RNAi技术及其应用

自从1998年Fire等提出siRNA以来,短短的几年间人们对它的认识和应用速度是惊人的。RNAi现象的发现及其分子生物学机制和功能的深入研究,为成功地应用RNAi研究与治疗遗传性疾病、病毒感染、免疫缺陷疾病和肿瘤等重大疾病提供了理论基础,而且目前已取得重大进展,尤其是在肿瘤、艾滋病和肝炎等方面。本文就有关RNAi综述如下。1 RNAi的发现RNAi(RNA interference)即RNA干扰,是1998年由Fire首次发现并命名的。1995年,康乃尔大学的Guo和Kem-phues et al[1]在试图阻断秀丽新小杆线虫(C·elegans)中的par-1基因时,想利用反义RNA技术特…     

浅谈微创外科技术在胃肠疾病治疗中的应用

本文首先介绍了微创外科技术的概念和定义，阐述了微创外科技术在胃肠疾病治疗中的应用，并探讨了微创外科技术的发展。     

综合无痛技术在肛肠疾病治疗中的应用

在肛门直肠疾病的手术治疗中,术后疼痛是其主要反应之一,其产生原因,除与局部解剖因素有关外,还常见有以下几种原因:精神紧张;肛门直肠末梢神经受到手术刺激;术后齿线以下水肿或局部感染;术后内外括约肌痉挛继发疼痛等.在治疗过程中,应始终遵循微创无痛理念,将镇痛意识和措施贯穿于术前、术中、术后,从各个环节入手,提高治疗质量,减轻患者病痛.近年来,我们将综合无痛技术应用于216例肛肠病患者,总结报告如下.     

射频技术在治疗消化道疾病中的应用

近年来,应用射频治疗消化道疾病越来越受到众多学者的亲睐,许多研究及临床疗效观察表明,射频在治疗消化道疾病如出血、息肉、癌性狭窄等方面有其独特的优势,本文就其目前研究应用情况概述如下。1射频技术应用及生物学效应射频技术应用于临床医学已有百余年历史。早在1868年法国的d’Arsonval[1]发现高于10 KHz的高变电流通过活体组织时,并不引起神经肌肉的应激,但局部产热能造成组织毁损。因此,射频毁损在神经、心血管和泌尿领域得以应用并逐渐发展成为一个标准的治疗技术[2]。1990年Rossi[3]最早将该技术应用于肝脏组织,与此同时,我国也…     

蛋白组学技术及其在泌尿系疾病中的研究应用

随着2001年人类基因组全序列完整草图的完成,宣告人类基因组计划进入后基因组时代,即蛋白组计划。蛋白组学的研究成为各国专家的研究重点。本文综述了蛋白组学研究技术及其在泌尿病学中的最新进展,对临床泌尿系疾病的早期诊断和治疗提供了新的方向。     

纳米药物在疾病治疗中的应用及其进展

纳米技术是在 0 .1～ 10 0nm尺度上研究和应用原子、分子的结构特征及其相互作用的高新科学技术 ,通过操纵原子、分子、原子团或分子团 ,使它们重新排列组合成新物质的技术。纳米微粒表面具有很强的活性 ,具有特殊的光学、热学、力学和磁学特性 ,有大量的界面或自由表面 ,各纳米单位间存在着或强或弱的相互作用 ,这些特点使纳米材料具有小尺寸效应和界面效应 ,表现出许多优异性能和全新的功能。利用纳米微粒作为药物载体提高了药物吸收度和稳定性 ,改善药物性质和靶向性 ,药物作用时间延长 ,疗效增加 ,毒副反应小 ,为疾病的药物治疗开辟了新…     

免疫吸附技术在神经系统免疫性疾病治疗中的应用

自身免疫疾病的发生主要是因为免疫系统的原发性功能紊乱或与外抗原的交叉反应有关，机体产生大量的自身抗体，造成机体的损伤，对于这类疾病，治疗的主要目的就是清除及预防这些抗体的再合成，免疫吸附技术^[1]是在体外利用吸附剂选择性的结合血浆中的某些成分进行吸附，从而降低血浆中特异性抗体的水平，缓解患者的临床症状，缩短病程，加速治愈，在神经系统中，据认为重症肌无力，急性感染性多发性神经炎与多发性硬化等疾病的病因与免疫功能的异常有关，近年来，免疫吸附技术逐步的被应用到这些疾病的治疗当中，取得了较好的效果。本文就免疫吸附技术在神经系统免疫性疾病治疗中的应用情况作一综述。     

膝关节镜技术在膝关节疾病诊治中的应用

膝关节是关节镜技术应用最早和最完善的关节。膝关节镜技术分为诊断性和手术性两类 ,用于膝关节疾病和损伤的诊断直接、准确、可靠。目前尚无任何其它影像技术可与其比拟。关节镜诊断的适应症极为广泛 ,在准确诊断关节内病变的前提下 ,可在关节镜直视下直接施行咬、割、刮、刨、钻、激光汽化等多种技术操作。不需要切开关节囊 ,即能完成关节内滑膜创切、半月板缝合修补及切除、关节软骨病灶清理、游离体摘除、交叉韧带重建等手术治疗[1] 。作者自 2 0 0 0年从事关节镜技术以来 ,已对16 0例膝关节疾病患者施行关节镜诊断和治疗 ,疗效满意。现…     

应用射频技术治疗消化道疾病

作者介绍了经内镜射频技术治疗消化道疾病,包括上消化道出血、上消化道息肉、食管癌、胃癌、结肠息肉的原理和临床应用情况。说明经内镜射频技术是具有治疗彻底、处理快捷、不操作内镜、安全、无环境污染及一机多用的优点,并认为此技术值得推广使用。     

RNAi在基因治疗中的应用

基因治疗是近10年来才发展起来的治疗技术,它是现代医学与分子生物学迅速发展及其两者密切结合的产物,RNAi(RNA interference)即RNA干扰是最近几年才发展起来并用于基因治疗的新技术,具有较好的应用前景和发展潜力.     

RNAi在白血病相关基因功能研究与基因治疗中的应用

白血病是血液系统最主要的恶性肿瘤之一,估计我国白血病的发病率每年2.71/10万,每年死于白血病患者近4万人,5年无病生存率仅达20%左右。RNA干扰(RNAi)是一种特异有效的阻断靶基因表达的新技术。目前,广泛地应用于人类白血病相关基因功能研究以及白血病基因治疗实验研究中。现就最近应用RANi研究白血病的成果进行综述。     

RNA干扰及其抗病毒作用

RNA干扰 (RNAi)是一种新发现的通过 ds RNA介导的特异同源靶基因沉默途径。 RNAi主要包括两个步骤 :RNase 样核酸酶切割 ds RNA而生成 2 1- 2 3nt的 si RNA和 si RNA引导 RNA诱导的沉默复合体 (RISC)降解同源性靶基因 m RNA。在某些生物体中 RNAi具有放大效应。通过将 - 2 1nt si RNA导入哺乳动物细胞的 RNAi技术不仅可避免非特异干扰素反应 ,更重要的是还可介导序列特异的基因沉默。最近将 RNAi应用于许多病毒性疾病的治疗研究均取得了显著的基因沉默效果 ,预示 RNAi有望成为一种预防、治疗病毒性疾病的新手段。     

人肝素酶RNAi序列的筛选及鉴定

目的 筛选及鉴定有效人肝素酶(heparanase, Hpa)RNA干扰(RNA interference)序列.方法 通过在线网络软件选择3个Hpa RNAi的靶点,再设计1组无关序列作阴性对照.通过基因重组技术,把3个干扰片段及阴性对照片段分别克隆入质粒pGenesile-1,脂质体法稳定转染至HepG2肝癌细胞;经G418抗性筛选后各挑选2个阳性克隆进行扩大培养;Western blot检测不同克隆肝素酶蛋白的表达水平,并进一步采用RT-PCR验证筛选克隆肝素酶mRNA的表达水平.结果 通过在线网络软件设计3个RNA干扰序列,分别为Hpa/RNAi-1:GGCTATCTCTTCTGTTCAA,Hpa/RNAi-2:TCCTGTCCGTCACCATTGA,Hpa/RNAi-3:CTCAGTTGCTCCTGGACTA及阴性对照序列Hpa/RNAi-N : CTACCGTTGTATAGGTGT;测序证实克隆入pGenesil-1载体的3个干扰序列及阴性对照序列与设计序列完全一致;经G418抗性筛选后形成的阳性克隆采用Western blot检测其肝素酶蛋白的表达,结果表明3个干扰序列对HepG2细胞人肝素酶蛋白的表达均有抑制作用,其中Hpa/RNAi-1和Hpa/RNAi-3干扰链的抑制效果最好,分别达到57%和71%;RT-PCR检测结果亦表明Hpa/RNAi-1和Hpa/RNAi-3序列在mRNA水平对肝素酶有较好的抑制效果.结论 成功筛选出有效的人肝素酶RANi序列.     

RNAi抑制水通道蛋白5表达及其对细胞株粘蛋白合成、分泌的影响

 目的：观察瞬时及稳定转染的RNA干扰法对水通道蛋白5（AQP5）的抑制效果,并观察AQP5抑制后细胞株粘蛋白合成、分泌的变化。方法：用化学合成siRNA和质粒介导的shRNA分别转染SPC-A1细胞,并在转染后7d内的不同时点收集细胞,检测AQP5 mRNA和蛋白的变化。用G418筛选稳定转染细胞株,用Western blot法检测稳转株AQP5蛋白的抑制情况。用ELISA法检测AQP5抑制后各时点及稳定转染细胞株MUC5AC表达量的变化。结果： siAQP5及shAQP5转染24h对AQP5 mRNA的抑制率分别为65％、79％。对蛋白的抑制在转染后第7d最明显,分别为93%,98%。稳转株（5株）对AQP5蛋白的抑制率为45-64%。ELISA显示瞬转第5d,MUC5AC的合成和分泌分别增加 57.9% 、85.3%。在5株稳定转染细胞中 (shAQP5-G1,G2,G3,A1,A5) MUC5AC的合成和分泌分别增加 59-156% 及33-166% 。结论：化学合成及质粒介导的RNA干扰法均能有效抑制SPC-A1细胞AQP5的表达,后者较前者更经济,抑制效应更优。与瞬时转染比较,稳定转染可长时间抑制特定基因的表达。AQP5抑制后,细胞株粘蛋白的合成、分泌增高。     

RNAi抑制水通道蛋白5表达及其对细胞株黏蛋白合成及分泌的影响

目的观察瞬时及稳定转染的RNA干扰法对水通道蛋白5(AQP5)的抑制效果,并观察AQP5抑制后细胞株黏蛋白合成、分泌的变化。方法用化学合成siRNA和质粒介导的shRNA分别转染SPC-A1细胞,并在转染后7d内的不同时点收集细胞,检测AQP5 mRNA和蛋白的变化。用G418筛选稳定转染细胞株,用Western blot法检测稳转株AQP5蛋白的抑制情况。用ELISA法检测AQP5抑制后各时点及稳定转染细胞株MUC5AC表达量的变化。结果siAQP5及shAQP5转染24h对AQP5 mRNA的抑制率分别为65%、79%。对蛋白的抑制在转染后第7d最明显,分别为93%,98%。稳转株(5株)对AQP5蛋白的抑制率为45%~64%。ELISA显示瞬转第5d,MUC5AC的合成和分泌分别增加57.9%、85.3%。在5株稳定转染细胞中(shAQP5-G1,G2,G3,A1,A5)MUC5AC的合成和分泌分别增加59%~156%及33%~166%。结论化学合成及质粒介导的RNA干扰法均能有效抑制SPC-A1细胞AQP5的表达,后者较前者更经济,抑制效应更优。与瞬时转染比较,稳定转染可长时间抑制特定基因的表达。AQP5抑制后,细胞株黏蛋白的合成、分泌增高。     

骨髓基质干细胞及其在中枢神经系统疾病治疗中的应用前景

成体中枢神经系统损伤后再生能力差,细胞移植治疗可望成为一条有效的治疗途径。研究表明,骨髓中的基质干细胞除具备向间充质细胞分化的能力外,在一定条件下还具有向神经细胞分化的可塑性,且容易获得和导入外源基因,因而被认为是中枢神经系统疾病细胞治疗和基因治疗理想的种子细胞,具有广阔的应用前景。     

靶向人RIP RNAi真核表达载体构建及在人肝癌细胞Huh7细胞中的表达

目的:构建靶向人RIP的小分子干扰RNA(siRNA)真核表达载体(pSUPERpuro-RIP),在Huh7细胞系中瞬时表达后,检测其对RIP的沉默效果。方法:设计4对含RIP mRNA特异性序列的60 nt DNA链,通过基因克隆技术将其插入真核表达载体pSUPER-puro,构建重组pSUPERpuro-RIP siRNA载体,以EcoRⅠ和HindⅢ双酶切及测序验证其正确性。再瞬时转染Huh7细胞,Western blot检测RIP蛋白表达。结果:酶切测序证实载体构建成功,无碱基突变。Western blot结果表明pSUPERpuro-RIP siRNA在Huh7细胞系中有较好的沉默效果。结论:成功构建了靶向人RIP基因的siRNA载体pSUPERpuro-RIP siRNA。     

RNA干扰技术及其在心脑血管疾病中的应用

RNA干扰（RNAi）是外源和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,导致转录后基因沉默的现象.RNAi过程分为三个阶段,即起始阶段、效应阶段及扩增阶段.RNAi是一种高效特异性的阻断基因表达的基因阻断技术,不仅在生物学功能方面起到作用,如病毒防御,抑制转座子的转座,保护基因组的稳定性,以及调节基因表达,在医学领域也有着广泛的应用,包括高血压、心肌病变、心力衰竭及脑血管疾病等.     

突变型P53的pSUPER-EGFP1 RNAi系统的构建

目的构建抑制突变型p53基因siRNA表达载体。方法化学合成2段编码短发夹RNA序列的、靶向突变型p53基因的寡核苷酸(各58个碱基),退火,克隆到经BglⅡ、HindⅢ双酶切后的pSUPER-EGFP1(pSG)载体的polⅢH1启动子的下游,重组构建RNAi质粒,同时设立非特异对照。构建好的干扰载体瞬时转染胃癌细胞SGC-7901,用RT-PCR检测其对突变型p53基因的抑制效果。结果重组构建的pSUPER-EGFP1-p53(pSG-p53i)载体经双酶切电泳分析及插入基因序列分析,58个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。RT-PCR显示pSG-p53i对突变型p53基因的表达具有较好的瞬时抑制作用。结论载体的成功构建,有助于深入研究其对突变型p53基因的稳定抑制作用。体内合成siRNA的方法,可将RNAi技术用于细胞培养和哺乳动物研究。     

抑制端粒酶活性的pSUPER RNAi系统的构建

目的 构建抑制端粒酶活性的siRNA表达载体。方法 化学合成2段编码短发夹RNA序列的、靶向端粒酶hTERT基因的寡核苷酸，各64个碱基，退火，克隆到经BglⅡ、HindⅢ双酶切同时CIP处理后的pSUPER载体的polⅢH1启动子的下游，重组构建RNAi质粒，同时设立非特异对照．结果 重组构建的pSUP—hTE载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析，结果表明64个碱基成功插入到预计位点，并且序列完全一致。结论 载体的成功构建，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。同时使我们发展了在体内合成siRNA的方法，这项技术能广泛的用在分析基因功能、肿瘤治疗等，更加便捷地把RNAi技术用于细胞培养和哺乳动物研究。