构建RNA干扰真核表达载体靶向抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231内的VEGF-C表达之研究

目的:通过构建RNA干扰真核表达载体人乳腺癌细胞株MDA-MB-231内VEGF-C后的生物学变化。方法:构建pGCsi-VEGF-C真核表达载体,建立VEGF-C稳定低表达的MDA-MB-231人乳腺癌细胞株,检测该细胞株的体外增殖和侵袭能力及体内移植瘤生长和淋巴结转移的变化。结果:成功构建了pGCsi-VEGF-C真核表达载体,沉默效率达90%;筛选并获得VEGF-C稳定低表达的MDA-MB-231细胞株,该细胞株的体外增殖及侵袭能力,分别下降40%和35%,体内移植瘤的生长减慢和癌细胞淋巴结转移数量明显下降(P0.05)。结论:VEGF-C的表达量下降可显著降低MDA-MB-231细胞株的增殖、侵袭及淋巴结转移能力。     

VEGF-C在乳腺癌中的表达及与淋巴管生成的关系

目的探讨血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C）在乳腺癌组织中的表达、临床意义及其与淋巴管生成的关系。方法应用免疫组化检测乳腺癌组织及良性腺瘤组织中VEGF-C的表达情况,用淋巴管特异性标志物D2-40标记淋巴管并计数,分析两者之间的相关性,并结合临床病理资料进行统计分析。结果 VEGF-C在乳腺癌组织中的表达率为58.7%（27/46）,其表达与肿瘤大小（P=0.006）、淋巴结转移相关（P=0.01）,与年龄、雌、孕激素受体表达、Her-2表达情况及临床分期无相关性;淋巴管密度（LVD）与临床分期（P=0.01）和淋巴结转移（P=0.001）呈正相关性;VEGF-C的表达与淋巴管生成有显著相关性（P〈0.05）。结论 VEGF-C的表达与淋巴管密度存在显著的相关性,提示VEGF-C可能通过信号传导途径促进肿瘤淋巴管的生成,进而诱导淋巴结转移的发生。     

乳腺癌患者血清VEGF—C水平与癌组织C—erbB-2蛋白的表达及临床意义

目的 探讨乳腺癌患者血清血管内皮生长因子C (VEGF-C)水平及癌组织中C-erbB-2蛋白表达及其临床意义.方法 选取女性乳腺浸润性导管癌患者和乳腺良性病变患者各62例,采用ELISA法检测患者术前和术后1个月血清VEGF-C水平,免疫组织化学法检测乳腺癌组织C-erbB-2蛋白表达,分析VEGF-C与乳腺癌临床病理特征及C-erbB-2蛋白表达的关系.结果 乳腺癌患者术前血清VEGF-C水平为(279.65±17.34) pg/ml,乳腺良性病变患者为(167.26±12.15) pg/ml,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01).乳腺癌患者术后1个月血清VEGF-C水平为(209.45±15.23) pg/ml,与其术前比较差异有统计学意义(P＜0.01).VEGF-C水平与原发肿瘤分期有关(P＜0.05),与患者年龄、肿瘤大小、有无淋巴结转移、绝经情况及ER和PR的表达无关(P>0.05).C-erbB-2蛋白在乳腺癌中的表达阳性率为54.84%(34/62),明显高于乳腺良性病变的11.29%(7/62),P＜0.01.乳腺癌腋窝淋巴结转移患者的C-erbB-2蛋白表达阳性率(69.44%)明显高于腋窝淋巴结无转移患者(34.62%,P＜0.05).血清VEGF-C水平随癌组织中C-erbB-2阳性表达强度增强而增高,两者呈正相关(r=0.813,P＜0.05).结论 乳腺疾病患者血清中VEGF-C水平可能成为鉴别乳腺良、恶性病变的辅助指标之一; C-erbB-2与乳腺癌淋巴结转移有关; 在乳腺癌的淋巴转移途径中VEGF-C可能与C-erbB-2存在着协同作用.     

USP47促进三阴性乳腺癌进展的机制

目的探讨USP47促进乳腺癌进展的作用及其机制。方法应用蛋白质印迹法(Western blot)和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)实验技术检测USP47在乳腺癌细胞株MDA-MB-231、BT-549和正常乳腺细胞系MCF-10A(乳腺癌和正常乳腺细胞系均购自ATCC细胞库)中的表达。利用siRNA-USP47敲低MDA-MB-231、BT-549中USP47的表达。应用Transwell检测乳腺癌细胞的迁移能力。利用细胞计数实验(CCK-8)、平板克隆和EDU实验检测MDA-MB-231、BT-549细胞的增殖能力。采用Western blot检测蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和基质金属蛋白酶(MMP)-9的表达。两组之间比较采用独立样本t检验。结果 USP47在MDA-MB-231和BT-549中USP47的表达明显高于正常乳腺癌细胞MCF-10A(MDA-MB-231:2.70±0.53, BT-549:2.50±0.65, MCF-10A:1.00±0.00)。差异有统计学意义(MDA-MB-231:t=4.49, ...     

乳腺癌组织中血管内皮生长因子-C和人类表皮生长因子-2的表达及意义

目的:探讨乳腺癌组织中血管内皮生长因子-C(VEGF-C)及原癌基因人类表皮生长因子-2(C-erbB-2)的表达及其与临床病理特征间的关系。方法:应用免疫组化法检测76例乳腺癌组织和20例乳腺良性病变组织中的VEGF-C和C-erbB-2表达。结果:VEGF-C和C-erbB-2在乳腺癌中的阳性表达率分别为72.37%和51.31%,均高于其在乳腺良性病变组织中的表达(P0.05),而与腋窝淋巴结转移有关(P<0.05);同时,VEGF-C的表达还与临床病理分期有关(P<0.05)。结论:VEGF-C和C-erbB-2参与了乳腺癌的发生、发展过程,可作为临床上判断乳腺癌病人预后的指标。     

小RNA干扰VEGF-C基因表达对乳腺癌细胞增殖及凋亡的体外研究

目的:利用质粒pSilencer3.0-H1构建人血管内皮生长因子-C(VEGF-C)基因经小RNA干扰(siRNA)的表达载体,体外研究其对人乳腺癌细胞MDA-MB-435的增殖及凋亡作用,为乳腺癌VEGF-C基因靶向RNA干扰治疗的可行性作初步探讨.方法:构建3组针对VEGF-C的pSilencer3.0.VEGF-C/siRNA表达载体和1组阴性对照序列.测序鉴定后.将脂质体介导转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-435.用RT-PCR和Western Blot检测转染前后VEGF-C基因的表达.挑选干扰效率最强的一组表达载体.以MTT法和流式细胞仪检测经siRNA干扰的VEGF-C对人乳腺癌细胞MDA-MB-435的体外作用.结果:经测序鉴定,VEGF-C基因的siRNA表达载体构建成功,转染人乳腺癌细胞MDA-MB-435后,检测显示VEG-C基因和蛋白水平表达量明显降低,抑制率最高达854%,细胞体外生长缓慢,72 h后凋亡率达60%.结论:针对人VEGF-C基因的siRNA表达载体能抑制VEGF-C的基因表达.促进了人乳腺癌细胞MDA-MB-435的凋亡,可进一步发挥治疗作用.     

吗啡对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及血管内皮生长因子表达的影响

目的探究吗啡对三阴性乳腺癌细胞(人乳腺癌MDA-MB-231细胞)增殖及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,并对PI3K-AKT-c-Myc信号通路的激活在此过程中的作用进行初步探讨。方法将人乳腺癌MDA-MB-231细胞随机分为阴性对照组(N组)、1μmol/L吗啡组(1μM组)、10μmol/L吗啡组(10μM组)以及100μmol/L组(100μM组),分别予无血清培养基、含1μmol/L吗啡的无血清培养基、含10μmol/L吗啡的无血清培养基及含100μmol/L吗啡的无血清培养基处理。处理后对各组细胞行MTS法检测细胞增殖情况,并行Western Blot实验检测细胞内VEGF、c-Myc的表达及AKT蛋白磷酸化水平。结果与N组相比,不同浓度吗啡处理对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、细胞内VEGF、c-Myc的表达及AKT蛋白磷酸化均有促进作用,其中以10μM组作用最为显著(P0.05)。结论 10μmol/L吗啡可促进人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及VEGF的表达,此过程可能与激活细胞内PI3K-AKT-c-Myc信号通路有关。     

青蒿琥酯对MDA-MB-231细胞增殖抑制作用及其机制

目的 探讨青蒿琥酯(artesunate,ART)对乳腺癌雌激素受体阴性细胞MDA-MB-231抑制作用及其机制.方法 ART处理细胞3 d后,采用MTT比色法检测细胞增殖功能,观察细胞形态、结构的改变,免疫细胞化学检测Bax,nm23,Bcl-2,P21WAFl/CIPl蛋白的表达情况.结果 ART作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231后,发现其对细胞的抑制作用呈明显浓度依赖性,可导致细胞形态、结构改变;免疫细胞化学结果显示2μmol/L青蒿琥酯作用细胞72 h后,药物组同细胞对照组比较,可上调Bax、nm23、P21WAF1/CIP1蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05),Bcl-2蛋白质表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 ART有抑制MDA-MB-231细胞增殖的作用,其机制可能与上调Bax、nm23、P21WAF1/CIP1蛋白表达有关.     

乳腺癌细胞中表皮生长因子对雌激素受体表达的影响及机制

目的研究表皮生长因子（EGF）在雌激素受体（ER）阳性及阴性乳腺癌细胞株中对ER表达的影响及其可能的机制。方法以逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）技术分别研究EGF途径以及抑制该途径的信号传导后，对乳腺癌细胞株中ERcxmRNA的影响。结果在ER阳性乳腺癌细胞株中，EGF能显著抑制ERα mRNA的表达（P〈0．05），而通过抑制表皮生长因子受体（EG-FR）、磷脂酰肌醇3激酶（P13K）阻断EGF信号传导可减弱上述抑制作用（P〈0．05）；在ER阴性乳腺癌细胞株中，ERα mRNA无显著变化。结论EGF能够明显抑制ER阳性乳腺癌细胞株中ER的表达，这种抑制作用可能通过EGFR、蛋白激酶B（PKB，又称AKt）信号传导途径完成；这种作用在ER阴性乳腺癌细胞株中并不明显。     

FOXC2介导Hedgehog/Gli信号通路对乳腺癌侵袭及迁移的影响

目的探讨FOXC2介导Hedgehog/Gli信号通路通过调控上皮间质转化（EMT）途径参与乳腺癌侵袭及迁移的机制。 方法应用不同浓度环靶明（Cyclopamine）处理乳腺癌MDA-MB-231细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率及计算药物半数抑制浓度（IC₅₀）;采用Cyclopamine或沉默FOXC2基因表达以阻断Hedgehog/Gli信号通路活化;通过Transwell小室体外侵袭实验及划痕实验分别检测阻断Hedgehog/Gli信号通路对MDA-MB-231细胞侵袭及迁移影响;Western blotting检测阻断前后Hedgehog/Gli信号通路分子Smoothened（Smo）、Gli1和EMT相关标志物FOXC2,E-cadherin及Vimentin蛋白表达变化。 结果与空白对照组比较,Cyclopamine可显著地抑制MDA-MB-231细胞增殖并呈现时效-量效关系,48 h的IC₅₀为25 μmol/L。Transwell小室体外侵袭实验及划痕实验均显示,与未转染组及Control-siRNA组相比,FOXC2-siRNA组和Cyclopamine组细胞穿膜数及迁移率均显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）。Western blotting显示,与未转染组及Control-siRNA组相比较,FOXC2-siRNA组及Cyclopamine组Smo、Gli1及FOXC2蛋白表达显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）。而沉默FOXC2表达可显著降低Vimentin蛋白表达及增加E-cadherin蛋白表达,差异有统计学意义（P<0.05）。 结论FOXC2通过介导Hedgehog/Gli信号通路从而调控EMT促进乳腺癌侵袭及迁移,提示阻断该信号通路有望成为乳腺癌靶向治疗新线索。     

环氧合酶-2对乳腺癌淋巴管形成的影响

目的探讨环氧合酶-2（COX-2）对人乳腺癌淋巴管形成的影响。方法1998年11月至2002年3月行手术治疗并经病理证实的乳腺癌患者94例,随访83例,失访11例。免疫组织化学方法检测COX-2、血管内皮生长因子-C（VEGF—C）及D2-40在乳腺癌中的表达。逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和Western印迹法分别检测加入不同浓度COX-2抑制剂尼美舒利后VEGF-CmRNA及蛋白的变化。Western印迹法检测加入外源性前列腺素E2（PGE2）和曲妥珠单抗后VEGF—C蛋白的变化。结果46．8％的乳腺癌组织呈COX-2高表达,51．1％呈VEGF—C高表达。COX-2与VEGF—C（P〈0．01）、淋巴管密度（P=0．032）和淋巴结转移（P＝0．035）呈正相关,与乳腺癌患者的无病生存率（P=0．010）和总生存率（P＝0．040）呈负相关。尼美舒利以剂量依赖性方式下调VEGF-CmRNA及蛋白表达,而PGE2上调其蛋白表达。曲妥珠单抗可显著降低VEGF—C的蛋白表达。结论COX-2可通过上调VEGF—C的表达,促进乳腺癌的淋巴管形成和淋巴结转移,并影响乳腺癌患者的预后。     

雌激素受体β1在MDA-MB-231人乳腺癌细胞中高表达对雷诺昔芬抗肿瘤作用的影响

目的探究雷诺昔芬（RAL）对乳腺癌中过表达雌激素受体（ER）β1的MDA-MB-231细胞的抑制作用。 方法用含ERβ1基因的HIV慢病毒转染乳腺癌MDA-MB-231细胞,获得稳定表达ERβ1的乳腺癌细胞株。采用RT-PCR法检测转染细胞中ERβ1 mRNA的表达水平,Western blotting法检测细胞中ERβ1蛋白的表达水平;各细胞亚型分别于0、1、10 μmol/L的RAL共培养48 h,观察RAL对ERβ1高表达细胞株及对照细胞株治疗作用的差异。 结果HIV慢病毒转染后细胞绿色荧光表达效率达到90%以上;RT-PCR检测显示阳性转染组MDA-MB-231/ERβ1细胞中ERβ1 mRNA水平较阴性转染组提高了12.9倍（P<0.05）;阳性转染组细胞中ERβ1蛋白水平也相应提高;细胞实验表明高浓度（10 μmol/L）的RAL对MDA-MB-231细胞有明显的增殖抑制作用,特别是对ERβ1高表达细胞株的抑制作用更加明显（F=9.273,P=0.015）。 结论在乳腺癌MDA-MB-231细胞中,ERβ1高表达可以使细胞对RAL更加敏感。     

miR-204对TFAM的靶向调控作用及其对乳腺癌细胞生长与增殖的影响

目的:探讨乳腺癌细胞中miR-204对线粒体转录因子A(TFAM)的靶向调控作用及其与细胞生长、增殖的关系。方法:将人乳腺癌MDA-MB-231细胞分别转染mi R-204模拟物或miR-204抑制物,用real-time PCR和Western blot分别检测mi R-204与TFAM蛋白的表达;构建荧光酶报告基因质粒(mut-TFAM/wt-TFAM),将其与mi R-204模拟物或miR-204抑制物共转染MDA-MB-231细胞后检测荧光酶活性变化;构建pc DNA3.1/TFAM质粒,将其单独或与mi R-204模拟物共转染MDA-MB-231细胞后检测TFAM蛋白表达,并用MTT法和Brd U法检测细胞生长与增殖情况。结果:MDA-MB-231细胞转染mi R-204模拟物后mi R-204的表达明显升高,而TFAM蛋白表达明显降低,转染miR-204抑制物后则呈反向变化(均P0.05)。wt-TFAM与mi R-204模拟物共转染时荧光酶活性明显下降,与mi R-204抑制物共转染时荧光酶活性明显升高(均P0.05)。转染pc DNA3.1/TFAM后,MDA-MB-231细胞的TFAM m RNA及蛋白表达量明显上调,细胞生长与增殖能力明显升高(均P0.05);mi R-204模拟物后,MDA-MB-231细胞在TFAM表达降低的同时,细胞生长与增殖能力明显降低,而与pc DNA3.1/TFAM共转染后其上述作用均被部分抵消(均P0.05)。结论:mi R-204能靶向抑制乳腺癌细胞TFAM的表达,从而抑制乳腺癌细胞的生长与增殖。     

基质金属蛋白酶-2和纤维粘连蛋白在乳腺癌细胞系的定量表达

目的分析乳腺癌细胞系的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和纤维粘连蛋白(FN)mRNA表达及蛋白表达与乳腺癌转移的关系，阐明MMP-2和FN在乳腺癌转移中的作用。方法采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)检测乳腺癌细胞系的MMP-2和FN mRNA表达量；采用Western blot方法检测细胞系的MMP-2和FN蛋白表达量。结果MMP-2和FN的mRNA表达量在乳腺癌高转移细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435中表达下调，而在低转移细胞系MDA-453、T47D、SK-BR-3和不转移细胞系MCF-7、ZR-75-30表达上调。MMP-2和FN蛋白表达在高转移细胞系上调，而在低转移细胞系和不转移细胞系中下调。结论MMP-2和FN mRNA表达和蛋白表达与乳腺癌转移相关，MMP-2和FN mRNA水平和蛋白水平的表达存在负反馈调节。     

人平衡型核苷载体在乳腺癌细胞中的表达情况及其对5-FU药效的影响

目的研究乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3、MCF-7中人平衡型核苷载体（hENTS）的表达及其对5氟尿嘧啶（5-Fu）细胞毒性的影响。方法MDA-MB-231、MDA—MB-468、SK-BR-3、MCF-7细胞常规培养于含10％小牛血清的高糖DMEM培养液中。逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）检测4种细胞株中hENTlmRNA及hENT2mRNA的表达。每种细胞分别在含有一定浓度序列（1．28×10^4ng／L～2．00×10^8ng／L）5-FU的培养液中培养48h。MTT法检测4种细胞株增殖,并计算其5-FU的半数抑制浓度（IC50）。结果①bENT1及hENT2mRNA在MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3细胞中的表达均较其在MCF-7细胞中（P伊〈0．05）,但其表达在MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3细胞中差异无统计学意义（P〉0．05）。hENT2mRNA表达在4种细胞中均较hENT1 mRNA表达低,差异有统计学意义（P〈0．05）。②MTT结果显示,5-FU的IC50在MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3细胞株中均较在MCF-7细胞株中低（P〈0．05）,在MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3细胞株之间差异无统计学意义（P〉0．05）。③在5-FU的IC50 较低的乳腺癌细胞株（MDA-MB-231、MDA—MB-468、SK-BR-3）中高表达hENTs,而在5-Fu的Ic50较高的乳腺癌细胞株（MCF-7）中,低表达hENTs或无表达。结论在乳腺癌细胞株中,细胞膜上hENTs的表达情况能显著影响5-FU的作用效果,其结果提示,在临床上可能需要依据hENTs的表达情况来选择核苷类抗癌药物。     

VEGF-C基因转染对人乳腺癌MCF-7细胞VEGF-C表达的影响

目的探讨将真核表达载体pcDNA3．1-VEGF—C重组质粒转染入人乳腺癌MCF-7细胞后VEGF-C表达的变化。方法通过脂质体介导方法，将构建好含有VEGF—C的重组质粒转染入人乳腺癌MCF-7细胞中，新霉素（G418）筛选得到稳定转染细胞系，RT—PCR和Western blot方法检测稳定转染后细胞中VEGF—C mRNA和蛋白的表达。结果成功转染并获得稳定高表达VEGF—C的乳腺癌MCF-7细胞系，其转染组VEGF—C mRNA相对吸光度值（12．382&#177;2．183）较空载组（6．039&#177;1．950）显著上调（P〈0．01）。Western blot检测转染组VEGF-C蛋白相对灰度值（0．971&#177;0．186）较空载组（0．594&#177;0．196）明显上调（P〈0．05）。结论脂质体介导重组质粒pcDNA3．1-VEGF-C转染入人乳腺癌MCF7细胞中可显著增加VEGF—C表达水平。     

Breast cancer increases osteoclastogenesis by secreting M-CSF and upregulating RANKL in stromal cells

BACKGROUND: Breast cancer metastasis to bone causes resorption of the mineralized matrix by osteoclasts.Macrophage colony stimulating factor (M-CSF)and receptor activator of the NF-kappaB ligand (RANKL) are produced by stromal cells and are essential for osteoclast formation. The human breast cancer cell line, MDA-MB-231, reliably forms bone metastases in a murine model and stimulates osteoclast formation in culture. We hypothesized that MDA-MB-231 stimulates osteoclast formation through secretion of M-CSF and/or RANKL. MATERIALS AND METHODS: We cocultured MDA-MB-231 and a bone marrow derived cell line, UAMS-33, and evaluated the expression of M-CSF and RANKL mRNA. Osteoclast formation was assessed using these cells added to hematopoietic cell cultures. RESULTS: MDA-MB-231 exhibited constitutive expression of M-CSF mRNA. As expected, addition of recombinant M-CSF (30 ng/ml) and RANKL (30 ng/ml) to hematopoietic osteoclast precursors supported osteoclast formation, while the addition of soluble RANKL alone or MDA-231 without added RANKL did not. Notably, coculture of MDA-231 with hematopoietic cells and added soluble RANKL stimulated significant osteoclast formation, indicating that MDA-231 served as an effective source for M-CSF. MDA-231 did not express RANKL. However, when cocultured with the murine bone marrow stromal cell line UAMS-33, RANKL expression was significantly increased in the latter cells. MDA-231 also stimulated osteoclast formation in coculture with UAMS-33 and hematopoietic cells. CONCLUSIONS: We conclude that MDA-MB-231 increases osteoclast formation by secreting adequate amounts of M-CSF protein and enhancing the expression of RANKL by stromal support cells. The ability to stimulate osteoclasts may explain the ability to metastasize to bone.     

RNA干扰下调midkine基因表达对人乳腺癌细胞粘附和侵袭力的影响

目的 探讨中期因子(midkine,MK)基因siRNA对乳腺癌细胞生物学行为的影响.方法 培养人乳腺癌Bcap-37、LCCI、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株,以荧光实时定量PCR方法检测MK基因mRNA表达;筛选出MK表达最高者.采用MK siRNA...