骨形态发生蛋白-2对椎间盘细胞软骨特异性基因 mRNA的调节作用

目的探讨骨形态发生蛋白(BMP)-2对椎间盘细胞软骨特异性基因Sox9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因的调控作用.方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测BMP-2对培养的人椎间盘细胞中Sox9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因 mRNA表达的调控作用.结果在BMP-2浓度为100 μg/L(0.149±0.006,P<0.05)和1 000 μg/L(0.163±0.006,P<0.01)时,其对椎间盘细胞中Sox9基因 mRNA可起到显著的正向调控作用;在此浓度下,它也可以对Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因mRNA起到正向调控作用.结论 BMP-2可以按照剂量依赖方式正向调控椎间盘细胞中Sox9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因的表达.     

白细胞介素1对椎间盘细胞软骨特异性基因Sox9 mRNA的调节作用

目的探讨白细胞介素1（interleukin-1,IL-1）对人椎间盘细胞软骨特异性基因Sox9和Ⅱ型胶原基因表达的调节作用。方法应用RT—PCR技术检测IL-1对培养的椎间盘细胞中软骨特异性基因so西和Ⅱ型胶原基因mRNA表达的调节作用。结果在IL-1浓度为0．1ng／ml、1ng／ml和10ng／ml培养24h时,其对椎间盘细胞Sox9和Ⅱ型胶原基因mRNA可起到显著的负向调控作用;10ng／ml的IL-1随着培养时间的延长对椎间盘细胞中Sox9和Ⅱ型胶原基因mRNA出现显著的负向调控作用。结论IL-1可以按照剂量及时间依赖方式负向调节椎间盘细胞Sox9和Ⅱ型胶原基因的表达。     

骨形态发生蛋白-2和Ⅱ型胶原在退变腰椎间盘髓核组织中的表达及意义

目的:探讨骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和Ⅱ型胶原在退变腰椎间盘髓核中的表达及其意义。方法:应用原位分子杂交(ISH)和免疫组织化学法,检测30例(男23例,女7例)退变腰椎间盘髓核(退变组)和8例(男6例,女2例)无明显退变腰椎间盘髓核(对照组)中BMP-2和Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达情况;应用Image-ProPlus5.0图像分析软件测定各指标的平均灰度值。结果:退变组BMP-2的mRNA和蛋白(109.51±8.32和104.48±14.24)表达较对照组(146.93±16.35和146.38±19.53)增强(P<0.05和P<0.01);而退变组Ⅱ型胶原mRNA和蛋白(139.49±16.05和140.34±18.26)表达较对照组(113.09±15.28和113.72±13.59)减弱(P<0.01)。退变组中,BMP-2和Ⅱ型胶原mRNA、蛋白表达均呈一定的负相关关系(r分别为-0.602和-0.614,P<0.01)。结论:在椎间盘退变过程中BMP-2可能是一个重要的调节因子;其对椎间盘退变的调节作用与Ⅱ型胶原有一定关系;BMP-2在退变椎间盘中的表达增强可能是一种保护性的反应。     

椎间盘髓核细胞中Sox9与Ⅱ型胶原基因表达的关系

目的：探讨椎间盘髓核组织中Sox9基阏表达的变化及其与Ⅱ型胶原基因表达的关系。方法：将30个椎间盘组织按Thompson分期分为Ⅰ～Ⅳ期．应用RT—PCR、Westernblot和免疫组化方法检测各期间盘组织巾Sox9、Ⅱ型胶原基因的mRNA和蛋白表达：应用SPSS10，0统计学软件．采用单闪素方差分析、t检验和Pearson相关性检验分析两者的相互关系。结果：椎间盘髓核组织巾Sox9mRNA的表达量在总体上低于Ⅱ型胶原，Sox9蛋白表达位于细胞核中而Ⅱ型胶原主要位于细胞间质内，Sox9在ThompsonⅠ期椎间盘的细胞核内表达很强而存Ⅳ期则很弱甚至缺失：从ThompsonⅠ-Ⅳ期两种基因的mRNA和蛋白表达水平均逐渐降低，各分期间有显著性差异（P〈0．05）。ThompsonⅠ～Ⅳ期标本巾Ⅱ型胶原与Sox9表达量的下降趋势相近。结论：Sox9和Ⅱ型胶原基因表达水平与Thompson分期密切相荚，随椎间盘退变程度加重表达逐渐降低，且两者下降趋势相近。     

退变颈椎间盘组织中骨形态发生蛋白的基因表达

目的：了解骨形态发生蛋白（BMP）在椎间盘退变、突出过程中是否有表达。方法：采用颈椎间盘突出症前路钻孔减压术中所得椎间盘标本,进行组织学检查、BMP免疫组化和分子原位杂交研究。结果：突出的椎间盘与后纵韧带可融合发生部分骨化,形成的骨赘中BMP免疫组化染色及分子原位杂交阳性。上下软骨板和与之相邻的椎间盘组织BMP表达阳性。但椎间盘中心BMP表达阴性。自椎体骨和软骨板发出一些散在的呈“指状”的骨突嵌入椎间盘;其表面骨组织和周围的椎间盘组织BMP免疫组化染色及分子原位杂交阳性。结论：在突出颈椎间盘、软骨板、后纵韧带、骨膜中发现了BMP的阳性表达,但其来源、激活机制与意义尚需进一步研究。     

骨形态发生蛋白基因表达及应用的研究进展

骨形态发生蛋白１～１２的ｃＤＮＡ克隆要继被报道。在大肠杆菌和真核细胞均表达出有诱骨活性的骨形态发生蛋白，随着基因重组技术和基因转移技术的发展，外源性骨形态发生蛋白基因的直接或间接转移和表达，将会对局部骨缺损修复产生重要意义，为骨形态发生蛋白的临床应用开辟新的途径。     

骨形态发生蛋白-2基因活化纳米骨浆修复兔桡骨缺损的实验研究

目的观察骨形态发生蛋白-2（BMP-2）基因活化纳米骨浆在损伤部位的局部成骨基因表达和骨缺损重建修复效果。方法新西兰白兔54只，其中48只实验动物随机分成三组（每组16只32侧），制成双侧桡骨中段15mm骨缺损模型。A组：注入hBMP-2＋纳米骨浆；B组：注入空白质粒＋纳米骨浆；C组：注入纳米骨浆。另6只动物制作左桡骨中段骨缺损，不植入材料，作为空白对照。术后4、8和12周取材行影像学检查、组织学观察、分子生物学检测和生物力学检测。结果术后12周A、B和C组骨缺损均修复，A组骨缺损处有明显BMP-2的mRNA和蛋白质表达，在ALP水平、成骨速度、新生骨量及新生骨力学强度等方面均明显优于B、C两组（P〈0．05）。空白对照组骨缺损无愈合。结论纳米骨浆复合BMP-2质粒后，具有一定骨诱导作用，植入体内后成骨速度、质量及力学强度较单纯的纳米骨浆明显增强，能够有效修复骨缺损。     

转化生长因子β与椎间盘细胞Ⅰ型胶原基因调控的关系

目的：探讨ＴＧＦ－β在椎间盘Ⅰ型胶原代谢中的作用及作用机制。方法：应用斑点杂交和原位杂交技术检测了ＴＧＦ－β对椎间盘原代培养及传代培养的纤维环细胞、髓核细胞中Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ,ＴＧＦ－β１浓度为１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｍ／ｍｌ,其作用分别是０ｎｇ／ｍｌ组的１．１８倍及１．３７倍;对于传代培养４ 纤维环细胞,其调节作用分别是０ｎｇ／ｍｌ组的１．４８倍及２．０３倍。结论：ＴＧＦ－β可以按照剂量依赖方式正向     

可调控表达人骨形态发生蛋白2基因的腺病毒载体系统的构建

目的构建可调控人骨形态发生蛋白2（hBMP2）基因表达的重组腺病毒载体系统,为骨缺损的修复提供新思路。方法基因测序验证pcDNA3．1－hBMP2质粒的准确性,将酶切得到的hBMP2基因片段亚克隆到穿梭载体质粒pTRE—Shuttle2的多克隆位点,将pTRE—Shuttle2-hBMP2线性化并连接至腺病毒骨架质粒Adeno—XSystem 1 Viral DNA上,构建重组的Adeno—X－pTRE—hBMP2载体;用PacI酶将其线性化后脂质体法（Lipofectamine 2000）转染HEK293细胞,获得有感染能力的重组腺病毒颗粒,收集病毒上清进行hBMP2基因PCR鉴定;将包含rtTA激活因子的Adeno—X Tet—Onvirus Stock感染HEK293细胞包装扩增病毒。结果hBMP2基因被成功定向克隆到腺病毒骨架质粒Adeno—X System 1 Viral DNA上,转染HEK293细胞后获得有感染能力的重组腺病毒颗粒。结论本研究成功构建了hBMP2基因的腺病毒Tet—On表达系统,为实现hBMP2基因在靶细胞水平上的调控表达提供前期实验基础。     

Ad-hBMP-2转染体外培养人退变腰椎间盘细胞的研究

[目的]研究人骨形态发牛蛋白-2腺病毒表达载体（Ad—hBMP-2）转染体外培养人退变腰椎问盘细胞，分析其对腰椎间盘细胞影响.[方法]成人退变腰椎间盘细胞体外培养，通过免疫组化和染色体分析鉴定椎间盘细胞。利用免疫荧光和蛋白印迹法检测不同转染剂量对细胞BMP-2表达的影响。[结果]体外培养成人退变腰椎间盘细胞第2代鉴定具有其结构功能。转染后通过免疫荧光和蛋白印迹法可见随转染剂量增加BMP-2表达量逐渐增加。[结论]Ad—hBMP-2可高效转染体外培养人退变椎间盘细胞，同时随转染剂量增加BMP-2表达量逐渐增加。     

Statin stimulates bone morphogenetic protein-2, aggrecan,and type 2 collagen gene expression and proteoglycan synthesis in rat chondrocytes

Statins increase bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) mRNA expression and subsequently increase new bone formation in vitro. However, the action of statins on the BMP-2 mRNA regulation of cartilage matrix synthesis by chondrocytes is unknown. We evaluated regulation of BMP-2, aggrecan, and type II collagen (COL2) mRNA and ³⁵S-labeled proteoglycan (PG) synthesis by mevastatin using cultured chondrocytes obtained from articular cartilage of fetal rats. Expression of BMP-2, aggrecan, and COL2 mRNAs were increased in the presence of 2µM mevastatin on day 2. However, longer (10 day) culture in the presence of the drug decreased the expression of these mRNAs. PG synthesis was increased 3 days after treating the cells with mevastatin, which was also decreased with longer (10 day) mevastatin treatment. These results suggest that mevastatin increases mRNA expression of BMP-2, aggrecan, and COL2 as well as PG synthesis by fetal rat chondrocytes early in the treatment period. We suggest that statins have implications for fracture and cartilage repair.     

基因治疗对兔下颌骨牵引过程中骨形成蛋白-2表达的影响

目的 探索电穿孔介导的基因治疗对兔下颌骨牵引成骨过程中骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)表达的影响.方法 新西兰大白兔双侧下颌骨截骨,术后3d开始牵引,连续牵引7d后,将实验动物分为A、B、C、D、E5组,A、B、C组分别在牵引区注射2 μg(0.1 μg/μl)重组质粒pIRES-hVEGF165-hBMP2、pIRES-hBMP2、pIRES-hVEGF165.D组与E组分别注射相同剂量的空质粒(pIRES)和生理盐水(NS).各组分别于固定期第7、14、28天处死动物,取材行免疫组织化学检测BMP2的表达情况,并利用病理图像分析系统进行分析.结果 BMP2主要在肉芽组织中的炎细胞及新生幼稚骨小梁表面的细胞组织中表达.固定7d时表达最强烈,各时点基因治疗组明显强于对照组.结论 电脉冲介导的基因治疗能使BMP2在牵引区的表达增强和表达时限延长并促进细胞的分裂增殖与分化,促进牵引区细胞基质的形成和新骨生成.     

假体周围骨溶解性骨缺损的转骨形态发生蛋白-2基因治疗

目的 模拟假体周围骨溶解环境,观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因治疗假体周围骨溶解性骨缺损的效果.方法 成年雄性Beagle犬6条,于股骨外髁造成假体周围3mm骨缺损区.1条动物的左侧缺损区植入1ml平均直径1μm的钛合金颗粒混悬液,右侧植入1ml磷酸盐缓冲液(PBS),观察造模结果;其他5条动物双侧植入1ml钛合金颗粒混悬液,于术后2个月取出假体,植入转BMP-2基因冻干骨或单纯冻干骨,二次术后3个月取材,行组织学、组织形态计量学观察植骨愈合替代及界面骨整合情况.结果 颗粒造模术后2个月可见典型的骨溶解界膜组织形成.翻修术后3个月,冻干骨组见较多植骨残余,假体-骨界面基本为软组织界膜,假体骨接触率(BIC)为(1.38±1.22)%;基因治疗组见少量植骨残余,假体-骨界面有点状骨接触,BIC为(12.96±1.61)%,两组差异有统计学意义(P<0.01).结论 采用BMP-2基因治疗可提高假体周围骨溶解性骨缺损的界面骨整合.     

骨形态发生蛋白-2/胶原/掺锶羟基磷灰石材料修复颅骨缺损

目的 制备骨形态发生蛋白-2( BMP-2)/胶原/掺锶羟基磷灰石材料并探讨其修复大鼠颅骨缺损的可行性和有效性.方法 扫描电镜观察Ⅰ型胶原制备单纯胶原、胶原/羟基磷灰石、胶原/掺锶羟基磷灰石、BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石4组骨修复材料表面结构.用BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石材料浸提液进行细胞毒性试验和体外溶血试验评价其生物相容性.在大鼠头颅制备颅骨极限骨缺损模型,分别植入4种骨修复材料.术后12周CT扫描观察骨缺损修复影像学.苏木素-伊红(HE)和Masson染色观察骨缺损组织学变化,并在骨缺损及其周围新生骨部位行骨桥蛋白( OPN)和β-连环蛋白(β-catenin)免疫组织化学染色.结果 在扫描电镜下观察发现单纯的胶原材料为交织样物质结构,胶原/羟基磷灰石材料为交织晶体板状结构胶原/掺锶羟基磷灰石和BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石材料晶体结构为单晶体交织状.BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石材料浸提液对细胞相对增殖率(RGR)无显著影响(P＞0.05),材料的细胞毒性为1级.骨缺损CT扫描平均CT值分别为(98.5±10.2)、(208.4±19.5)、(418.4±27.1)、(476.8±30.5)hu,BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石材料缺损部位CT值最高.HE和Masson染色见BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石组骨质愈合完全,原骨缺损处多为红色成熟骨.胶原/掺锶羟基磷灰石组植入区内蓝色的新生骨较多.胶原/羟基磷灰石材料组,植入区在植入材料边缘新生骨形成,界限仍然清晰.单纯胶原组骨质未愈合,骨缺损处为淡蓝色条索状结构,中间未见骨形成.对比其他3组,BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石组存在大量棕色的OPN和β-catenin染色阳性新生骨组织,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石材料促进骨修复能力强于单纯胶原、胶原/羟基磷灰石、胶原/掺锶羟基磷灰石材料.     

重组人骨形态发生蛋白-2质粒转染诱导人脐血间充质干细胞软骨分化研究

目的探究从人脐血中提取间充质干细胞,重组质粒pIRES2-EGFP-hBMP-2转染干细胞并诱导其成软骨化的可能性。 方法采用密度梯度离心方法获取脐带血中细胞,依据贴壁时间不同获得间充质干细胞,流式细胞仪检测表面抗原表达鉴定细胞;然后把重组有pIRES2-EGFP-hBMP-2的质粒导入间充质干细胞,观察EGFP的表达;ELISA方法检测在不同时间收集的培养基上清中hBMP-2蛋白含量,采用免疫荧光和RT-PCR方法检测目的蛋白和基因表达。转染成功后继续培养细胞2 w,免疫组化检测细胞Ⅱ型胶原的表达和RT-PCR检测软骨特异性标志物软骨连接蛋白（CRLT1）的表达。 结果两种方法可以获取人脐血间充质干细胞,流式细胞术鉴定发现CD90、CD105、CD146高表达,CD34、CD45、Anti-HLA-DR不表达。非脂质载体包裹重组质粒pIRES2-EGFP-hBMP-2可成功导入脐血间充质干细胞,转染率为（27.7±7.6）%。ELISA检测实验组和对照组hBMP-2的表达结果有统计学差异（t=3.355,P<0.01）。RT-PCR结果表明hBMP-2基因稳定转录,免疫荧光标记hBMP-2蛋白呈红色荧光。Ⅱ型胶原免疫组化染色示部分细胞被染成棕黄色,RT-PCR结果表明加入转染后的干细胞组CRLT1的表达量比未转染的干细胞组高（t=59.700,P<0.05）。 结论重组hBMP-2基因可以成功转染人脐血间充质干细胞并在胞内稳定表达,且有hBMP-2分泌,并可促进其表达Ⅱ型胶原蛋白及软骨连接蛋白,可向软骨细胞化诱导。     

The short-term therapeutic effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on collagenase-induced lumbar facet joint osteoarthritis in rats

OBJECTIVE: To determine whether an intra-articular injection of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) alleviates cartilage degradation in a rat model of osteoarthritis (OA) of the lumbar facet joint. METHOD: The right-side facet joint OA model was created by an intra-articular injection of collagenase (type II) 2 weeks before treatment. The OA rats were divided into four groups: (1) no treatment, or intra-articular injection of either (2) saline, (3) rhBMP-2 10 ng, or (4) rhBMP-2 100 ng. The left-side facet joint served as the normal control. At 3 and 6 weeks after treatment, histological analyses were performed on the cartilage, synovium, subchondral bone and bone marrow. The cartilage and synovium were graded using a modified Mankin score and a synovium score system. Extracellular type II collagen was evaluated by immunohistochemistry. RESULTS: Intra-articular injection of collagenase causes OA-like changes in the facet joint. OA rats treated with rhBMP-2 at both dosages tested showed reduced severity of their cartilage lesions compared with untreated and saline-treated groups. There was a statistically significant difference in the modified Mankin score compared to the untreated and saline-treated groups. However, some rhBMP-2-treated rats at the higher dose (100 ng) showed, as a side effect, joint space obliteration caused by cartilage overgrowth. Also OA rats treated with 100 ng of rhBMP-2 displayed a significant synovium reaction at 3 weeks compared with that in other groups. Immunohistochemical analysis showed that treatment with rhBMP-2 significantly increased the content of type II collagen. CONCLUSION: This study demonstrates the potential efficacy of rhBMP-2 in the alleviation of arthritic changes in a rat model of OA of the lumbar facet joint. However, treatment with a high dosage of rhBMP-2 caused adverse side effects in some animals.