丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP3的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCV NSSA表达质粒pcDNA3．1(-)-NSSA转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中有新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为1572nt,编码产物由524aa组成,并测序证实,命名为NS5ATP3,在GentBank中注册,注册号为AF529364。结论 分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HCV NSSA反式激活作用的新型靶基因NS5ATP3,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(core)反式激活的新型靶基因。方法 以HCV核心蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。分析筛选出来的基因,其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索比对及电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染pcDNA3．1(-)-core的HepG2细胞提取总RNA,以RT-PCR技术扩增获得该新基因的全长序列,并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果该新基因的编码序列全长为2001nt,编码产物由667aa组成,并测序证实,命名为TAHCCP1,在GenBank中注册,注册号为AY038359。结论 发现并鉴定、克隆了HCV核心蛋白反式激活作用的新型靶基因TAHCCP1,为进一步研究HCV核心蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础。     

应用抑制性消减杂交技术筛选XTP3的反式激活基因

目的应用抑制性消减杂交技术构建乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP3的差异表达的cDNA消减库,克隆XTP3反式激活相关基因。方法以XTP3表达质粒pcDNA3．1(-)XTP转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减库,并转染大肠杆菌进行库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果库扩增后得到30个白色克隆,经菌落PCR分析,得到23个200～1000bp插入片段。对所得片段测序,并进行同源性分析,共得到20种已知基因序列和2种未知功能基因序列,可能是XTP3反式激活靶基因。结论成功构建了乙型肝炎病毒xTP3反式激活基因差异表达的cDNA消减库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定了基础。     

抑制性消减杂交技术筛选XTP4蛋白反式调节基因

目的 筛选、克隆乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg）反式激活基因XTP4转染肝癌细胞后的反式调节基因,探索XTP4基因表达对肝细胞基因表达谱的影响。方法 常规的分子生物学技术构建真核表达载体peDNA3．1(-)-XTP4,应用抑制性消减杂交(SSH)技术对重组表达质粒peDNA3.1(-)-XTP4转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究,将富集的二次PCR产物与T／A载体连接,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 消减文库扩增后得到21个阳性克隆,PCR分析显示其中16个克隆含有200～1000bp的插入片段。对插入片段进行测序及生物信息学分析,结果共获得9种蛋白编码基因。这些差异表达的基因与肝细胞纤维化形成、肿瘤发生、线粒体氧化还原代谢、细胞生长调节密切相关。结论 应用SSH技术成功筛选了XTP4对肝癌细胞的反式调节基因,为进一步阐明HBxAg对肝细胞蛋白的反式调节作用提供了理论依据。     

应用抑制性消减杂交技术筛选HBeAg结合蛋白1反式激活基因

目的筛选与克隆HBeAg结合蛋白1(HBEBP1)新基因的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索。方法应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆HBEBP1反式激活的新型靶基因。以HBEBP1表达质粒pcDNA3．1(-)-HBEBP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减库,并转染大肠杆菌进行库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HBEBP1反式激活基因差异表达的cDNA消减库。库扩增后得到85个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。对26个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得15种编码基因,包括14种已知基因和1种未知基因。结论筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了HBEBP1可能存在的调控机制的线索。     

三氧化二砷反式激活基因AsTP2的克隆化及生物信息学分析

目的三氧化二砷反式激活靶基因(AsTP2)的克隆化研究。方法对构建的三氧化二砷差异表达的肝HepG2细胞cDNA消减文库进行筛选，利用RT-PCR技术获得新基因AstTP2的编码序列，结合生物信息学对其氨基酸序列、染色体定位和基因功能进行分析比较。结果AsTP2基因编码区为1119nt，编码产物为372aa。经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻，发现未知功能的同源蛋白，说明克隆的AsTP2基因属于未知功能新基因，GenBank注册号为AY744366。该基因在三氧化二砷诱导的HepG2细胞中表达上调。结论克隆了一条新的三氧化二砷反式激活靶基因AsTP2，为进一步研究三氧化二砷的反式激活作用和揭示砷致癌的生物学机制提供新线索。     

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因

应用抑制性消减杂技术构建丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV核心蛋白反式激活相关基因。以HCV核心表达质粒pcDNA3.1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果显示,成功构建人HCV核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到233个白色克隆,进行菌落PCR分析,其中213个均得到100～1000bp插入片段。挑取63个插入片段测序分析,其中6个cDNA片段为未知序列,通过生物信息学分析获得其全长序列,已被GenBank收录。提示6个新的cDNA全长序列,可能是HCV核心蛋白反式激活靶基因。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5A（HCV NS5A）反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HCV NS5A蛋白反式激活相关基因。以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(－）-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(－）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaI酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到121个阳性克隆，经菌落PCR分析，得到115个200－1000bp的插入片段，对其中的90个片段测序，并进行同源性分析，显示31种在基因编码蛋白和15种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示，成功构建了HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，该文库的建立为进一步阐明HCV NS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。     

慢性髓细胞白血病相关蛋白CMLAP的基因克隆化研究

目的了解慢性髓细胞白血病(CML)基因表达谱的规律,并对在CML中特异性高表达的一个新基因进行克隆、分析与鉴定。方法应用基因表达谱芯片技术,比较CML患者和正常人外周血单个核细胞(PBMC)基因的表达差异。检索核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt),对差异表达的基因进行生物信息学分析,与已知功能基因序列进行同源性比较。根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新基因序列,据此设计并合成该基因序列的特异性引物,提取CMLPBMC的总RNA,以RT-PCR技术扩增获得该新基因的全长序列,并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果在CML患者PBMC中克隆一个新的基因,经测序证实,其编码序列全长为1872个核苷酸(nt),编码产物由624个氨基酸残基(aa)组成,命名为CMLAP。在GenBank中注册,注册号为AY762229。结论基因表达谱芯片技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了在CML中高表达的新基因CMLAP,为进一步研究CML发生发展的分子生物学机制奠定基础。     

肝细胞内人类次要组织相容性抗原-HA8蛋白反式激活基因的筛选

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选肝细胞内人类次要组织相容性抗原-HA8(HLA-HA8)的反式激活基因。方法以HLA-HA8基因表达质粒pcDNA3.1(-)-HLA-HA8和空载体pcDNA3.1(-)转染HepG2细胞,提取mRNA并反转录合成双链cDNA(dscDNA),分别标记为Tester和Driver;经RsaI酶切后,将Tester cDNA分成两组,分别与两种不同的接头adapter 1和adapter 2衔接,再与Driver cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将产物与pGEM-T easy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠埃希菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建HLA-HA8反式激活基因差异表达cDNA消减文库。扩增后得到101个阳性克隆,菌落PCR分析均得到200~1000bp的插入片段。随机挑选其中28个阳性片段测序,同源分析结果显示,共获得16种编码基因,其中4个功能未知。结论 HLA-HA8基因反式调节基因与细胞结构和生长、物质及能量代谢、物质转运和信号转导密切相关,为HLA-HA8的功能以及HBV感染慢性化机制研究提供了新的思路。     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白5基因的克隆化研究

目的克隆乙型肝炎病毒（HBV）前-S1蛋白反式激活新基因PS1TP5的cDNA,并应用生物信息学技术初步探讨其结构及功能。方法应用聚合酶链反应（PCR）技术以HepG2细胞的cDNA为模板扩增PSlTP5,以pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到真核表达载体pcDNA^TM 3．1／myc-His A,通过PCR、限制性酶切分析进行鉴定,并应用生物信息学技术初步分析其物理化学性质、蛋白质结构和功能。结果PCR成功扩增出PS1TP5基因,并将其分别克隆进pGEM-T和pcDNA^TM3．1／myc-HisA载体,经PCR、限制性酶切鉴定后测序证实。因其可以被前-S1蛋白反式激活,故命名为前-S1反式激活蛋白5（PS1TP5）,已在GenBank中注册,注册号：AY427953。生物信息学分析确定其ORF为438个核苷酸（nt）,编码产物为145个氨基酸残基（aa）。结论发现了HBV前-S1蛋白反式激活新基因PS1TP5,构建了pcDNA^TM 3．1／myc-His A真核表达载体,为进一步研究其生物学功能及慢性乙型肝炎发病机制创造了条件。     

乙型肝炎病毒前-S2蛋白对硫氧还蛋白还原酶1基因表达的上调作用研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)前-S2蛋白对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRDl)启动子转录的激活作用。方法 以302院传染病研究所基因治疗研究中心自行构建的乙型肝炎病毒前-S2蛋白反式调节的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),PCR扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用ELISA法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3．1(-)-preS2共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果pCAT3-TXNRDlp和pcDNA3．1（-）-preS2瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的5．7倍、pCAT3-TXNRDlp的2．2倍。结论 该TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HBV的前-S2蛋白具有反式激活TXNRD1的作用。     

乙型肝炎病毒X蛋白上调S100钙结合蛋白A11基因启动子表达活性研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBV-X蛋白)对S100钙结合蛋白A11(calgizzarin S100A11)启动子转录的激活作用。方法 以解放军第302医院基因治疗研究中心自行构建的HBV-X蛋白反式调节基因的cDNA文库抑制性消减杂交(SSH)技术的筛选结果及基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定S100A11的启动子区域(S100A11-p),聚合酶链反应(PCR)扩增S100A11-P,克隆至真核报告载体pCAT3中,构建pCAT3-S100-p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3．1(-)-X共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果 pCAT3-S100-p在HepG2细胞中能够指导CAT的表达;共转染实验中pCAT3-S100-p pcDNA3．1(-)-X组CAT的表达活性是pCAT3-S100-p的2．1倍。结论 所克隆的S100A11启动子有顺式激活下游基因的活性作用;HBV的X蛋白具有对S100A11的反式激活作用。本实验进一步验证了解放军第302医院基因治疗研究中心利用SSH技术及基因表达谱技术研究HBV-X蛋白反式激活作用的结果。     

应用微阵列技术筛选HBV前-S1蛋白的反式调节基因谱

目的 阐明前-S1蛋白的表达对乙型肝炎病毒(HBV)感染肝细胞基因表达谱的影响。方法 以含有HBV全基因组的质粒G376-7(GenBank号：AF384371)作为模板,应用PCR扩增前-S1蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3．1(-)-preS1,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。结果 在1152个基因表达谱的筛选中,发现有30个基因表达水平显著上调,38个基因表达水平显著下调。结论 前-S1基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响。DNA芯片技术是分析反式调节靶基因的有效技术途径。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3与乙型肝炎病毒 X蛋白协同反式激活作用的研究

构建丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白3（NS3）的重组表达质粒pcDNA3.1(－）-NS3和表达乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白的重组质粒pcDNA3.1(－）-X，分别瞬时转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，用免疫印记（Western blotting)方法鉴定病毒基因的表达。两个表达质粒分别及同时与报告质粒pCAT 3-promoter共转染HepG2细胞，检测报告基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达水平，酶的活性反映了表达的肝炎病毒蛋白对SV40病毒早期启动子功能的影响。结果显示，两个重组表达载体pcDNA3.1(－）-NS3及pcDNA3.1（－）-X在HepG2细胞均以瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白；单独共转染实验中pcDNA3.1(－）-NS3.1(－）-X组的CAT的表达分别是对照的3．6倍和4．4倍，两种质粒共同转染时酶的表达是对照的8．5倍；表达质粒对CAT酶表达的激活作用呈剂量依赖性。研究表明，HepG2细胞中表达的HCV NS3蛋白和HBV X蛋白均具有反式激活SV40早期启动子的功能，并且两种蛋白的反式激活功能具有协同特性。本实验有助于解释HCV、HBV感染，尤其是共同感染的致病（癌）机制。     

人LDLR基因的克隆及在Hepa1-6细胞中的表达

目的 :从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因 ,构建其真核表达质粒 ,并在小鼠肝癌细胞Hepa1 6中进行表达。方法 :从HepG2中提取总RNA ,采取逆转录PCR(RT PCR)方法得到人LDLR的cDNA。将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中 ,进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3 hLDLR和空载体转入Hepa1 6 ,G4 18筛选 ,并用RT PCR和FACS检测人LDLR基因转录和蛋白的表达。结果 :人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,双酶切和测序表明 ,克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性 ,但编码的氨基酸序列完全一致 ,该序列的GenBank登录号为gi|2 16 2 96 4 7|gb|AY114 15 5 .1,并且真核表达质粒的构建正确。用脂质体介导的方法转入Hepa1 6后 ,用RT PCR和FACS检测表明 ,细胞可表达人LDLR。结论 :成功地构建了真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用 ,以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础。