不同培养条件下人脐血间充质干细胞的差异

目的：观察不同条件对人脐血间充质于细胞培养的影响。方法：实验于2004—10／2005—10在首都医科大学组织学胚胎学教研室实验室完成。①用复方枸橼酸血液保存液和肝素钠两种不同的抗凝血剂保存的人脐带血，经密度梯度离心法分离新鲜脐带血，获取的单个核细胞，经椎虫蓝染色进行活细胞计数，比较所获得的单个核细胞数。②用不同密度1&;#215;10^9L^-1，2&;#215;10^9L^-1,5&;#215;10^9L^-1接种单个核细胞，倒置显微镜下观察细胞形态。用流式细胞仪检测所培养的细胞免疫表型。③分别用高糖和低糖DMEM培养液（含体积分数0．1的胎牛血清）培养单个核细胞，其他条件相同，从72h后对所形成的细胞克隆进行计数，对两种培养基形成的细胞克隆和生长状况进行比较。结果：①不同抗凝血剂抗凝的人脐带血所获得的单个核细胞数及细胞生长状态：用肝素钠抗凝血剂保存的人脐带血所获得的单个核细胞数和细胞生长状态明显优于用复方枸橼酸血液保存液保存的人脐带血（P〈0．05）。②不同接种密度人脐血间充质干细胞的贴壁生长状态及人脐血间充质干细胞的免疫表型：较低密度接种细胞并不能形成大量贴壁细胞，而以5&;#215;10^9L^-1密度接种，72h后单个核细胞开始贴壁并开始形成细胞克隆，在10d后出现梭形细胞，培养过程中细胞形态逐渐形成均一梭形。用流式细胞仪检测所培养的细胞为非造血间充质干细胞。③两种培养基形成的细胞克隆数和生长状况：在10d以后，用低糖DMEM组培养的单个核细胞形成的细胞克隆数与高糖DMEM组相比较差异有显著性意义（P〈0．05）。结论：①肝素钠作为人脐带血保存液能获得大量的单个核细胞，有利于人脐血间充质干细胞的培养。②5&;#215;10^9L^-1。细胞接种密度有利于人脐血间充质干细胞贴壁生长。③用低糖DMEM作为培养人脐血间充质干细胞的培养基有利于细胞克隆的形成和维持，对保持人脐血间充质干细胞特性有良好作用。     

脐血间充质干细胞培养体系的建立

目的:寻找脐带血来源的间充质干细胞体外分离、纯化及培养的条件,以建立稳定的体外培养体系,满足实验和临床的需要。方法:实验于2005-06/2006-04在青岛大学医学院附属医院儿科研究所完成。脐带血36份,50～60mL/份,取自青岛大学医学院附属医院产科健康产妇正常足月顺产或剖宫产分娩婴儿的脐带血,经产妇本人及家属同意。无菌条件下取正常足月剖宫产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞。16份脐血每份分为3组,分别以间充质干细胞接种密度1×107L-1、1×109L-1、1×1011L-1接种于未包被6孔培养板内,加入5%胎牛血清的DMEM-LG培养。20份脐血每份分为3组,以1×1011L-1单个核细胞密度分别加入5%、10%和20%胎牛血清的DMEM-LG接种于胎牛血清包被的6孔培养板内培养。采用常规的间充质干细胞培养Friedenstein法进行脐血间充质干细胞的培养和扩增培养。观察不同脐血单个核细胞的接种密度、培养液胎牛血清浓度和胎牛血清包被培养皿对间充质干细胞培养的影响。结果:①胎牛血清未包被组以1×107L-1和1×109L-1接种组培养7d后贴壁数量很少,贴壁的细胞未长满瓶底即死亡,无法传代。1×1011L-1组贴壁细胞较多,间充质样细胞与破骨样细胞并存。1×1011L-1组分5%、10%、20%3种血清浓度,贴壁细胞均较多,以间充质干细胞为主,胎牛血清浓度5%组间充质干细胞的纯度较10%及20%组高,破骨样细胞相对较少;胎牛血清包被组与未包被组相比,贴壁细胞少,培养的间充质干细胞纯度较高,破骨样细胞相对较少。②流式细胞仪检测脐血间充质干细胞的免疫表型,结果显示,脐血P3代间充质干细胞不表达或极弱表达CD34、CD45、CD106等造血细胞标志,稳定地高表达CD29、CD44、CD105等间充质细胞相关的表面抗原标记物。结论:将脐血单个核细胞以1×1011L-1高密度接种在5%低胎牛血清浓度的低糖DMEM培养基中、胎牛血清包被培养瓶等条件下,可以在体外成功的培养出较纯化的脐血间充质干细胞,其培养成功率和间充质干细胞纯度较高。     

影响脐血间充质干细胞分离培养的关键环节

背景:脐血中存在间充质干细胞,目前国内外尚未见到对脐血间充质干细胞体外分离、培养及扩增较统一且有效的方法.目的:探讨影响人脐血间充质干细胞成功分离培养的相关因素.方法:分别从不同胎龄(≥40周,37周和≤32周),脐血中单个核细胞数量(≥2.5× 109 L-1,< 2.5×109 L-1),不同细胞接种浓度(1×107,1×109,1×1011 L-1),不同体积分数胎牛血清(5%,10%,15%,20%)以及培养瓶是否被胎牛血清包被等方面对人脐血间充质干细胞分离培养成功率进行比较.结果与结论:脐血间充质干细胞的分离培养成功率为58.3%,且随胎龄的增高而培养成功率降低(P < 0.01);脐血中单个核细胞浓度≥2.5×109 L-1组培养成功率高于< 2.5×109 L-1组(P < 0.01);相同容量脐血中单个核细胞数量与胎龄呈负相关(r = -0.95,P < 0.01);1×1011 L-1组原代及传代培养的间充质干细胞生长及扩增情况高于1×107,1×109 L-1;体积分数5%FBS组间充质干细胞贴壁速度较其他3组略慢,但细胞纯度较高,且细胞传代速度与其他3组无明显差别;胎牛血清包被组脐血间充质干细胞原代和传代后的纯度及扩增能力均高于未包被组.提示脐血间充质干细胞分离培养成功率受多种因素的影响:通过选择较低胎龄的胎儿,采集足够量的脐血,以较高的细胞密度接种,培养基中添加较低浓度的胎牛血清,并将培养瓶预先用胎牛血清进行包被,能在体外建立稳定的脐血间充质干细胞培养体系.     

影响脐血间充质干细胞分离培养的关键环节

背景：脐血中存在间充质干细胞,目前国内外尚未见到对脐血间充质干细胞体外分离、培养及扩增较统一且有效的方法。目的：探讨影响人脐血间充质干细胞成功分离培养的相关因素。方法：分别从不同胎龄（≥40 周,37 周和≤32 周）,脐血中单个核细胞数量（≥2.5×109L-1,〈2.5×109 L-1）, 不同细胞接种浓度（1×107,1×109,1×1011 L-1）,不同体积分数胎牛血清（5%,10%,15%,20%）以及培养瓶是否被胎牛血清包被等方面对人脐血间充质干细胞分离培养成功率进行比较。结果与结论：脐血间充质干细胞的分离培养成功率为 58.3%,且随胎龄的增高而培养成功率降低（P〈0.01）;脐血中单个核细胞浓度≥2.5×109 L-1组培养成功率高于〈2.5×109 L-1组（P〈0.01）;相同容量脐血中单个核细胞数量与胎龄呈负相关（r=-0.95,P〈0.01）;1×1011 L-1 组原代及传代培养的间充质干细胞生长及扩增情况高于 1×107,1×109 L-1;体积分数 5%FBS 组间充质干细胞贴壁速度较其他 3 组略慢,但细胞纯度较高,且细胞传代速度与其他 3 组无明显差别;胎牛血清包被组脐血间充质干细胞原代和传代后的纯度及扩增能力均高于未包被组。提示脐血间充质干细胞分离培养成功率受多种因素的影响：通过选择较低胎龄的胎儿,采集足够量的脐血,以较高的细胞密度接种,培养基中添加较低浓度的胎牛血清,并将培养瓶预先用胎牛血清进行包被,能在体外建立稳定的脐血间充质干细胞培养体系。     

不同培养基培养人脐血间充质干细胞的差异

背景：脐血间充质干细胞为干细胞领域的研究热点,但目前传代及扩增此类细胞尚无简单、有效、完美培养方法.目的：采用不同的培养基分离培养融合状态的间充质干细胞,以筛选一种较好的体外培养人脐血间充质干细胞的方法.方法：无菌条件下取正常足月剖宫产新生儿的脐血,随机分为5组：低糖DMEM（Dulbecco改良的Eagle培养基）组、高糖DMEM组、α-DMEM组、低糖DMEM＋干细胞因子组、低糖DMEM＋骨髓间充质干细胞培养上清组.用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞.将脐血单个核细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清的上述培养基中,放置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养,倒置显微镜观察细胞数量和形态的变化并用流式细胞技术分析细胞的表面抗原.结果与结论：①各组间充质干细胞培养48 h后贴壁细胞数和细胞存活率的比较：低糖DMEM＋干细胞因子组、低糖DMEM＋骨髓间充质干细胞培养上清组的贴壁细胞数明显多于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组（P〈0.05）,细胞存活率亦明显高于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组（P〈0.05）.②各组间充质干细胞在不同培养时间下生长状态的比较：培养第3,6,9,12,15,18,21天低糖 DMEM＋干细胞因子组、低糖 DMEM＋骨髓间充质干细胞培养上清组细胞增殖的速度均快于低糖DMEM组、高糖DMEM组、α-DMEM组（P 〈0.05）.低糖DMEM＋干细胞因子组与低糖DMEM ＋骨髓间充质干细胞培养上清组比较差异无显著性意义.结果可见人脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞培养上清或干细胞因子共孵育,对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用.     

人脐血间充质细胞体外分离培养方法及培养基特性

目的:采用不同的培养基分离培养融合状态的间充质细胞,以筛选一种较好的体外培养人脐血间充质细胞的方法。方法:实验于2003-11/2004-10在郑州大学医学院干细胞中心完成。选择郑州大学医学院第三附属医院产科足月妊娠健康产妇的脐血用于实验(产妇均签署知情同意书),随机分为4组:低糖DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)组、高糖DMEM组、低糖DMEM+干细胞因子组、MsencultTM(一种特殊成分的液体培养基,与其添加物配合使用可促进间充质干细胞分化为脂肪细胞)组。待新生儿娩出后,立即断脐,消毒母侧脐带断端,60mL无菌注射针穿刺脐静脉取血,立即导入肝素抗凝的无菌采血袋内。取新鲜采集的脐带血,用1.077g/cm3的淋巴细胞分层液,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,将脐血单个核细胞接种于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱内培养,倒置显微镜观察细胞数量和形态的变化。结果:①各组间充质细胞培养24h后贴壁细胞数和细胞存活率的比较:MsencultTM组、低糖DMEM+干细胞因子组的贴壁细胞数明显多于高糖DMEM组、低糖DMEM组[(40.5±9.7),(31.5±4.2),(14.0±1.4),(7.5±1.6)个,P<0.05],细胞存活率亦明显高于高糖DMEM组、低糖DMEM组[(97.1±0.9),(95.3±2.6),(84.1±1.9),(81.2±1.1)%,P<0.05]。②各组间充质细胞在不同培养时间下生长状态的比较:培养第3,7,10,14天MsencultTM组、低糖DMEM+干细胞因子组细胞增殖的速度均快于高糖DMEM组、低糖DMEM组(P<0.05),且MsencultTM组细胞克隆数最多[(1±1.22),(0.83±0.75),(0.2±0.4),0个,P<0.05]。结论:采用低糖DMEM+干细胞因子与单纯MesencultTM培养基培养的细胞生长旺盛,但由于干细胞因子用量较大,价格昂贵,因此低糖DMEM联合应用干细胞因子的方法并不十分适用。而MesencultTM为酸性培养基,有利于脐血细胞的生长,并可形成克隆,为脐血间充质细胞的成功培养创造了条件,是一种适合脐血间充质细胞生长的培养基。     

人脐血非造血干细胞的基本特性

目的:通过对体外培养人脐血来源非造血干细胞生长特性的观察和对细胞免疫表型的检测,探讨人脐血来源非造血干细胞的一般特性,为进一步研究人脐血来源非造血干细胞提供依据。方法:实验于2005-01/10在首都医科大学北京神经科学研究所和首都医科大学组织学胚胎学教研室实验室完成。脐带血由首都医科大学附属天坛医院提供,经密度梯度离心法分离新鲜脐带血,获取的单个核细胞进行培养。①倒置显微镜下观察细胞形态。②培养基中加入白血病抑制因子或用Mescencult间充质干细胞培养基进行培养,记录细胞生长状况。③流式细胞术分析脐血单个核细胞的免疫表型。结果:①人脐血非造血干细胞形态观察:较低密度接种细胞并不能形成大量贴壁细胞,而以5×106细胞密度接种则在48～72h后出现贴壁的梭形细胞,培养过程中细胞形态逐渐形成均一梭形。②生长特性:人脐血非造血干细胞接种5d后增殖速度加快,随后的几天内保持较快的增殖速度,15d后进入平台期。高糖DMEM培养基 胎牛血清和高糖DMEM培养基 胎牛血清 白血病抑制因子,两种培养体系在细胞增殖上未显示差异,白血病抑制因子并没有显著改善人脐血非造血干细胞生长增殖速度。③免疫表型:新鲜脐血经分离得到的单个核细胞中有少量CD34阳性细胞,CD90,CD166阳性细胞比例分别为(24.18±5.46)%和(36.44±6.26)%;人脐血非造血干细胞体外培养10d左右无CD34阳性细胞,CD166阳性细胞的比例达(76.48±4.54)%,较单个核细胞中CD166阳性细胞比例明显增高,并且表达HLA-ABC,而少量表达HLA-DR。结论:合适的细胞接种密度有利于人脐血非造血干细胞贴壁生长。白血病抑制因子并不能增加体外培养的人脐血非造血干细胞的生长增殖速度。人脐血非造血干细胞体外培养10d左右可以获得纯度较高的CD166阳性细胞。     

骨髓与脐带血间充质干细胞的生物学特性比较

目的:为寻找最佳的间充质干细胞来源,比较脐带血来源间充质干细胞与骨髓来源间充质干细胞在生长、细胞表型及多项分化功能方面的差别.方法:实验于2006-06/2007-03在南昌大学医学院第二附属医院分子实验室、江西省医学分子重点实验室,省级重点实验室完成.[1]实验材料:脐带血30份及正常骨髓30份均取自正常自愿捐献者,实验经医院伦理委员会批准.[2]实验方法:无菌条件下采集脐血及骨髓,分离单个核细胞.将脐血及骨髓单个核细胞以1×109L-1接种于培养瓶中,加入含体积分数0.20自体血清,1mmol/L氢化可的松的IMDM培养液,7d后换液,去除悬浮细胞,以后每三四天换液1次,待细胞90%融合后,经胰蛋白酶 乙二胺四乙酸混合消化,传代培养,取第3代细胞,采用流式细胞术鉴定脐带血来源间充质干细胞表面分子,并比较两种不同来源间充质干细胞的生长特点及向脂肪细胞分化能力的差别.结果:[1]骨髓来源间充质干细胞在较早阶段形态即成长梭形,第3代后与脐带血来源间充质干细胞形态无明显差别.[2]培养至第3代的间充质干细胞表面分子检测与脐血单个核细胞比较结果显示,CD166、CD29、CD54表达增高,CD13、CD34、CD45表达降低.[3]脐带血来源间充质干细胞培养的成功率低于骨髓来源间充质干细胞,在较早阶段脐带血来源间充质干细胞增殖快于骨髓来源间充质干细胞,但后期培养过程中脐带血来源问充质干细胞增殖慢于骨髓来源间充质干细胞,两种来源间充质干细胞均能分化为脂肪细胞,且分化能力无明显差别.结论:脐血来源间充质干细胞作为一种新来源的间充质干细胞在生长速度、培养成功率上虽然低于骨髓来源间充质干细胞,但在细胞表型及分化功能方面无明显差别.     

冻存人脐血间充质干细胞向类肝细胞的诱导分化

目的分离培养人脐血间充质干细胞,观察其冻存复苏后向肝细胞定向分化的能力.方法实验于2004-01/2006-01在四川大学华西医院感染性疾病中心生物治疗国家重点实验室进行.采用密度梯度离心与直接贴壁相结合的方法,1×107 L-1和1×108 L-1两种接种密度进行人脐带血间充质干细胞的分离,观察细胞生长及检测其表面抗原.将第6代的人脐带血间充质干细胞采用梯度冷冻技术冻存6个月,复苏后培养至第8代时,加入肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子-4联合诱导28 d.将第8代人脐带血间充质干细胞爬片与诱导28 d后的类肝细胞爬片共培养,第8代人脐带血间充质干细胞爬片与未诱导培养28 d的人脐带血间充质干细胞爬片共培养作为阴性对照.检测加入肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子4后不同时间点及共培养28 d后的人脐带血间充质干细胞中CK8&18、白蛋白和糖原的表达.结果①密度梯度离心收获的单个核细胞培养传代后,能获得均-贴壁的间充质干细胞,第5代细胞中,CD44阳性的细胞达97.9%.②人脐血间充质干细胞冻存复苏后,活细胞约为70%,复苏后接种密度为1×107 L-1的生长状态优于1×108 L-1.③添加肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子4后,可以在细胞内检测到CK8&18、白蛋白及糖原的表达.④与类肝细胞共培养28 d后,人脐血间充质干细胞中小部分细胞中同时表达CK8&18和白蛋白,并有糖原的表达.结论人脐血间充质干细胞可采用密度梯度离心法结合直接贴壁法分离获得,并可冷冻保存;复苏后在肝细胞生长因和成纤维细胞生长因子4的联合诱导下,能定向分化为表达CK8&18,并合成白蛋白和糖原的类肝细胞,类肝细胞可能具有诱导人脐血间充质干细胞向肝系细胞定向分化的作用.     

人脐血非造血干细胞的基本特性

目的：通过对体外培养人脐血来源非造血干细胞生长特性的观察和对细胞免疫表型的检测，探讨人脐血来源非造血干细胞的一般特性，为进一步研究人脐血来源非造血干细胞提供依据。 方法：实验于2005-01／10在首都医科大学北京神经科学研究所和首都医科大学组织学胚胎学教研室实验室完成。脐带血由首都医科大学附属天坛医院提供，经密度梯度离心法分离新鲜脐带血，获取的单个核细胞进行培养。①倒置显微镜下观察细胞形态。②培养基中加入白血病抑制因子或用Mescencult间充质干细胞培养基进行培养，记录细胞生长状况。③流式细胞术分析脐血单个核细胞的免疫表型。 结果：①人脐血非造血千细胞形态观察：较低密度接种细胞并不能形成大量贴壁细胞，而以5&;#215;10^6细胞密度接种则在48-72h后出现贴壁的梭形细胞：培养过程中细胞形态逐渐形成均一梭形。②生长特性：人脐血非造血干细胞接种5d后增殖速度加快，随后的几天内保持较快的增殖速度，15d后进入平台期。高糖DMEM培养基＋胎牛血清和高糖DMEM培养基＋胎牛血清＋白血病抑制因子，两种培养体系在细胞增殖上未显示差异，白血病抑制因子并没有显著改善人脐血非造血干细胞生长增殖速度。③免疫表型：新鲜脐血经分离得到的单个核细胞中有少量CD34阳性细胞，CD90，CD166阳性细胞比例分别为（24．18&;#177;5．46）％和（36．44&;#177;6．26）％；人脐血非造血干细胞体外培养10d左右无CD34阳性细胞，CDl66阳性细胞的比例达（76．48&;#177;4．54场，较单个核细胞中CDl66阳性细胞比例明显增高，并且表达HLA-ABC，而少量表达HLA-DR。 结论：合适的细胞接种密度有利于人脐血非造血干细胞贴壁生长。白血病抑制因子并不能增加体外培养的人脐血非造血干细胞的生长增殖速度。人脐血非造血干细胞体外培养10d左右可以获得纯度较高的CD166阳性细胞．