应用自体软骨细胞移植物修复关节软骨缺损

目的 通过体外扩增关节软骨细胞，构建软骨组织工程移植物，观察移植物对自体关节软骨损伤的修复作用。方法 由8周龄成年兔髌骨外侧缘获取关节软骨，分离软骨细胞，体外扩增后，与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合，制成软骨培养物，体外培养4d。用于对成兔自体关节软骨损伤的移植修复。结果 成年家兔关节软骨细胞体外单层培养至第2代时开始出现去分化现象，可利用生长因子抑制去分化；该移植物的移植修复效果良好，修复后12周移植物与周边正常组织结合紧密、齐高，细胞趋于柱状排列，已形成透明软骨组织。结论 利用体外扩增的方法能获得足够量表型良好的关节软骨细胞，当应用胶原-纤维蛋白为载体制备出软骨组织工程培养物后，能较好地修复自体关节软骨损伤。     

Ⅱ型胶原移植修复关节软骨缺损过程中抗体水平的动态变化

目的建立检测Ⅱ型胶原抗体水平的间接法ELISA,研究猪Ⅱ型胶原移植修复兔关节软骨缺损过程中Ⅱ型胶原抗体水平的动态变化。方法取28只新西兰大白兔,随机分成2组。所有动物均在股骨外髁钻直径5mm、深3mm的软骨缺损区,深达软骨下骨,其中实验组在缺损区植入Ⅱ型胶原;另一组不植入Ⅱ型胶原作为对照。术前及术后每隔2周收集血清直至第12周,采用间接法ELISA检测血清中Ⅱ型胶原抗体。结果实验组Ⅱ型胶原抗体水平术后与术前比较均差异无显著性(P>0.05);而对照组术后第8周抗体水平显著高于术前(P<0.05);实验组与对照组同期比较,两者差异均无显著性。结论关节软骨缺损可引起机体自身免疫反应,产生一定水平的Ⅱ型胶原抗体。Ⅱ型胶原移植不但可以促进关节软骨缺损的修复,还可以降低机体的自身免疫反应,减少抗体的产生。     

组织工程学技术修复关节软骨缺损研究进展

骨性关节炎或外伤等造成的关节软骨缺损是老年人关节疼痛的主要原因[1]。关节软骨自身修复能力十分有限,一旦发生关节软骨缺损,必须手术修复或重建。组织工程学技术是一种修复关节软骨缺损的新技术。现将应用组织工程学技术修复关节软骨缺损的相关问题综述如下。1种子细胞的获取种子细胞的获取是组织工程技术构建软骨的基础。理想的种子细胞应具备以下特点:1取材方便,对供体损伤小,来源充足;2体外培养增殖能力强,能持续保持细胞表型不变;3植入人体后能适应受区环境并保持或恢复原有细胞的功能。目前,最常用的种子细胞有间充质干细胞(MSCs)…     

关节镜下镶嵌式自体骨软骨移植修复膝关节局限性软骨缺损（附19例报告）

目的评价关节镜下镶嵌式自体骨软骨移植修复膝关节局限性软骨缺损的临床疗效。方法对19例关节面局限性软骨缺损患者在关节镜下采用镶嵌式骨软骨移植术,将膝关节非负重关节面骨软骨条移植至膝关节负重面的病灶性软骨缺损处,术后行系统性康复治疗。结果术后随访〉12个月,所有患者膝关节活动良好,疼痛症状基本消失。采用HSS膝关节评分标准评价膝关节功能,优15例,良2例,优良率为89％。结论关节镜下镶嵌式自体骨软骨移植修复膝关节局限性软骨缺损疗效好,患者恢复快。     

应用同种异体组织工程软骨修复关节软骨缺损观察

目的用胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体支架在体外进行软骨细胞三维立体培养,构建人工软骨组织,利用此人工软骨修复关节软骨缺损。方法取2周龄兔关节软骨,经消化、分离的软骨细胞体外培养。培养第3周时,进行免疫组织化学分析;利用培养3周的人工软骨对异体成兔的关节软骨损伤进行修复。结果培养物内软骨细胞均得到较好存活,形成软骨陷窝,出现同源性细胞簇,分泌软骨基质;DNA和糖胺多糖(GAG)在培养第24天时达到高峰,分别为(5.18±0.19)、(214.3±2.8)μg/块;对异体关节软骨损伤的移植修复结果良好,在12周时,移植物与周边正常组织结合紧密、齐高,移植的软骨细胞趋于柱状排列,为透明软骨组织。结论用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞,可构建较大的组织工程软骨,能较好地修复同种异体关节软骨缺损。     

转化生长因子-β1基因修饰骨髓间充质干细胞复合壳聚糖修复兔关节软骨缺损

目的利用壳聚糖负载转化生长凶子-β1(TGF—β1)基因修饰后骨髓间充质干细胞(MSCs)构建新型组织工程软骨培养体系，观察该培养体系对体内软骨缺损修复能力。方法将12只新西兰大白兔随机分为A、B、C三组，分别用壳聚糖、末转染MSCs 壳聚糖和TGF—β1基因修饰MSCs 壳聚糖修复全层关节软骨缺损，于术后6、12周用甲苯胺蓝染色、免疫组织化学法观察缺损区软骨基质和TGF—β1表达情况。结果TGF—β1基因修饰MSCs组缺损修复时间明显缩短，并且新生的透明软骨组织均匀一致，与正常软骨结合良好，效果明显优于其他两组。结论TGF-β1基因修饰MSCs复合壳聚糖是优秀的组织工程软骨培养体系，可用于全层关节软骨缺损的修复治疗。     

保留软骨的去细胞全喉支架制备方法及在喉软骨缺损中的修复效果

目的探讨保留软骨的去细胞全喉支架的制备方法及在大鼠喉软骨缺损中的修复效果。方法取6只大鼠用于支架的制备,分离颈总动脉,结扎分支,经颈总动脉灌注去污剂(SDS、Triton X-100、PBS离子型),3只大鼠去除喉黏膜、肌肉、韧带的同时,保留细胞外基质和软骨细胞制备保留软骨的去细胞全喉支架,其余3只用于制备对照组支架。另取34只大鼠,建立0.5 cm×0.5 cm全层喉软骨缺损模型,根据处理方法不同随机分为对照组(n=17)和保留软骨组(n=17),对照组植入未经处理的异体喉骨支架,保留软骨组植入保留软骨的去细胞全喉支架,比较两组的修复效果。结果 (1)两种支架经过脱细胞灌注处理后,全喉大体结构完整,体积未发生明显的变化;(2)保留软骨的去细胞全喉支架未见表面细胞组织填充,可见胶原、细胞外基质成分组成的腔隙,细胞之间结构紧密,存在于会厌、声带、环状软骨等表面;对照组支架组织中的细胞成分被完全去除,但是依稀可见网状连接,结构之间不紧密;(3)免疫荧光结果显示:保留软骨的去细胞全喉支架除了有肌肉、软骨细胞外,主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ、MHC-Ⅱ染色均为阴性;对照组支架免疫荧光染色下MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ染色均为阳性;(4)保留软骨组大鼠修复6 w后缺损部位存在少许不成熟的软骨细胞,极少的软骨形成陷窝,表面存在纤维组织及炎症细胞;修复12 w后缺损部位得到修复,形成软骨陷窝,炎症反应减少;对照组修复6 w后缺损部位周围软骨细胞较少,缺损部位与周围组织边界明显,存在大量炎症细胞;修复12 w后存在少量纤维组织,存在炎症因子。结论保留软骨组植入保留软骨的去细胞全喉支架在喉软骨缺损中具有良好的修复效果。     

应用转染BMP7基因组织工程软骨修复兔膝关节软骨缺损观察

目的 构建转染骨形态发生蛋白-7(BMP7)基因组织工程软骨,观察对家兔膝关节软骨缺损的修复作用.方法 将转染BMP7基因的软骨细胞(5×109个/L)接种于胶原-纤维蛋白凝胶的支架中,培养14 d后移植于家兔膝关节软骨表面,直径为5.0 mm,深达软骨下骨板的全层软骨缺损部位.移植后4、8、12周处死家兔,通过创面形态观察、组织形态的光镜观察、BMP7基因在移植部位的表达,评价转染BMP7基因组织工程软骨对兔膝关节软骨缺损的修复作用.结果 转染BMP7和未转染BMP7基因组织工程软骨培养物的体积分别为9 mm × 9 mm×2 mm和8 mm×8 mm×2 mm.转染BMP7基因组移植于家兔膝关节软骨后4、8、12周,均有软骨缺损修复作用,且移植部位有红褐色BMP7 mRNA和棕红色BMP7蛋白表达.移植后12周修复效果佳.优于未转染BMP7基因组.结论 转染BMP7和未转染BMP7基因组织工程软骨对兔膝关节软骨缺损均有修复作用,但转染BMP7基因组织工程软骨修复作用更强.     

重组合异种骨与带血循环骨膜联合移植修复节段性骨缺损(附34例报告)

创伤、感染、肿瘤、缺血性坏死均可造成长骨节段性骨缺损。寻找理想的骨修复材料和方法，是骨科致力解决的问题。根据骨形成原理、方式，我们设计了重组合异种骨(RBX)与带血循环骨膜联合移植修复节段性骨缺损的新方法，并于2000年1月至2002年12月试用于34例患者，取得了较好的效果。现报告如下。     

组织工程软骨修复全层大面积关节软骨损伤的实验研究

目的观察由软骨细胞体外培养的人工软骨组织对家兔膝关节软骨全层缺损修复的可行性.方法分离收集兔软骨细胞(4周龄),用培养液悬浮,经离心管体外培养成组织工程软骨,然后植入兔膝关节股骨负重面的缺损(5 mm×4 mm)部位,观察2,4,8,12周软骨缺损的修复情况,并进行大体和组织学观察.结果移植后第8周,移植部位填充物与宿主已完全整合,缺损处表面光滑;组织学显示,缺损部位新生软骨与所移植软骨有较好的连续性,并且缺损底部有软骨下骨及海绵状骨生成;对照组(未移植组),从组织学观察到缺损部位呈纤维样修复,未见有由新生软骨细胞形成软骨组织.结论用体外培养的组织工程软骨做移植物修复家兔关节软骨组织深层缺损具有较好的疗效.     

应用离心管技术以异体微粒软骨脱细胞基质为支架体外构建组织工程软骨

目的将软骨细胞与异体软骨微粒脱细胞基质相结合．构建组织工程软骨。方法分别利用氯化钾、胰蛋白酶和乙二胺四乙酸钠对绵羊关节软骨进行脱细胞，并制成直径0．100—0．154mm的微粒。先分离异体关节软骨细胞并进行体外扩增，再将异体软骨细胞与软骨微粒脱细胞基质混合培养，离心后应用离心管体外培养。结果本脱细胞方法可以使关节软骨细胞完全脱落，且软骨细胞紧紧围绕于异体软骨微粒脱细胞基质四周，生长和分泌功能良好。结论软骨细胞与异体软骨微粒脱细胞基质有良好的生物相容性．可于体外形成软骨样组织。     

骨关节炎软骨基质蛋白多糖变化的实验研究

目的：观察骨关节炎（OA）不同时期关节软骨基质蛋白多糖的变化，探索与软骨基质代谢相关的OA的发病机制。方法：以家兔制作OA动物模型，在病变的早、中晚期获取关节软骨，提取葡糖氨基聚糖（GAG），用生化和放射免疫技术测定其中不同种类GAG及其功能基团的含量。结果：在病变的不同时期，GAG的总量、透明质酸的含量和其中所含的硫酸基团的含量均减少，而硫酸软骨素与硫酸角质素的比例增高。这些改变均随病变的进展而渐不明显。结论：OA时，软骨基质蛋白多糖各组分和功能基团均发生了有意义的变化，这种变化有助于阐明OA的发病机制。     

一氧化氮合酶抑制剂在实验性兔关节软骨修复中的作用

目的：探讨一氧化氮合酶（iNOS)抑制剂S－甲基异硫脲在实验性关节软骨修复中的作用。方法：20只新西兰兔随机分为对照组和实验组，在双侧股骨髁间滑车关节面作全层软骨缺损，对照组应用纤维蛋白凝胶BMP复合物充填缺损，实验组同样充填缺损后，并皮下注射iNOS抑制剂S－甲基异硫脲，术后16周处死动物，作修复组织质量评价，在狼猩红－苦味酸染色检测I型和Ⅱ型胶原分布；反转录－多聚酶链反应（RT－PCR）检测iNOS和MMP－9 mRNA基因表达，BrdU检测软骨细胞增生情况，并利用图像仪进行分析。结果：形态学观察证实，术后16周，实验组关节软骨缺损修复在评分方面优于对照组（P＜0．05），天狼猩红－苦味酸染色显示实验组I型胶原明显少于对照组，II型胶原多于对照组；术后16周RT－PCR在对照组检测到iNOS mRNA和MMP－9 mRNA表达，实验组仅检测到少量MMP－9 mRNA表达，实验组BrdU阳性细胞8．5个／m^2明显多于对照组3．2个／m^2，结论：iNOS抑制剂S－甲基异硫脲的合理应用可明显提高软骨修复组织的质量。     

Articular cartilage repair using dedifferentiated articular chondrocytes and bone morphogenetic protein 4 in a rabbit model of articular cartilage defects

OBJECTIVE: To observe redifferentiation of dedifferentiated chondrocytes after transplantation into the joint, and to evaluate the ability of dedifferentiated chondrocytes transduced with adenovirus containing bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) to redifferentiate in vitro and in vivo in a rabbit model of articular cartilage defects. METHODS: Monolayer and pellet culture systems were used to evaluate the redifferentiation of dedifferentiated chondrocytes transduced with BMP-4. A rabbit model of partial-thickness articular cartilage defects was used to evaluate cartilage repair macroscopically and histologically, 6 and 12 weeks after transplantation with first-passage, fifth-passage, or transduced fifth-passage chondrocytes. Histologic grading of the repaired tissue was performed. Expression of BMP-4 and the ability of transplanted cells to recover a chondrocytic phenotype were also assessed. RESULTS: BMP-4--expressing dedifferentiated chondrocytes recovered a chondrocytic phenotype in vitro. After transplantation into the joint, some of the dedifferentiated chondrocytes in the defect sites could undergo redifferentiation and formed matrix that displayed positive toluidine blue staining for glycosaminoglycans. Histologic scores of the regenerative tissue revealed significantly better cartilage repair in rabbits transplanted with BMP-4--expressing cells than in the other treatment groups. Staining with toluidine blue revealed expression of BMP-4 in the cells and in the matrix surrounding the cells. CONCLUSION: Some dedifferentiated chondrocytes can redifferentiate after transplantation into the load-bearing joint. BMP-4 can be used to induce redifferentiation of dedifferentiated chondrocytes in vitro and in vivo, which could help enhance articular cartilage repair.     

实验性蛋白多糖降解致兔膝关节软骨早期退变的核磁共振成像研究

目的　探讨低场磁共振成像 (MRI)在检测骨关节炎 (OA)早期软骨退变的表现及其价值。方法　选用新西兰大白兔 32只 ,右侧膝关节腔内注射 0 1ml木瓜蛋白酶溶液 (5U) ,建立OA早期软骨退变的动物模型。并在注药前及注药后 2 4、4 8、72h行双侧膝关节矢状面GE准T2 WI、SE T1WI、SE PDWI、SE T2 WI序列成像 ,取关节软骨组织作蛋白多糖含量测定和组织病理学检查。结果　注射木瓜蛋白酶后 2 4、4 8h ,关节软骨明显变薄 ,磁共振 (MR)信号强度明显降低。与对照组比较 ,两者差异均有显著性 (P <0 0 5 )。至注药后 72h关节软骨的厚度及信号强度已基本恢复正常。与对照组比较 ,两者差异无显著性 (P >0 0 5 )。关节软骨蛋白多糖含量测定及组织学检查结果表明 ,注射木瓜蛋白酶后 2 4、4 8h ,蛋白多糖含量明显降低 ,至注药后 72h ,蛋白多糖含量已逐渐恢复。软骨细胞均未见异常改变。结论　通过MR检查 ,可发现早期的软骨退变。     

Tissue engineered cartilage for biological repair of cartilage defects

Recent developments in tissue engineering techniques in cartilage repair were discussed. Recently, the novel two-step method, the alginate-recovered-chondrocyte method (ARC method), which does not require the aid of an exogenous synthetic matrix, was developed. The first step of this method consists of culturing phenotypically stable chondrocytes under conditions optimal for the formation of a proteoglycan-rich cell-associated matrix (CM) in alginate beads. Then, the cells with their CM are recovered from the alginate and allowed to rapidly integrate into a solid mass of tissue on a culture insert with a porous membrane. The use of a growth factor, recombinant human osteogenic protein-1 (OP-1) maximized the formation of tissue engineered cartilaginous tissue from adult human articular cartilage. Using the ARC method, the enhancement of matrix formation by OP-1 will produce a larger volume of tissue-engineered cartilage to cover large defects.     

IL-1β诱导软骨细胞培养金属蛋白酶/金属蛋白酶抑制剂水平及药物对其影响

目的　探讨体外培养的原代软骨细胞及加入白细胞介素 (IL) 1β诱导软骨细胞中金属蛋白酶 /金属蛋白酶抑制剂水平变化及四环素、强力霉素及中药骨碎补对其影响。方法　采用体外培养的兔软骨原代细胞为模型 ,分别加入含有 10 %四环素、强力霉素及骨碎补含药血清 ,实验组加入10ng/mlIL 1β ,诱导软骨细胞变性 ,均培养 4 8h分离上清液 ,采用酶联免疫方法测定各组培养液中基质金属蛋白酶 3(MMP 3)及金属蛋白酶组织抑制剂 1(TIMP 1)含量。结果　经 10ng/mlIL 1β诱导后 ,软骨细胞MMP 3/TIMP 1水平显著性升高 (P <0 0 1) ;对于加入IL 1β诱导的软骨细胞 ,与空白血清对照组比较 ,含骨碎补药物血清和含强力霉素药物血清均降低软骨细胞MMP 3/TIMP 1水平 ,且强力霉素含药血清组与空白对照组比较差异具有显著性 (P <0 0 1) ,而含四环素药物血清则升高软骨细胞MMP 3/TIMP 1水平 ,但与空白对照组比较差异无显著性 (P >0 0 5 ) ;对于不加IL 1β诱导的软骨细胞来说 ,3种含药血清均可升高软骨细胞MMP 3/TIMP 1水平 ,且含骨碎补药物血清和含四环素药物血清与空白对照组比较差异均有显著性 (P <0 0 1)。结论　IL 1β可上调体外培养的原代软骨细胞MMP 3/TIMP 1水平 ,强力霉素和骨碎补可以下调经IL 1β诱导的软骨细胞MM     

实验性关节软骨损伤大鼠血清吡啶啉观察

目的 观察实验性大鼠关节软骨损伤时血清中吡啶啉水平变化,探讨吡啶啉作为软骨损伤生物标志的意义.方法 将40只Wistar大鼠按体质量分为对照组和T-2毒素组,分别喂成品颗粒饲料和经T-2毒素染毒(剂量为100 ng/g)的颗粒饲料.于第3、6个月时,光镜检测透明软骨的组织病理改变情况,并用ELISA夹心法检测大鼠血清吡啶啉.结果 T-2毒素引起的大鼠关节软骨病理改变具有时间效应,染毒3个月组大鼠关节软骨表层梭形软骨细胞消失,软骨细胞变形、变性、核固缩、排列紊乱;随时间延长,病变加重,染毒6个月组大鼠关节软骨细胞坏死明显,可见大面积无细胞区,关节表面凹陷,不光滑,有的病例软骨细胞出现反应性增生,基质纤维化.T-2毒素组3个月大鼠血清吡啶啉水平[(2.12±0.40)μg/L]较同期对照组(0μg/L)明显升高,两组比较差异有统计学意义(t=11.78,P<0.01);染毒6个月大鼠血清吡啶啉水平[(5.30±2.01)μg/L]较同期对照组[(1.95±0.07)μg/L]和同组3个月时明显升高,两两比较差异有统计学意义(t值分别为4.70、4.34,P均<0.01).结论 大鼠关节软骨病理改变越严重,血清吡啶啉水平越高,血清吡啶啉水平与关节软骨病理损伤呈明显的对应关系,血清吡啶啉可作为关节软骨损伤的生物标志.