成人骨髓间充质干细胞的分离、鉴定和生物学特性

背景:骨髓间充质干细胞具有自我复制的能力、多向分化和增殖的潜能,但骨髓中间充质干细胞的含量极少,因此体外纯化和扩增极其重要。目的:拟建立体外分离培养、纯化骨髓间充质干细胞的方法,观察其增殖及生长特性。设计、时间及地点:单一样本观察实验,于2006-05/2007-12在北京协和医院胸心外科实验室和桂林医学院附属医院中心实验室完成。材料:骨髓血来源于成人肋骨骨髓。方法:收集成人骨髓血,采用密度为1.077的Ficoll淋巴细胞分离液提取成体人骨髓单个核细胞,根据骨髓间充质干细胞易于贴壁的特性除去未贴壁细胞获取骨髓间充质干细胞。取第2~3代细胞在-80℃条件下冻存,24h后复苏,观察活细胞数,按2×103/cm2种植扩增,扩增时保持细胞密度为2×103/cm2~8×103/cm2。主要观察指标:倒置显微镜和相差倒置显微镜观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞抗原表达,采用细胞计数方法绘制原代培养和传代培养细胞生长曲线。结果:原代培养接种三四小时后细胞开始贴壁,24h后贴壁细胞数量明显增多,3d后贴壁细胞为单个或几个细胞克隆,散在分布,大部分细胞呈纺锤形。7~9d后集落迅速增多细胞融合,细胞数量约增加了10倍;10~12d,细胞数量增加了约20倍,铺满了全层,细胞排列也有一定的方向性,呈旋涡样生长,旋涡中心细胞呈多层分布。骨髓间充质干细胞表达KDR、CD105,不表达CD34、CD45、CD11a、CD14、HLADR等。原代细胞培养曲线显示,第2~6天为生长潜伏期,第8~10天进入对数增长期,第12~14天进入个平台期;传代培养的潜伏期为24~48h,对数增长期为4~6d,细胞的增殖、生长逐渐缓慢,接种后8到9天进入平台期。结论:利用密度梯度离心和贴壁的方法获取的骨髓间充质干细胞具有大量增殖的能力,表达CD105、KDR,不表达HLA-DR、CD34、CD45、CD11a、CD14。     

人骨髓间充质干细胞表型及其增殖特性

目的:分离培养及纯化人骨髓间充质干细胞,鉴定其表型与增殖特性。方法:实验于2006-11在上海复旦大学遗传工程国家重点实验室完成。①由上海浦东妇幼保健医院协助,骨髓标本采自因意外事故流产死亡的正常胎儿,产妇及其家属均签署知情同意书,实验经过医学伦理委员会批准。②无菌操作分离死亡2h内的胎儿下肢股骨、胫骨,贴壁筛选法分离培养胎儿骨髓间充质干细胞。细胞长满80%左右用胰酶消化传代,1∶4传于新的培养瓶中,原代培养结束。传代培养细胞长满后均按1∶3或1∶4传代,用a-MEM 胎牛血清 二甲基亚枫冻存备用。③倒置相差显微镜下观察原代及传代培养的人骨髓间充质干细胞的生长情况及形态变化。MTS法绘制细胞生长曲线,荧光激活细胞分选术鉴定细胞表面分子,流式细胞术检测细胞周期,Real-timePCR分析不同代次细胞转录因子oct-4的表达丰度。结果:①人骨髓间充质干细胞的生长情况及形态观察:接种48h后,贴壁细胞呈梭形、多角形成纤维细胞样形态,大小均一。传代培养细胞已看不到血细胞贴壁,形态更加均一,呈克隆样生长。传至18代后生长减慢,20代后出现胞浆空泡化、胞体变大等老化现象。②人骨髓间充质干细胞的生长曲线:细胞贴壁48h基本无增殖,处于潜伏期;对数增殖期为3～5d,第6天后进入平台期,细胞出现接触抑制现象。③人骨髓间充质干细胞表面标记鉴定:第2代人骨髓间充质干细胞纯度可达98%以上,其细胞表型CD29,CD90,CD166呈阳性表达,CD34,CD45呈阴性表达。④人骨髓间充质干细胞周期检测结果:培养的第2代人骨髓间充质干细胞82%以上处于G0/G1期,处于S期的细胞比例不到10%,8%左右的细胞处于G2/M期,保持了较高的增殖潜能。⑤转录因子oct-4在人骨髓间充质干细胞中的表达:oct-4在第3,7,12,18代人骨髓间充质干细胞中的表达丰度呈略下降的趋势(0.68±0.08,0.64±0.12,0.61±0.04,0.60±0.14),但第7,12,18代与第3代比较差异无显著性意义(P=0.65,P=0.27,P=0.41)结论:人骨髓间充质干细胞容易体外分离培养,增殖旺盛,普通条件能够保持间充质干细胞的特性,培养较长时间而不分化。     

人骨髓间充质干细胞生长特性及碱性成纤维细胞生长因子对其增殖的影响

目的:观察人骨髓间充质干细胞的生长特性及表面标记,探讨碱性成纤维细胞生长因子对其增殖的影响。方法:实验于2003-02/2005-10在大连医科大学附属第一医院中心实验室、苏州大学附属儿童医院骨科实验室完成。①骨髓组织均取自单纯性骨囊肿行自体骨髓注射治疗的患者,年龄10～16岁,全部在患者家属的同意下,于后方髂嵴骨髓穿刺,一次性采集骨髓20mL。Percoll梯度离心,附壁筛选人骨髓间充质干细胞进行原代培养。②原代接种后48h换液,待贴壁细胞即将铺满瓶底时用胰酶消化分离,按3×103/cm2密度接种于6孔培养板,记为P1;传代培养过程中贴壁细胞彼此融合,铺满整个培养板的底面时,再重复以上操作,记为P2,以此类推,传代培养直至细胞出现衰老征相。③取第2代间充质干细胞,消化后计数2×105细胞与抗CD34,CD44抗体室温反应30min,流式细胞仪分析细胞表型。④将生长良好的第2代人骨髓间充质干细胞以500个/孔种植在96孔培养板中,加入完全培养液的同时,再加入碱性成纤维细胞生长因子,使其成为浓度分别为0,1,5,10,25,50,100μg/L的条件培养基,每个浓度重复5孔。培养2d后,于各小孔内加入5g/L噻唑蓝20μL,继续培养4h后每孔加入二甲基亚砜200μL,用酶标仪在492nm波长下检测人骨髓间充质干细胞增殖情况。⑤实验分组同上,各培养孔加入TritonX-100100μL,4℃过夜,每孔加入碱性磷酸酶底物液150μL,酶联免疫监测仪测定410nm波长下人骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶的活性。结果:①人骨髓间充质干细胞原代和传代培养的生长曲线分析:原代接种后5～9d为细胞生长潜伏期,11～16d为对数增殖期,18～20d为生长平台期。传代培养细胞生长潜伏期为12～24h,对数增殖期为7～10d,11～13d进入细胞生长平台期。②人骨髓间充质干细胞的表型:人骨髓间充质干细胞均一表达CD44,不表达CD45。③碱性成纤维细胞生长因子对人骨髓间充质干细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响:与空白对照比较,较低浓度的10μg/L碱性成纤维细胞生长因子即可显著促进人骨髓间充质干细胞增殖(t=2.852,P<0.05),且与其浓度成正性量效关系。25～100μg/L碱性成纤维细胞生长因子对人骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶的活性均可产生显著抑制作用(t=3.248,P均<0.05)。结论:人骨髓间充质干细胞可在体外迅速扩增,碱性成纤维细胞生长因子对其增殖作用与浓度成正性剂量-效应关系。     

人骨髓间充质干多细胞生长特性及碱性成纤维细胞生长因子对其增殖的影响

目的观察人骨髓间充质干细胞的生长特性及表面标记,探讨碱性成纤维细胞生长因子对其增殖的影响.方法实验于2003-02/2005-10在大连医科大学附属第一医院中心实验室、苏州大学附属儿童医院骨科实验室完成.①骨髓组织均取自单纯性骨囊肿行自体骨髓注射治疗的患者,年龄10～16岁,全部在患者家属的同意下,于后方髂嵴骨髓穿刺,一次性采集骨髓20 mL.Percoll梯度离心,附壁筛选人骨髓间充质干细胞进行原代培养.②原代接种后48 h换液,待贴壁细胞即将铺满瓶底时用胰酶消化分离,按3×103/cm2密度接种于6孔培养板,记为P1;传代培养过程中贴壁细胞彼此融合,铺满整个培养板的底面时,再重复以上操作,记为P2,以此类推,传代培养直至细胞出现衰老征相.③取第2代间充质干细胞,消化后计数2×105细胞与抗CD34,CD44抗体室温反应30 min,流式细胞仪分析细胞表型.④将生长良好的第2代人骨髓间充质干细胞以500个/孔种植在96孔培养板中,加入完全培养液的同时,再加入碱性成纤维细胞生长因子,使其成为浓度分别为0,1,5,10,25,50,100μg/L的条件培养基,每个浓度重复5孔.培养2 d后,于各小孔内加入5 g/L噻唑蓝20μL,继续培养4 h后每孔加入二甲基亚砜200μL,用酶标仪在492 nm波长下检测人骨髓间充质干细胞增殖情况.⑤实验分组同上,各培养孔加入Triton X-100 100μL,4 ℃过夜,每孔加入碱性磷酸酶底物液150μL,酶联免疫监测仪测定410nm波长下人骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶的活性.结果①人骨髓间充质干细胞原代和传代培养的生长曲线分析原代接种后5～9 d为细胞生长潜伏期,11～16 d为对数增殖期,18～20 d为生长平台期.传代培养细胞生长潜伏期为12～24 h,对数增殖期为7～10 d,11～13 d进入细胞生长平台期.②人骨髓间充质干细胞的表型人骨髓间充质干细胞均一表达CD44,不表达CD45.③碱性成纤维细胞生长因子对人骨髓间充质干细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响与空白对照比较,较低浓度的10μg/L碱性成纤维细胞生长因子即可显著促进人骨髓间充质干细胞增殖(t=2.852,P＜0.05),且与其浓度成正性量效关系.25～100μg/L碱性成纤维细胞生长因子对人骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶的活性均可产生显著抑制作用(t=3.248,P均＜0.05).结论人骨髓间充质干细胞可在体外迅速扩增,碱性成纤维细胞生长因子对其增殖作用与浓度成正性剂量-效应关系.     

兔激素性股骨头坏死模型骨髓间充质干细胞的培养

背景:自体干细胞移植治疗已经成为目前组织工程和再生医学研究的重点。但对于兔激素性股骨头坏死模型自体骨髓移植中骨髓间充质干细胞的体外培养研究鲜有报道。目的:抽提兔激素性股骨头坏死模型的骨髓间充质干细胞,并行体外扩增和表型鉴定。方法:取成年大耳白兔10只,对照组2只不给任何药物;模型组8只每周2次臀肌注射甲基强的松龙8mg/kg制备兔激素性股骨头坏死模型。体外分离培养骨髓间充质干细胞;应用流式细胞仪分别检测第4代骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD34、CD44的表达。结果与结论:经过大量激素作用后,MR灌注成像及病理切片结果显示兔激素性股骨头坏死模型组造模成功。模型组原代骨髓间充质干细胞4h内仅有少量细胞贴壁,12d左右细胞铺满瓶底的85%-90%,传代培养生长良好;第4代骨髓间充质干细胞生长曲线呈典型S型,第4-7天处于高速增殖期,与对照组生长曲线相近;经流式细胞术鉴定,第4代骨髓间充质干细胞表面抗原CD34表达呈阴性,CD29,CD44表达呈阳性,证明所培养的细胞为较纯的骨髓间充质干细胞。提示兔激素性股骨头坏死模型的骨髓间充质干细胞具有较强的生长和增殖能力,可用于干细胞标记及进一步自体移植治疗。     

兔激素性股骨头坏死模型骨髓间充质干细胞的培养

背景：自体干细胞移植治疗已经成为目前组织工程和再生医学研究的重点。但对于兔激素性股骨头坏死模型自体骨髓移植中骨髓间充质干细胞的体外培养研究鲜有报道。目的：抽提兔激素性股骨头坏死模型的骨髓间充质干细胞,并行体外扩增和表型鉴定。方法：取成年大耳白兔10只,对照组2只不给任何药物;模型组8只每周2次臀肌注射甲基强的松龙8mg/kg制备兔激素性股骨头坏死模型。体外分离培养骨髓间充质干细胞;应用流式细胞仪分别检测第4代骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD34、CD44的表达。结果与结论：经过大量激素作用后,MR灌注成像及病理切片结果显示兔激素性股骨头坏死模型组造模成功。模型组原代骨髓间充质干细胞4h内仅有少量细胞贴壁,12d左右细胞铺满瓶底的85%-90%,传代培养生长良好;第4代骨髓间充质干细胞生长曲线呈典型S型,第4-7天处于高速增殖期,与对照组生长曲线相近;经流式细胞术鉴定,第4代骨髓间充质干细胞表面抗原CD34表达呈阴性,CD29,CD44表达呈阳性,证明所培养的细胞为较纯的骨髓间充质干细胞。提示兔激素性股骨头坏死模型的骨髓间充质干细胞具有较强的生长和增殖能力,可用于干细胞标记及进一步自体移植治疗。     

人脐带血和骨髓来源间充质干细胞的体外分离、培养、分化及生物学特性比较

背景:间充质干细胞由于具有自我更新能力且在适宜微环境下具有多向分化潜能,近年来已成为细胞领域的研究热点.目的:对比观察脐带血与骨髓来源的间充质干细胞其体外分离、纯化及培养条件,并对其进行生物学特性比较.设计:体外细胞学对比观察.材料:新鲜脐带血在征得产妇同意后采集.骨髓由健康的成年志愿者捐赠.方法:取脐带血和成人骨髓分离、培养并纯化间充质干细胞,对获得的间充质干细胞进行形态学观察.主要观察指标:两种来源间充质干细胞的形态和生长特性;流式细胞仪检测脐带血间充质干细胞表面抗原的表达情况;对脐带血间充质干细胞多向分化的能力进行鉴定.结果:两种来源的单个核细胞经体外培养贴壁后均出现间充质样细胞,原代骨髓间充质干细胞的贴壁时间和培养时间均短于脐带血间充质干细胞,两种细胞传代生长呈共同特性:传代培养潜伏期为24～36h,传代培养对数增殖期为接种后3～7d,接种后八九天,生长进入平台期:脐带血来源的间充质干细胞表达相关抗原CD29、CD44、CD105;但不表达造血细胞抗原CD34、CD45:脐带血间充质干细胞可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞.结论:人脐带血和骨髓来源间充质干细胞均可在体外分离培养、扩增:脐带血的间充质干细胞原代贴肇时间、形成细胞克隆的时间、集落交错融合的时间均较骨髓间充质干细胞晚,传代培养的细胞形态,生长速度均无明显差异;两种来源的间充质干细胞具有相同的表面标志物;脐带血间充质干细胞有多项分化潜能,可诱导为脂肪细胞、成骨细胞.     

冲击波对骨髓间充质干细胞中c-Fos、c-Jun蛋白表达的影响

背景:目前,冲击波疗法被广泛的用于治疗骨不连、骨折延迟愈合和股骨头坏死以及运动系统慢性劳损性疾病,取得了很好的疗效,但其作用机制并不明确.目的:观察体外冲击波作用于骨髓间充质干细胞后c-Fos、c-Jun蛋白表达的变化情况.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2007-03/2008-03在吉林大学基础医学院病理学国家重点实验室完成.材料:骨髓来源于健康志愿者.方法:体外培养人骨髓间充质干细胞,取P4代细胞,加入2.5 g/L胰蛋白酶消化制成细胞悬液,用无血清低糖DMEM培养基调整细胞密度在1.0×10~9L~(-1)的水平,然后取6 mL细胞悬液,分装入6个1.5 mL.的Eerrendorf管内,1管为对照组,5管为诱导组.将诱导组Eerrendorf管置入体外液电冲击波碎石机中,采用最佳冲击波强度(工作电压8.5 kV,脉冲次数为120次)作用于细胞,分别在作用后5,15,30 min,1,2 h提取蛋白质.主要观察指标:倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞形态变化:四甲基偶氮唑盐法测定细胞生长曲线;Western Blot检测细胞内c-Fos、c-Jun蛋白表达的变化.结果:①骨髓间充质干细胞接种于培养板,细胞呈圆形,24 h后,细胞开始缓慢分裂、增殖,半量换液后见贴壁细胞形态 呈梭形.第3天后细胞增殖加快,呈团簇集落样生长.10～14 d各个细胞克隆增大,直至铺满培养板底面达到融合状态.传代培养的骨髓间充质干细胞呈圆形,24 h内完全贴壁,形态与原代培养的细胞类似,1周左右达到完全融合,呈漩涡状排列.传至10代以后,细胞分裂增殖速度明显减慢,细胞逐渐老化.②四甲基偶氮唑盐结果显示:原代及P2、P3代的人骨髓间充质干细胞生长曲线呈S型,在第3-5天为增殖旺盛期.⑨体外冲击波诱导后,人骨髓间充质干细胞中c-Fos、c-Jun的磷酸化水平开始增高,分别于30,15 min后达高峰,分别为对照组的2.56倍,1.68倍(P<0.01),之后逐渐下降;c-Fos、c-Jun的总量未见明显变化(P>0.05).结论:体外冲击波作用于体外培养的人骨髓间充质干细胞后,呈现了细胞内c-Fos、c-Jun蛋白活性增高的变化.     

红细胞裂解法分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞

背景:骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量非常少,而且与其他细胞特别是易与红细胞相混杂,因此在分离过程中需去除干扰,以获得尽可能多的高纯度的骨髓间充质干细胞。目的:采用红细胞裂解法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,同时进行生物学鉴定。设计:观察对比实验。单位:中国航天员科研训练中心航天细胞分子生物学实验室。材料:选用50只生后30d的雄性SD大鼠,体质量100g,SPF级,购自北京实验动物中心(合格证:SCXK(京)2002-0003)。DAB浓缩显色液(含过氧化氢,中杉公司),兔抗大鼠多克隆抗体(武汉博士德公司),FCS(PAA,Austria),LG-DMEM培养基(Sigma,USA)。方法:实验于2004-09/2005-09在中国航天员科研训练中心航天细胞分子生物学实验室完成。将大鼠脱臼处死,暴露骨髓腔,收集细胞悬液,采用全骨髓培养法对骨髓间充质干细胞分离与原代培养。①红细胞裂解实验:取A、B、C、D4管分别加入0.5mL过滤并充分吹打均匀后的骨髓冲洗液,分别对应加入红细胞裂解液、氯化氨2mL、磷酸盐缓冲生理盐水2mL和体积分数为0.04的乙酸溶液0.5mL,分别测量各组吸光度值及血红蛋白浓度,并观察细胞生长情况。②骨髓间充质干细胞生长曲线、倍增时间及表面标志分子表达情况的观察:根据公式:群体倍增时间(TD)=t[lg2/(lgNt-lgN0)](N0和Nt分别代表接种后和培养t小时的细胞数),计算出细胞的群体倍增时间并描绘并分析骨髓间充质干细胞第2、4、6代细胞的生长曲线;采用亚甲基兰染色测定骨髓间充质干细胞增殖情况;采用免疫细胞化学染色检测骨髓间充质干细胞表面标志分子表达情况。主要观察指标:①大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养的观察结果。②不同处理方法对红细胞的裂解效果及其对骨髓间充质干细胞生长的影响。③第2、4、6代细胞的生长曲线及细胞倍增时间。④大鼠骨髓间充质干细胞表面标志分子表达情况。结果:①大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养结果:原代培养48h后大部分细胞已贴壁,72h时贴壁细胞已开始分裂增殖。7￣8d后可见有明显集落形成,之后集落迅速增多,不断扩大,互相融合,14～16d时细胞克隆生长稠密。刚传代的细胞呈球形,很快沉降贴壁,少部分圆形细胞悬浮。贴壁细胞均匀分布,3～5d增殖迅速。虽然传代后细胞形态未变,但增殖速度明显增快,约6d长满培养瓶底。②不同处理方法对红细胞的裂解效果及其对骨髓间充质干细胞生长的影响:红细胞裂解液处理组,氯化氨处理组和4%乙酸处理组的血红蛋白浓度明显高于磷酸盐缓冲生理盐水处理组,差异有显著性(P<0.01)。③不同代骨髓间充质干细胞的生长曲线观察结果:第2,4,6代细胞生长曲线基本相同,经过一两天的潜伏适应期后进入对数生长期,第5天达顶点,以后进入平台期(在第5～7天)。第6代骨髓间充质干细胞的潜伏期表现不明显骨髓间充质干细胞的群体倍增时间平均约为34h。④不同代骨髓间充质干细胞的免疫表型鉴定:各代细胞CD44和CD106染色均呈阳性,表现为棕黄色颗粒沉淀,CD34染色呈阴性。结论:采用红细胞裂解液处理骨髓冲洗液后再行接种,能提高骨髓间充质干细胞的贴壁效率,同时不影响其贴壁后的生长,是一种可行的分离方法。细胞表面标记染色鉴定证明,本实验所分离细胞是骨髓间充质干细胞。     

脐带源间充质干细胞体外分离培养后形态学与表面抗原的鉴定

目的:观察脐带中含有的间充质干细胞体外分离、纯化及培养条件,并对其进行生物学特性、分化能力和表面抗原的鉴定。方法:实验于2004-10/2005-07在江苏省人民医院中心实验室完成。①无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带近胎儿段,剔除动静脉,取出其中的间质组织,胶原酶消化法原代培养细胞进行培养和纯化获得贴壁细胞。②用流式细胞仪检测间充质干细胞表面抗原的表达情况。③对间充质干细胞多向分化的能力进行初步鉴定。结果:①来源于脐带的单个核细胞经体外培养贴壁后出现间充质样的细胞,间充质细胞为成纤维样的细胞形态。②第1,3,5,7代细胞生长曲线基本相同。其生长共同特性:传代培养潜伏期约为24～36h;传代培养对数增殖期约为4～6d;对数增殖期结束后至接种后八九天,生长进入平台期。③表达间充质干细胞相关的抗原CD105,CD44,但不表达造血细胞抗原CD34,CD45,这与源于骨髓的间充质干细胞一致。④加入诱导剂5h后表现出典型的神经元样细胞形态,伴少量细胞开始死亡。24h后死亡细胞明显增多;诱导后的神经元样细胞NSE表达明显增强。结论:人脐带来源的间充质干细胞能在体外培养、扩增,并且具有和骨髓源间充质干细胞类似的生物形态和抗原表型。