Role of cardiotrophin-1 in cardiomyocytes infected by coxsackievirus

目的 探讨在柯萨奇病毒感染心肌细胞中心肌营养素-1(cardiotrophin-1,CT-1)是否通过STAT3途径发挥治疗作用.方法 建立柯萨奇B3病毒(CVB3)感染心肌细胞模型,将SD大鼠原代心肌细胞培养48 h后随机分为5组:Con组、Virus组、CT-1组、AG490组、AG490+ CT-1组.各组于相应处理后培养30 min,通过Western blot测定STAT3活化水平,分别于培养12h、24h、36 h时观察各组心肌细胞病变、搏动情况,测定乳酸脱氢酶(LDH)活性,观察细胞损伤程度.结果 Virus组、AG490+ CT-1组、AG490组心肌细胞感染CVB3后,逐步出现细胞病变,细胞搏动停止,培养液中LDH水平明显高于Con 组(P＜0.05),心肌酶逐渐升高与前一时间点比较(P＜0.05).CT-1组磷酸化STAT3( P-STAT3)水平与Con组相比明显增高(P＜0.05),心肌细胞病变明显减轻,LDH释放量显著减少,与Virus组比较差异显著(P＜0.05).AG490+ CT-1组较Con组及CT-1组STAT3磷酸化水平显著减低,心肌细胞病变明显,LDH释放量明显增高(P＜0.05),与Virus组比较无显著差异(P＞0.05).结论 CT-1在CVB3感染心肌细胞过程中具有心肌保护作用,STAT3磷酸化抑制剂AG490可阻断这一保护作用,提示在病毒感染时CT-1通过介导STAT3磷酸化发挥心肌细胞保护作用.     

CT-1反义脱氧寡核苷酸、AG490、川芎嗪抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大

目的 探讨血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)对心肌营养素-1(cardiotrophin-1,CT-1)的影响及CT-1反义脱氧寡核苷酸、AG490、川芎嗪在CT-1诱导心肌细胞肥大中的作用.方法 利用AngⅡ刺激心肌细胞造成细胞肥大、凋亡,应用CT-1反义脱氧寡核苷酸、AG490、川芎嗪进行干预.检测心肌细胞大小及3H-亮氨酸掺入率的变化;以及通过逆转录聚合酶链反应观察CT-1 mRNA表达.结果 相差显微镜下可见经AngⅡ刺激的心肌细胞面积变大,3H-亮氨酸掺入率增高;CT-1 mRNA表达增加.CT-1反义脱氧寡核苷酸组心肌细胞面积较肥大组减小,3H-亮氨酸掺入率减少;CT-1 mRNA表达亦减少.AG490和川芎嗪减小心肌细胞面积、3H-亮氨酸掺入率,但不影响CT-1 mRNA的表达.结论 CT-1参与心肌细胞肥大,CT-1反义脱氧寡核苷酸、AG490、川芎嗪可减少心肌细胞肥大.     

JAK2/STAT3通过上调Bcl-2蛋白介导TTX心肌保护作用

目的:研究JAK2/STAT3信号通路在河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)心脏停搏液心肌保护中的作用.方法:24只Wistar大鼠随机分为对照组、TTX组和TTX AG490组,每组8只.对照组:开胸取左心室肌作为缺血前对照.TTX组:建立离体心脏Langendorff-Neely灌注模型,预灌注K-H缓冲液30min后,灌注4℃ TTX心脏停搏液,停搏心脏并低温维持60min,复灌K-H缓冲液60min后,取左心室肌备用.TTX AG490组:操作同TTX组,但预灌和复灌时均在K-H缓冲液中加入JAK2抑制剂AG490(5μmol/L).采用免疫组化法测定心肌组织中p-STAT3(磷酸化STAT3)和Bcl-2表达量(Protein expression index,PEI),TUNEL检测心肌细胞凋亡指数(Apoptesis index,AI),比较2组间的变化.结果:与对照组相比,TTX组和TTX AG490组心肌组织中p-STAT3和Bcl-2的表达量均明显增加(P<0.05);予以AG490处理后,P-STAT3和Bcl-2的表达量较TTX组明显下降(P<0.05).Bcl-2蛋白表达与P-STAT3蛋白表达呈正相关(r=0.743,P<0.05).经历缺血再灌注后,TTX组和TTX AG490组心肌细胞AI明显高于对照组(P<0.05);与TTX组相比,TTX AG490组AI显著增加(P<0.05).结论:JAK2/STAT3信号通路通过上调Bcl-2的表达,抑制心肌细胞凋亡,介导TTX心脏停搏液对缺血心肌的保护作用.     

细胞因子信号抑制物SOCS1／JAB介导CT-1对心肌细胞急性缺氧复氧损伤的保护作用

目的通过使用信号抑制子(SOCS1)反义寡核苷酸干预,从细胞和分子水平阐明SOCS1如何介导CT-1对心肌细胞缺氧复氧损伤中保护作用。方法将改良法培养的出生1-3 d的乳鼠心肌细胞分为5组:①对照组:DMEM液培养6 h;②缺氧／复氧组:缺氧3 h,复氧培养3 h;⑧缺氧／复氧 CT-1组(CT-1组):缺氧3 h后,加CT-1(10ng／mL)进行复氧3 h处理;④缺氧／复氧 CT-1 反义SOCS1组(反义SOCS1组,终浓度为10μmol/L):反义SOCS1培养24 h后,缺氧3 h,加CT-1(10 ng／mL)进行复氧3 h处理;⑤缺氧／复氧 CT-1 正义SOCS1组(正义SOCS1组,终浓度为10μmol/L):加正义SOCS1培养24 h后,缺氧3 h,加CT-1(10 ng／mL)进行复氧3 h处理。MTS法测定心肌细胞的存活率,四氯四乙基苯丙咪唑基羰化氰碘化物(JC1)检测心肌细胞线粒体膜电位(mPTP),二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH CA)检测细胞活性氧(ROS),心肌细胞凋亡率用流式细胞仪检测。心肌细胞eNOSmRNA和SOCS1mRNA表达采用RT-PCR法,蛋白免疫印迹(WeStern blot)检测SOCS1和磷酸化SFAT3蛋白。结果:缺氧复氧后心肌细胞搏动频率明显减慢,搏动幅度减弱,节律不规整。心肌细胞存活率明显降低,凋亡率明显增加。CT-1处理组搏动频率与缺氧复氧组比明显加快,与对照组相近,节律较整齐。反义SOCS1干预后,频率明显减慢,搏动幅度减弱,节律明显不规则;与CT-1组比较,心肌细胞存活率下降,心肌细胞凋亡率增加,分别为(87．8％±7．5％比74．8％±5．2％;5．8％±1．5％比12．8％±1．5％,尸值均<0．05),LDH增加,正义SOCS1并不干扰CT-1的作用。缺氧复氧损伤后心肌细胞ROS水平明显升高(14．28±1．42比3．54±0．86,P<0．001),CT-1组心肌细胞ROS水平较缺氧复氧损伤组下降(6．73±1．21比14．28±3．42,P<0．01),接近空白对照组。加反义SOCS1干预后ROS水平则明显增加。流式细胞仪结果示;缺氧／复氧损伤组心肌细胞△(?)明显小于对照组, CT-1组较缺氧复氧升高(12．93±1．46比4．62±0．38, P<0．05),加反义SOCS1后△(?)水平则小于CT-1组(6．86±0．75比12．93±1．46,P<0．05)．正义SOCS1组结果与CT-1组类似。荧光显微镜结果:缺氧复氧损伤组心肌细胞绿色荧光强度明显强于对照组,表明线粒体膜转运孔mPTP受到破坏。CT-1预处理后心肌细胞JC1荧光强度明显减弱,反义SOCS1干预后,心肌细胞mPTP下降,荧光强度增强。而正义SOCS1组结果与CT-1组类似。缺氧复氧组较空白对照组SOCS1 mPNA表达和SOCS1蛋白水平有所增加;而CT-1组SOCS1 mRNA表达和SOCS1蛋白水平均较缺氧复氧组显著升高(1．596±0．065比0．639±0．063;2．568土0．219比s1．539±0．127,P<0．05),表明CT-1促进心肌细胞SOCS1表达。加SOCS1反义寡核苷酸后SOCS1mRNA和蛋白水平较CT-1组明显下降(1．596±0．065比0．896±0．065:1．945±0．158比2．568±0．219,P0．05),表明SOCSI抑制CT-1引起的STAT3磷酸化。结论细胞因子信号抑制物SOCSI介导了心肌营养素-1减轻缺氧复氧引起的心肌细胞损伤。     

白芍总苷对柯萨奇B3病毒感染大鼠原代心肌细胞的血清药理学干预

目的探讨白芍总苷（TGP）对柯萨奇B3病毒（CVB3）感染大鼠原代心肌细胞有无保护作用。方法取SD乳鼠心室肌制备大鼠原代心肌细胞,培养72h后,用不同剂量的TGP含药血清干预100 TCID50 CVB3感染心肌细胞,对比分析干扰素组、双黄连组、正常对照组。观察细胞病变,24h后测定细胞上清液中的cTnⅠ、CK、LDH以及用MTT法检测细胞存活率。结果TGP高剂量组可减轻心肌细胞病变,减少cTnⅠ、CK、LDH的释放。结论TGP对CVB3感染大鼠原代心肌细胞有保护作用。     

IL-18对感染柯萨奇B3病毒乳鼠心肌细胞的保护作用

目的　研究IL- 18抗柯萨奇B3 病毒(Coxsackie B3 virus, CVB3) 的作用。方法　将心肌细胞分为4 组。感染组: 用CVB3感染心肌细胞; 干预组: 心肌细胞感染病毒后加入IL- 18 (4~30 ng/ml); IL -18 组: 正常心肌细胞加入IL- 18 (8 ng/ml); 对照组: 正常心肌细胞。观察培养心肌细胞病变(CPE) 及心肌酶谱乳酸脱氢酶(LDH) 和磷酸肌酸激酶(CK) 的变化。并进行IL 18最大无毒剂量实验。结果　感染组感染病毒后第2、5 天心肌细胞病变程度较其余3组明显, LDH和CK浓度明显升高, 与其余3 组比较差异有极显著性意义(P<0 .01)。IL -18 浓度≥40ng/ml对正常心肌细胞有毒性作用; 在4~20 ng/ml范围内对感染心肌细胞具有保护作用。结论　IL- 18 可以抑制CVB3对心肌细胞的损伤, 对CVB3感染的心肌细胞有保护作用。     

草苁蓉提取物对感染柯萨奇B3病毒的大鼠心肌细胞抗氧化作用的影响

[目的]探讨草苁蓉提取物对柯萨奇B3病毒感染的大鼠心肌细胞的抗氧化作用。[方法]取新生SD大鼠的乳鼠心室肌制备搏动心肌细胞,培养48h后接种10^3TCID50柯萨奇B3病毒做为实验性病毒性心肌炎模型。[结果]草苁蓉提取物明显减轻感染柯萨奇B3病毒的心肌细胞病变,使细胞搏动增强,明显降低心肌细胞内的丙二醛含量,显升高超氧化物歧化酶活性。[结论]草苁蓉提取物对感染柯萨奇B3病毒的SD大鼠培养心肌细胞具有显的抗氧化作用。     

柯萨奇B3病毒mAb对心肌细胞形态及多种酶代谢的影响

目的 通过心肌细胞形态学及培养液中多种酶的变化，探讨柯萨奇B3病毒mAb对体外培养心肌细胞的作用。方法 应用间接免疫荧光法将培养小池中用冷丙酮固定的心肌细胞与自备的26种柯萨奇B3病毒mAb(CVB3-mAb)进行反应；并筛选出2种与大鼠心肌细胞结合的阳性mAb(2A3,2G12)，进一步与体外培养搏动的大鼠心肌细胞作用，观察mAb-大鼠心肌细胞培养液中心肌酶的改变，搏动百分比及细胞病变。结果 荧光显微镜下观察，有12本可与大鼠心肌细胞纤维结合，而另外14种无此结合反应。筛选出的2种CVB3－mAb加入搏动的大鼠心肌细胞中，取其不同时间细胞培养液检测。与对照组比较，心肌细胞培养液中心肌酶（CK，CK－MB，LDH，LDH－1，HBDH）及肌钙蛋白I（cTnI)等均增高（P＜0．05），并可引起心肌细胞形态改变。结论 部分病毒抗体可引起心肌细胞形态学及培养液中多种酶的改变，是引起心肌细胞进行性损伤的重要原因。     

2型糖尿病大血管病变患者血清诱导的人脐静脉内皮细胞中JAK2/STAT3信号通路的表达

目的 探讨Janus蛋白酪氨酸激酶2/信号转导子和转录激活子3(JAK2/STAT3)信号通路在2型糖尿病大血管病变发病机制中的作用.方法 取健康志愿者、单纯2型糖尿病患者和2型糖尿病大血管病变患者的血清孵育人脐静脉内皮细胞(HUVEC)24 h,通过给予JAK2特异性抑制剂AG490阻断JAK2/STAT3信号通路,并将细胞按不同处理方式分为对照组(NC组)、单纯糖尿病组(DM组)、糖尿病大血管病变组(DV组)、单纯糖尿病+AG490组(DM+AG490组)及糖尿病大血管病变+AG490组(DV+AG490组),各30例.采用实时定量PCR技术检测各组细胞JAK2、STA T3、血管内皮生长因子(VEGF)和血管内皮生长因子受体(FLT1)mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测JAK2、STAT3和磷酸化STAT3 (p-STAT3)蛋白表达量.结果 与NC组比较,DM组和DV组HUVEC细胞内JAK2、STA T3mRNA和JAK2、p-STAT3的蛋白表达水平均上调(P＜0.05),且DV组JAK2、STA T3 mRNA和JAK2、p-STAT3蛋白表达水平均高于DM组(P＜0.05).DM+AG490组和DV+AG490组的JAK2、STA T3 rnRNA和JAK2、p-STAT3蛋白表达水平分别低于DM组、DV组(P＜0.05).与NC组和DM组比较,DV组VEF和FLT1 mRNA的表达水平上调(P＜0.05);而与DV组比较,DV+AG490组VEGF和FLT1 mRNA的表达水平均下调(P＜0.05).结论 JAK2/STAT3信号通路可能参与2型糖尿病大血管病变的发病过程.     

B组柯萨奇病毒对心肌细胞感染模式的研究

目的观察B组柯萨奇病毒（Coxsackie virusB,CVB）在原代心肌细胞中的感染特点,从而研究CVB对心肌细胞的致病机制。方法原代培养Balb／c乳鼠心肌细胞,并获得纯化的心肌细胞。使用B组柯萨奇病毒嗜心肌毒株3型（CVB3m）攻击原代心肌细胞,观察病毒感染心肌细胞后心肌细胞的细胞病变、超微结构和心肌酶的变化。结果成功原代培养了Balb／c乳鼠心肌细胞。心肌细胞在病毒感染后,细胞病变（CPE）不明显,与在HeLa等细胞中的典型CPE不同。心肌细胞在CVB3m感染后保持细胞形态和博动超过2周时间。电镜显示心肌细胞结构正常,细胞器数量增加,在心肌细胞胞质中可见晶格样病毒颗粒排列。培养细胞的上清液中心肌酶升高。结论CVB在原代心肌细胞中表现为持续感染,CVB在心肌细胞中的致病机制不同于HeLa细胞。