Resistin基因对TNF-α诱导血管内皮细胞ICAM-1表达的影响

目的:研究抵抗素(resistin)基因对TNF-α诱导血管内皮细胞ECV304表达细胞闻黏附分子1(ICAM-1)的影响.方法:应用分子生物学技术,将resistin基因克隆到载体pEGFP-C1中构建质粒pEG/Resi,脂质体转染ECV304,转染6 h加入20 μg/L TNF-α诱导.用RT-PCR方法分别检测转染18、30、42和54h时resistin和ICAM-1 mRNA表达;同时用免疫印迹法检测resistin蛋白的表达,并用ELISA方法检测各期ECV304上清ICAM-1蛋白表达.结果:经酶切鉴定和测序证实质粒pEG/Resi构建成功并可在ECV304中表达;相同TNF-α诱导条件下转染resistin基因组的ICAM-1表达水平始终高于未转染组,在resistin基因表达高峰(30和42 h)ICAM-1 mRNA和蛋白表达量较未转染组均显著升高(P＜0.05);且ICAM-1 mRNA和蛋白表达水平均随resistin基因表达量的增加而升高.结论:Resistin基因能够增强TNF-α诱导ECV304细胞表达ICAM-1.     

烟碱诱导基因的差异表达

目的 通过测定分析烟碱诱导出现的差异表达片段的序列,观察与烟碱相关的动脉粥样硬化的致病基因。方法 提取以烟碱处理培养的胎儿脐静脉内皮细胞的RNA,利用mRNA差异显示技术显示差异表达cDNA片段（EST）,经Northern 印迹证明并测序,经基因库比较查询。结果 发现60条EST,Northern 印迹证实23条cDNA确属差异表达片段,测序发现11条未见报道同源序列的EST。结论 确定了11条差异表达片段的序列,为全长cDNA筛选和克隆打下基础。     

银杏黄酮苷元对内皮细胞植物血凝素样低密度脂蛋白受体-1表达的影响

目的：探讨银杏黄酮苷元对氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）诱导脐静脉内皮细胞株ECV304植物血凝素样低密度脂蛋白受体-1（Lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1,LOX-1）表达的调节作用。方法：应用逆转录聚合酶链式反应、SP免疫组织化学法,探讨ox-LDL诱导下内皮细胞表达LOX-1及银杏黄酮苷元的干预作用。结果：6.25~25 mg/L银杏黄酮苷元与脐静脉内皮细胞株ECV304共同培养6~48 h可显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞LOX-1mRNA和蛋白表达（P〈0.05）,具有浓度、时间效应关系（P〈0.05）;LOX-1拮抗剂聚肌苷酸可抑制ox-LDL诱导的内皮细胞LOX-1mRNA和蛋白表达（P〈0.05）。结论：ox-LDL可能通过LOX-1导致内皮功能障碍,银杏黄酮苷元可显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞LOX-1表达,这可能是其抗动脉粥样硬化的机制之一。     

TNF-α和IL-1β对人脐静脉内皮细胞 蛋白C受体mRNA表达的影响

目的：观察肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素 1β（IL-1β）对人脐静脉内皮细胞 （ECV304）蛋白C受体（EPCR）mRNA表达的影响。方法：通过体外培养ECV304细胞,分别以含 TNF-α和IL-1β的培养基孵育ECV304细胞,行剂量和时间依赖性实验。采用实时定量聚合酶链反 应（quantitative real-time PCR ）技术测定 ECV304 细胞 EPCR mRNA 的表达。结果：TNF-α和 IL-1β均能显著下调 ECV304 EPCR mRNA 的表达,并呈剂量和时间依赖性（P<0.05）。结论： TNF-α和IL-1β可能通过显著下调ECV304上EPCR mRNA的表达而成为损伤内皮细胞功能的一 个新作用机制。     

低氧诱导因子基因重组腺病毒载体的构建及其在内皮细胞中的表达

目的：构建携带低氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因的腺病毒载体（pAdxsi-GFP-HIF）,观察其在内皮细胞中的表达。 方法：低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA,以之作为模板,依据基因库公布的HIF-1α cDNA 设计引物,分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建穿梭质粒pShuttle-GFP-HIF。采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架载体上构建携带HIF-1α基因的重组腺病毒载体。检测重组腺病毒效价后,转染人脐静脉内皮细胞ECV304,检测目的基因的转染表达。 结果：通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF-lα基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、效价高。以100 MOI转染ECV304细胞24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,转染48 h时荧光表达更强,且培养上清液中HIF-1蛋白表达水平为（48.93±3.86）ng/mL。 结论：本实验构建的携带HIF-1α基因的腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF转染效率及目的基因的蛋白表达水平均较高,有望应用于缺血缺氧组织局部。     

人内皮细胞特异性分子-1的转染及其在ECV304中的表达

目的构建人内皮细胞特异性分子-1(ESM-1)真核表达载体,转染人脐静脉内皮细胞系ECV304,并在ECV 304中获得表达. 方法将ESM-1 cDNA插入真核载体pIRES的多克隆位点中,转染人脐静脉内皮细胞.原位杂交,免疫组化检测ESM-1基因的表达.结果构建的表达载体经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列分析证实,转染后发现ESM-1的表达在转录和蛋白水平都明显的增加. 结论成功构建了人 ESM-1真核表达载体和转染了人脐静脉内皮细胞系ECV304, 并获得高水平的表达,为进一步研究作好准备.     

全反式维甲酸诱导胶质瘤细胞增殖相关基因的差异表达

目的筛选全反式维甲酸诱导胶质瘤细胞所致增殖相关差异表达基因,为进一步研究胶质瘤进展的基因通路及机制提供依据。方法通过运用cDNA微阵列技术比较10μmol／L全反式维甲酸处理前后胶质瘤SHG-44细胞（WHOIV级）的基因表达谱,鉴定与胶质瘤增殖相关的差异表达基因。随机选择数个差异表达基因进行Northern杂交实验,以验证cDNA微阵列结果的可靠性。结果实验鉴定出42个差异表达基因,其中表达上调28个、下调14个。5个差异表达基因：MDM2、PDCD5、SOD2、SERPINF1和MAPK11与胶质瘤的增殖相关。结论初步揭示全反式雏甲酸能诱导胶质瘤细胞增殖相关基因的差异表达,提示前述差异表达基因可能与胶质瘤的进展有关。     

p38MAPK在脂多糖诱导的人内皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶中的作用

目的：研究P38丝裂原激活蛋白激酶（P38MAPK）在脂多糖（LPS）诱导的人内皮细胞－ECV304诱导一氧化氮合酶（iNOS)表达的一氧化氮（NO）产生中的作用，方法：用Griess法检测人内皮细胞培养液中NO水平，分别用免疫荧光法和RT－PCR检测细胞iNOS蛋白和mRNA的表达，采用免疫沉淀法检测细胞p38MAPK的活性，结果：与对照组相比，LPS刺激后的ECV304细胞iNOS蛋白和mRNA的表达显著增加，用p38特异性抑制剂SB2023580预处理后，可以显著抑制细胞iNOS的表达和NO的产生，LPS 刺激内皮细胞后15min,p38MAPK的活性达到高峰，维持45min后逐渐下降，结论：p38MAPK参与与LPS诱导的内皮细胞iNOS的表达和NO的产生，可通过阻断信号转导通路来减少iNOS及其他细胞因子的产生，为败血症休克的防治提供一条新的思路。     

姜黄素抑制ECV304细胞增殖及对基质金属蛋白酶2表达的影响

目的：探讨姜黄素对人脐静脉内皮细胞（ECV304）的作用以及对ECV304表达的基质金属蛋白酶2（MMP-2）的影响。方法：采用MTT法，台盼蓝染色法测定姜黄素对ECV304的量效关系和时效关系，Giemsa染色观察姜黄素对ECV304的抑制作用；通过RT-PCR检测姜黄素作用ECV304后MMP-2mRNA表达，明胶酶谱法检测MMP-2的活性，免疫组化检测细胞MMP-2表达。结果：姜黄素对ECV304的押制作用呈浓度依赖性和时间依赖性，Giemsa染色显示浓度为8μg/mL和10μg／mL的姜黄素可诱导ECV304凋亡，凋亡率分别是21．6％和34．7％；在10μg／mL姜黄素作用24h下，MMP-2的mRNA显著减少，其分解明胶的活性也显著降低，免疫组化显示与阴性对照组相比内皮细胞MMP-2表达减少。结论：姜黄素能够抑制血管内皮细胞的生长、降低血管内皮细胞MMP-2的表达。     

内皮抑素基因腺病毒载体的构建及表达

目的：构建人内皮抑素（Human Endostatin，hE）基因的腺病毒载体，并研究其对胃癌细胞株SGC-7901、MKN-45及人脐静脉内皮细胞系ECV304生物学特性的影响。方法：采用Lipofectamine2000法将含有人内皮抑素基因的质粒pCA13-hE与pBGHE3共同转染293细胞；免疫荧光法及Western Blot检测hE的表达；用不同感染复数（Muhiplicity of infection，MOI）的重组人内皮抑素基因的腺病毒感染ECV304细胞，观察细胞生长。结果：成功构建了含hE基因的腺病毒载体；经含hE基因腺病毒载体感染的人SGC-7901胃癌细胞株、MKN-45胃癌细胞株均表达hE蛋白；表达的hE蛋白具有一定的生物学活性，可以抑制人静脉内皮细胞系ECV304的生长。结论：获得了有表达功能活性的Endostatin腺病毒载体，表达产物可抑制ECV304细胞的增殖，为肿瘤的抗血管基因治疗提供了必要条件。     

应用差异显示法研究低密度脂蛋白诱导内皮细胞差异表达基因

目的 克隆、分离血管内皮细胞在致动脉粥样硬化因素作用下差异表达的基因。了解动脉粥样硬化发生的分子机制。方法 培养血管内皮细胞系（ＥＣＶ３０４）在低密度脂蛋白（ＬＤＬ）的诱导下,用改进的差异显示－聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术分析表达水平明显差异的ｃＤＮＡ。对差异显示基因进行序列测定和同源比较。用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ证实差异显示基因片段。结果 ＬＤＬ诱导ＥＣＶ３０４细胞出现 上调和下调表达的ｃＤＮ     

人成骨肉瘤MG-63细胞雌激素相关基因的分离

目的 :筛查 17β雌二醇 (17β estradiol,E2 )诱导人成骨肉瘤MG 6 3细胞株差异表达cDNA片段 ,寻找雌激素相关基因。方法 :改良的cDNA代表性差异分析法 (cDNArepresentationaldifferenceanalysis,cDNARDA)分离E2 干预MG 6 3细胞株表达上调cDNA片段 ,经Southern和快速Northern杂交证实表达上调的cDNA片段来源后 ,将其克隆到 pGEM Teasy载体 ,蓝白筛选后挑取阳性克隆进行测序和同源比较分析 ,最后选取其中部分克隆行Northern印迹杂交。结果 :第 4轮消减杂交得到 5个E2 诱导人成骨肉瘤MG 6 3细胞表达上调的差异cDNA条带 ,Southern和快速Northern杂交证明表达上调的cDNA片段来自E2 干预的MG 6 3细胞 ;随机选 2 5个克隆测序得到13个序列 ,7个与已知基因高度同源 ;其中 2个克隆经Northern杂交证实E2 干预后表达上调。结论 :cDNARDA能有效筛查差异表达基因 ,人成骨肉瘤MG 6 3细胞中某些基因受雌激素诱导表达上调 ,可能与绝经后骨质疏松的发病相关。     

cDNA representational difference analysis of differentially expressed cDNA sequences in human nasopharyngeal carcinoma

ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｅａｒｃｈｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｃｏｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＮＰＣ）,ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｃａｎｄｉ...     

Over-expressed genes detected by suppression subtractive hybridization in carcinoma derived from transformed 16HBE cells induced by BPDE

To screen the over differentially expressed genes in carcinoma induced by BPDE-transformed 16HBE cells （16HBE-C cells）. Methods The suppression subtractive hybridization （SSH） method was performed to profile differentially expressed genes between 16HBE-C cells and 16HBE cells. The cDNA fragments of differentially expressed genes were inserted into TA cloning vector and transformed competent E. coli strain. Positive clones were randomly picked up and identified by the colony PCR method. Dot blot was used to test the same source with the tester. The differentially expressed cDNA fragments were sequenced and compared with known genes and EST database in Genbank. Results Eight known genes were over-expressed in 16HBE-C cells including eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1, HIF-1 responsive RTP801, ribosomal protein L10 （RPL10）, ribosomal protein S29 （RPS29）, mitochondrion related genes, and laminin receptor 1. Three differentially expressed cDNA fragments could not be matched to the known genes but to the EST database. Conclusion The SSH method can detect differentially expressed genes between 16HBE-C and 16HBE cells. BPDE-induced carcinogenesis may be related to alteration of at least eight known genes and three unknown genes. These expression data provide a clue to further cloning novel genes and studying functions in BPDE-induced carcinoma.     

氧化低密度脂蛋白功能性调节人内皮细胞的生长调节致癌基因α

目的　探讨oxLDL对人内皮细胞的CXC亚家族趋化因子GROα的调节作用及生理意义。方法　超高速离心得LDL ,氧化后得oxLDL。逆转录PCR分析人内皮细胞系ECV30 4细胞GROαmRNA。GAPDH被用作PCR中正常改变的对照物。酶联免疫检测仪测定ECV30 4细胞表面连接及分泌到溶液中的GROα蛋白。静态细胞粘附试验测定ECV30 4细胞表面连接的GROα蛋白的生理意义。结果　正常ECV30 4细胞不表达GROαmRNA ;OxLDL显著调节其表达 ,诱导效应首先出现在处理后 1h ,最大在 2h ,在 4h时下降。相比较 ,LDL对其mRNA表达没有影响。正常ECV30 4细胞低水平表达细胞表面的GROα蛋白。OxLDL呈浓度依赖性、时间依赖性地上调其表面的GROα蛋白。相比较 ,LDL对其表面表达的GROα蛋白无调节作用。OxLDL对ECV30 4细胞分泌到细胞溶液中GROα蛋白很少有影响。 4 0 μg/mloxLDL处理ECV30 4细胞 2 4h ,造成显著的人单核细胞系U937细胞粘附到ECV30 4细胞数目的增加。用GROα抗体预处理oxLDL刺激的ECV30 4细胞 ,可显著减低U937细胞粘附到ECV30 4细胞的U937细胞数目 (大约 2 / 3)。结论　oxLDL可能功能性上调内皮细胞GROα的表达。     

ESM-1在转染MEK基因的ECV304细胞中的表达

目的探讨内皮细胞特异性分子-1（ESM-1）在转染MEK基因的人脐静脉内皮细胞中的表达,探讨ESM-1的表达是否受分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号转导通路的调节。方法脂质体转染高活性的MEK基因人ECV304细胞,Western blot检测ESM-1在ECV304细胞中的表达。结果成功获得稳定转染高活性MEK基因的细胞株,并检测到胞外信号调节的激酶（ERKs）的表达量在二株细胞中没有变化,而pERK-2和ESM-1在转染MEK基因的细胞中表达高于未转染的细胞。结论ESM-1可能处于ERK-2的下游,其表达可能受MAPK信号转导通路的调节。     

抑制性消减杂交法构建甲状腺癌差异表达基因文库

目的：筛选并克隆在甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的基因。方法：(1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差示表达分析,构建人甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的cDNA消减文库;(2)克隆、鉴定甲状腺癌组织特异性高／低表达的基因;(3)登录Genbank,运用Blastn程序进行同源性分析。结果：成功构建了高消减效率的人甲状腺癌cDNA消减文库,对其中数个克隆的插入cDNA片段进行测序,经检索Genbank表明,正向SSH产物中有3个片段与来源于结肠上皮腺癌和Lung Epidermoid carcinoma的EST有100％同源性,提示它们来自恶性肿瘤相关基因。反向SSH产物中有5个片段为未知新序列,提示它们可能来自于在甲状腺癌中特异性低表达的新基因。结论：通过抑制性消减杂交技术,构建了人甲状腺癌cDNA消减文库,为下一步筛选鉴定甲状腺癌特异性基因及其全长克隆、功能研究等工作打下了基础。     

苏拉明对肺癌血管生成的抑制作用

目的　研究苏拉明对肺癌血管生成的抑制作用及其机制。方法　采用细胞培养和免疫组织化学的方法离体研究肺癌A5 49细胞、人血管内皮ECV 30 4细胞VEGF及其受体 (Flt、KDR)的表达及苏拉明的影响。结果　苏拉明对肺癌细胞产生和分泌VEGF无影响 ;ECV 30 4细胞KDR、Flt的蛋白表达在苏拉明浓度为 0 .2 5ng/ml和 2 .5ng/ml时 ,受到显著抑制 ;而苏拉明浓度为 0 .2 5ng/ml和 2 5ng/ml时Flt的表达 ,以及苏拉明浓度为 2 .5ng/ml和 2 5ng/ml时KDR的表达则无明显变化 (与对照组比较 ,P >0 .0 5 ) ;苏拉明对A5 49、ECV 30 4细胞增生无影响。结论　苏拉明抑制肺癌血管生成的作用机制可能是通过抑制血管内皮细胞上的VEGF受体表达 ,减少VEGF与其受体结合所致。