL/L)。T-YCD-puroR细胞静脉接种于SCID小鼠,7d后每只小鼠腹腔注射5μmoL的5-FC,连续7d,首次给药24h后即可观察到SCID小鼠外周血中CD45 细胞显著下降(P<0.01)。结论:YCD自杀基因导入对人原代T细胞功能无显著影响,T-YCD-puroR细胞可以在体内外被5-FC有效杀伤。本研究为进一步研究打下了良好的基础。     

Level of functioning of siblings and parents of probands of varying degrees of retardation

A further analysis of already published data supports the position that retardates of low ability level less frequently have retarded siblings, retarded parents, and parents low in occupational level than do retardates higher in ability level. The analysis supports the position that there are two types of retarded individuals, persons retarded as a result of gene or chromosomal anomalies, brain injury, etc., who more frequently occur in the lower-level retardate group, and persons whose retardation represents polygenic segregation, who more frequently occur in the higher-level group.     

Modes of Inheritance of Errors of Refraction

Eighteen families in which both parents had refractions within the range of +4·0 D to −4·0 D and axial lengths seen in emmetropia (22·3-26·0 mm) showed coefficients of correlation of the order 0·5 indicative of polygenic inheritance. Such coefficients were seen for axial length (0·407) and for the cornea (0·487), but not for the lens (which is known to be yoked to the axial length). No such coefficients were seen in 19 families in which one of the parents had axial length outside the emmetropic range (nine families with long axes and 10 with short axes).

The pattern of polygenic inheritance for emmetropia (completely correlated optical components) and errors of refraction up to 4·0 D (inadequately correlated components: correlation ametropia) follows that seen in stature and other measurable characters. In contrast the high refractive errors with their abnormal axial lengths (component ametropia) are—like the extremes in stature—pathological anomalies with monofactorial inheritance.