抗伏马菌素B1单克隆抗体的制备和特性

目的建立敏感、特异和快速的针对伏马菌素B1(fumonisin B1, FB1)的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay ,ELISA)检测方法,形成具有我国自主知识产权的快速检测试剂盒.方法利用B细胞杂交瘤技术,建立能分泌抗伏马菌素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株.结果用伏马菌素B1-牛血清白蛋白(FB1-BSA)偶联物免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0融合,经过3～4次亚克隆建立了1个稳定分泌抗伏马菌素B1毒素抗体的杂交瘤细胞株,命名为5A9.将杂交瘤细胞打入BALB/c小鼠腹腔,获得含抗伏马菌素B1毒素单克隆抗体的腹水,并将腹水用饱和硫酸铵法进行纯化,得到单克隆抗体.该单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,腹水中抗体的滴度分别为2.56×106,参考工作浓度为3.2×105.纯化后抗体的IgG含量为10.4 g/L,亲和常数为8.3×10-8 mol/L.该抗体与其他结构类似物无交叉反应,具有较高的特异性.结论制备了具有高特异性和亲和力的抗伏马菌素B1单克隆抗体,初步形成了针对伏马菌素B1的ELISA检测试剂盒.     

分泌抗B型肉毒毒素单克隆抗体的产生与特性鉴定

以B型肉毒类毒素免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞进行细胞融合。用ELISA方法筛选有杂交细胞生长孔的上清液,其中有66.7％的孔可分泌肉毒毒素特异性抗体。用有限稀释法进行克隆化培养后,获得4株稳定的杂交瘤细胞系(3B10、3B11、3G12和4A5),在体外培养中均持续分泌抗体,培养液抗体效价达10~(-3)～10~(-5);注入BALB/C小鼠腹腔制备出富含抗体的腹水,抗体效价达10~(-6)～10~(-8)。经用A型和B型类毒素作特异性鉴定,表明抗体3G12及4A5与A型无交叉反应,为B型特异性的。抗体3B10及3B11与A型有弱交叉反应。Ig种类鉴定表明抗体3B10及3G12为IgG_1;抗体3B11及4A5为IgG_2。染色体检查证明4株细胞均为杂交瘤细胞。小白鼠体内进行中和保护力测定表明4种单克隆抗体对肉毒毒素均无保护作用。     

盐酸克仑特罗单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗盐酸克仑特罗(clenbuterol ,CL)的单克隆抗体并进行免疫学特性鉴定.方法:用重氮化法将盐酸克仑特罗偶联于载体牛血清白蛋白(BSA),形成的结合抗原BSA-CL作为免疫原免疫BALB/c小鼠,同时将CL与卵清白蛋白(OVA)偶联制备检测原(OVA-CL).应用杂交瘤技术建立分泌抗盐酸克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水并进行纯化.用竞争性ELISA法测定抗体的亲和常数及交叉反应性.结果及结论:获得了18株稳定分泌抗盐酸克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株,挑选其中E9-C11、C11-E3、E7-G8三株高亲和力的细胞株进行免疫学特性鉴定.三株抗体的亚类均为IgG1.细胞上清的间接ELISA效价分别为1:1 280、1:1 000、1:800,三株腹水效价都约为1×10-6.亲和常数分别为2.4×10-8mol/L、2.83×10 -8 mol/L 、3.28×10-8 mol/L .E9-C11单抗对CL的IC50为6.1035μg/L;对沙丁胺醇的IC50大于781.25 μg/L,交叉反应性小于0.78%;对肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、莱克多巴胺及部分维生素和抗生素均无交叉反应性.蛋白免疫印迹分析证明三株单抗特异性均很高,可用于与其相关的免疫检测或应用研究.     

抗T-2毒素单克隆抗体的制备及特性

目的 :建立敏感、特异和快速的针对T 2毒素的ELISA检测方法 ,形成具有我国自主知识产权的快速检测试剂盒。方法 :利用B细胞杂交瘤技术 ,建立抗T 2毒素的单克隆杂交瘤细胞株。结果 :用T 2 羊免疫球蛋白 (T 2 GIgG)偶联物免疫 8～ 10周龄雌性BALB/c小鼠后 ,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2 /0融合 ,经过 3～ 4次亚克隆建立了 2个稳定分泌抗T 2毒素抗体的杂交瘤细胞株 ,分别命名为 2A7和 6E4。将上述 2株杂交瘤细胞分别注入BALB/c小鼠腹腔 ,获得含抗T 2毒素单克隆抗体的腹水 ,并将腹水用饱和硫酸铵法进行纯化 ,得到 2A7和 6E4单克隆抗体。两株单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,腹水中抗体的滴度分别为 6 .4× 10 6和 1.1× 10 7,参考工作浓度分别为1.0× 10 6和 3.2× 10 6。纯化后 2A7抗体的IgG含量为 16 .4g/L ,亲和常数为 8× 10 -8mol/L。 2A7抗体与其他结构类似物无交叉反应 ,具有较高的特异性。结论 :制备了具有高特异性和亲和力的抗T 2毒素单克隆抗体 ,初步建立了针对T 2毒素的ELISA检测方法。     

产毒大肠杆菌不耐热肠毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步应用

用亲和层析纯化的产毒大肠杆菌(ETEC)不耐热肠毒素(LT)免疫BALB/C小鼠,将小鼠脾细胞与SP_(2/0)骨髓瘤细胞(1:8)在PEG(MW1000)作用下融合,采用ELISA筛选抗-LT抗体阳性孔,细胞融合率为50％,抗体阳性率为4.5％,经3～5次克隆后筛选出2株分泌抗-LT杂交瘤细胞株(2D_、2E_5),用ELISA测定杂交瘤细胞培养上清及腹水的效价,后者约为前者的100倍,高达90万～110万。通过平板免疫溶血试验和ELISA双抗夹心法分别对2株杂交瘤分泌的抗LT单克隆抗体(McAb)的特异性进行了试验,结果表     

伯氏考克斯体新桥株感染BALB/c小鼠的实验研究

目的:分析伯氏考克斯体新桥株对BALB/c小鼠的感染性.方法:用伯氏考克斯体新桥株腹腔接种感染小鼠,于感染后7,14,21,28 d分别处死小鼠,采用伯氏考克斯体特异的荧光定量PCR检测感染小鼠肝、脾、肺组织样本中伯氏考克斯体含量.采用间接免疫荧光法检测感染小鼠血清特异性抗体水平.结果:感染后28 d内,小鼠肝、脾、肺组织中均检出大量伯氏考克斯体,第7天检出量最高,脾的含量显著高于肝和肺,肝的含量显著高于肺.随着感染时间延长,伯氏考克斯体检出量呈下降趋势,但血清特异性抗体水平则不断升高.结论:伯氏考克斯体新桥株为强毒株,可以引起BALB/c小鼠较长时间的稳定感染;BALB/c小鼠可以用作伯氏考克斯体感染模型.     

赭曲霉毒素A单克隆抗体的制备及直接竞争酶联免疫吸附法的建立

目的 建立快速且灵敏的赭曲霉毒素A(OTA)直接竞争酶联免疫吸附检测(cdELISA)方法.方法 采用OTA与卵清蛋白(OVA)偶联作为抗原免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合、克隆筛选,获得鼠抗OTA的杂交瘤细胞株;以ELISA方法测定抗体效价并鉴定抗体的IgG及亚类;用辣根过氧化物酶(HRP)标记OTA,建立cdELISA方法.结果 获得了3株稳定分泌高效价抗OTA单克隆抗体的杂交瘤细胞株(S-17-8、S-212-7和S-225-11),3株重链均为IgG1亚型,轻链为κ亚型;建立了cdELISA检测方法,检测下限为0.5ng/ml.结论 以抗OTA单克隆抗体和OTA-HRP为基础,建立了灵敏且省时的检测OTA的cdELISA方法,为进一步OTA快速筛查提供了条件.     

破伤风毒素单克隆抗体的制备及鉴定

目的 一株抗破伤风毒素鼠源单克隆抗体的制备与鉴定.方法 从实验室前期以破伤风类毒素为抗原筛选得到的6株稳定细胞株中选取4E12进行制备及鉴定,首先将4E12细胞株扩大培养后腹腔注射BALB/c小鼠制备腹水,经Protein G柱和PD10脱盐柱两步纯化鼠源单抗;其次通过SDS-PAGE电泳检测抗体纯度并通过分型试剂盒鉴定抗体轻重链亚型,免疫印迹法鉴定抗体结合区域及表位类型,非竞争ELISA法测定抗体亲和力常数以及小鼠中和实验评价抗体中和活性.结果 获得能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株4E12,其细胞培养上清效价为4×103,抗体轻重链分别为κ型和IgG1型,CDR3序列分别为SQSTHVPPT和ARKGTGTGFNY;4E12腹水抗体效价为3.2×104,抗体经纯化后纯度＞95％,以线性表位与TeNT/Hc结构域特异性结合,两者的亲和力常数为3.6×10-10 mol/L,小鼠中和实验结果显示,4E12抗体可部分中和破伤风毒素.结论 筛选到一株高亲和力的鼠源单抗,为破伤风毒素检测及中和抗体研发奠定了基础.     

分泌抗HBeAg单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立和检测HBeAg抗-HBe中的应用

应用亲和层析纯化的HBeAg免疫接种BALB/C小鼠,收获脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞株融合,对淋巴细胞杂交瘤细胞生长孔上清用ELISA法进行检测,发现两个分泌特异性抗-HBe的细胞株(IB_8;2G_(11))。经有限稀释法亚克隆3次以上,扩大培养后腹腔注射同系小     

抗PSMA7单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的制备抗蛋白酶体α7亚基(PSMA7)的单克隆抗体,为PSMA7的功能研究奠定基础。方法以纯化的重组蛋白PSMA7为抗原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备PSMA7单克隆抗体,并用间接ELISA法和Western blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果成功建立两株稳定分泌抗PSMA7蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为B013和B001。检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1∶128和1∶256,腹水效价为1∶25600和1∶32000。两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。Westernblot及免疫组化实验证实,两株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性PSMA7蛋白。结论成功建立了两株效价高、特异性好的抗PSMA7单克隆抗体杂交瘤细胞,制备的单克隆抗体可用于PSMA7蛋白的鉴定,为其生物学功能研究奠定了基础。     

抗河流弧菌单克隆抗体的建立及初步鉴定

目的 制备高效、特异的抗河流弧菌单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),为海洋致病细菌的快速免疫诊断提供技术支持.方法 选用雌性BALB/c小鼠(8周龄)制备成为灭活河流弧菌免疫小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术,制备出抗河流弧菌杂交瘤细胞株,用Giemsa染色对其进行染色体鉴定,并用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法筛选其与河流弧菌及其他重要海洋细菌的交叉反应特异性.结果 共获得4株抗河流弧菌mAb,均符合杂交瘤细胞染色体特点,具有良好的特异性和免疫反应性,分别命名为01H10,02F12,05F3和03G10.结论 本研究制备、筛选出抗河流弧菌的mAb,有助于建立抗河流弧菌快速免疫检测试剂盒.     

抗莱氏无胆甾原体单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本文采用浓缩提纯的莱氏无胆甾原体做为抗原,多途径免疫 BALB/C 小鼠,取脾细胞与 SP_2/O-Ag~(14)小鼠骨髓瘤细胞融合,建立了4株分泌抗莱氏无胆甾原体单克隆抗体杂交瘤细胞。分析了杂交瘤细胞的染色体,平均数为103条;制备了腹水抗体,经 APAAP 法(碱性磷酸酶—抗碱性磷酸酶桥联酶标显色技术)和 IFA 法检测,抗体效价在80～320之间;对免疫球蛋白亚类进行了鉴定,其抗体均为 IgM。上述细胞经3～4个月稳定传代后,冻存于液氮中。该单克隆抗体的制备对细胞培养中支原体污染的检出可能有重要意义。     

人参皂苷Rg1免疫佐剂作用的研究

目的：探讨人参皂苷Rg1的免疫佐剂效应。方法：分别将人参皂苷Rg1以及氢氧化铝胶（Alum）作为佐剂和卵清白蛋白（OVA）抗原混合免疫BALB/c小鼠,二次免疫后2周采血和取脾脏,分离血清,观察免疫前后血清OVA诱导特异性抗体及亚类含量变化,以及淋巴细胞在抗原刺激下的体外细胞增殖反应。结果：Rg1和抗原混合物免疫小鼠后,未见任何不良反应;Rg1组小鼠血清抗体IgG,IgG1和IgG2a水平显著高于抗原对照组（P〈0.05）;人参皂苷Rg1免疫小鼠受刀豆蛋白A（ConA）、脂多糖（LPS）和OVA刺激产生的淋巴细胞体外增殖能力显著高于OVA组（P〈0.05）,Rg1组小鼠脾淋巴细胞受OVA刺激后培养上清检测细胞因子IL-5和IFN-γ浓度显著高于OVA组。结论：Rg1是一种能同时激活Th1和Th2型免疫反应的免疫佐剂。     

抗A型肉毒毒素鼠源性单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备与鉴定抗A型肉毒神经毒素重链C端（ heavy chain of botulinum neurotoxin serotype A, BoNT／AHc）特异性鼠单克隆抗体。方法通过纯化BoNT／AHc抗原、免疫BALB／c小鼠并建立杂交瘤细胞以制备鼠单抗,用ELISA、Western印迹实验和抗体分型试剂盒进行分析鉴定,并通过ELISA检测鼠单抗与BoNT／AHc突变体结合,初步鉴定其在BoNT／AHc的结合表位。结果得到纯度较高的BoNT／AHc抗原,制备了4株特异性鼠单抗1A4、3H3、3H7、5H8。间接ELISA结果显示,单抗细胞上清效价均＞3．0×103;Western印迹检测结果显示,单抗均能与BoNT／AHc特异性结合;抗体亚型鉴定结果为1A4、3H7属于IgG1（Κ）,3H3属于IgM（Κ）,而5H8属于IgG2b （Κ）;叠加ELISA实验表明,4株单抗抗原识别表位相近;用ELISA检测单抗与BoNT／AHc突变体结合实验结果初步确定了4株单抗与BoNT／AHc的结合表位。结论对抗A型肉毒毒素鼠源性抗体完成了制备和鉴定,为肉毒毒素中和抗体的开发与阐明中和抗体的表位奠定了基础。     

重组CPTα的亲和纯化及其单克隆抗体的制备

目的 :制备抗A型产气荚膜梭菌毒素α(CPTα)单克隆抗体 (mAb)并鉴定其生物学特性。方法 :利用工程菌株E .coliM15 /pQE30 CPTα表达的重组A型CPTα带有 6个组氨酸 (6×his)标签的特性 ,经Ni NTA螯合亲和层析方法纯化后 ,用纯化的重组CPTα免疫BALB/c鼠 ,以常规杂交瘤细胞融合技术、HAT选择性培养和间接ELISA进行筛选 ,并分析其亚类及中和保护作用。结果 :获得一株能稳定分泌抗CPTα的mAb杂交瘤细胞株 4E2 ,其分泌抗体亚类为IgG1。该mAb与重组CPTα和天然CPTα均可发生特异性反应 ,并可保护小鼠抵抗 2倍最小致死剂量CPTα的攻击 ,属中和性抗体。结论 :应用纯化的重组CPTα成功地获得了特异性的中和抗体mAb 4E2 ,为A型CPTα诊断抗体和治疗性抗体的研制奠定了基础。     

产生流行性乙型脑炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

用JEV-SA,免疫BALB/C小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(NS_1)在PEG作用下融合,以ELISA、HI、IF 3种方法检测抗体,建立了1株针对JEV-SA_4的单克隆抗体杂交瘤细胞系。该细胞系染色体在74～98之间,含中着丝点标志染色体,经4次克隆化,连续传代5个月仍持续分泌特异性抗体,该抗体为IgG_3亚类。     

肾综合征出血热病毒50K结构蛋白免疫学特性的初步研究(摘要)

以McAb亲和层析纯化的HFRS病毒50K结构蛋白免疫BALB/c小鼠,结果:第一次免疫后3周即有特异性抗体(包括中和抗体)被检出。抗体滴度随免疫进程而升高,第三次免疫后3周,其血清中和抗体滴度     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7毒力蛋白NleB1的表达、纯化及多克隆抗体的制备与鉴定

目的：构建肠出血性大肠杆菌（ EHEC） O157∶H7毒力蛋白nleB1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备NleB1的抗血清。方法从EHEC O157∶H7 EDL933株的全基因组中PCR扩增出编码nleB1的990个碱基序列,构建原核表达载体pET24a-nleB1,将构建的重组表达载体的质粒pET24a-nleB1转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,利用异丙硫半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白His-NleB1表达,并利用镍柱进行亲和层析纯化和切胶纯化,以纯化后的融合蛋白His-NleB1为抗原免疫BALB/c小鼠,获得抗血清。 Western印迹和ELISA法鉴定获得的抗血清。结果成功构建了pET24a-nleB1原核表达载体,纯化得到融合蛋白His-NleB1,进而免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,Western印迹和ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论成功获得了EHEC O157∶H7的毒力蛋白NleB1的多克隆抗体,为研究EHEC O157∶H7毒力蛋白NleB1的功能奠定了基础。     

基因免疫法制备小鼠抗人肝素酶多克隆抗体

目的:利用基因免疫的方法制备抗人肝素酶抗体.方法:用本室构建的表达肝素酶全长质粒pcDNA3.1(+)-HPA为基因免疫载体,免疫6～8周龄雄性BALB/c小鼠,使得质粒上的目的基因在动物体内表达,诱导动物体对DNA编码的外源蛋白产生抗体而获得肝素酶的抗血清,通过间接ELISA方法测定小鼠抗血清效价,Western 印迹鉴定抗血清特异性.结果:获得了效价较高的小鼠抗血清,最高效价可达到1∶5×104;抗体特异性与标准品一致.结论:建立了一种制备肝素酶抗体的新方法.     

抗A型肉毒类毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其初步应用

以A型类毒素免疫BALB/C小鼠,取其脾脏与SP_2/O骨髓瘤细胞融合,获得8个阳性克隆,经克隆化和用ELISA法筛选、鉴定,得到两株(H_6,E_1)分泌型特异McAb的杂交瘤细胞系。5次克隆化后阳性率均达100％,并制备了培养上清液及免疫腹水。