当归实时荧光定量PCR内参基因筛选

目的 通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)筛选当归Angelica sinensis不同材料中稳定表达的内参基因。方法 以不同生长期、春化温度、组织部位以及抽薹/未抽薹植株为材料,对转录组数据库获得的13个候选内参基因和1个已报道的肌动蛋白基因的表达水平进行qRT-PCR检测,利用ge Norm、NormFinder、BestKeeper、?Ct和RefFinder等软件分析表达水平的稳定性。结果 不同材料中14个候选内参基因的稳定性存在显著差异,ACT7、UBC32、UBC26和UBC7分别为不同发育阶段、春化温度、组织部位和抽薹/未抽薹植株中最稳定的内参基因;EEF1G为所有样品中最稳定的内参基因,其次为RPL3和UBC26。结论 为进一步检测当归产量和品质形成过程中的基因表达提供重要参考。     

何首乌实时荧光定量PCR内参基因筛选

为筛选适宜何首乌Polygonum multiflorum不同组织基因表达分析的内参基因,从何首乌转录组数据中选取Actin,GAPDH,SAND,PP2A,TIP41常用的5个候选内参基因,设计特异性引物。通过实时荧光定量PCR,利用geNorm,NormFinder,Best-Keeper,Delta CT以及RefFinder等方法对5个候选内参基因在何首乌不同组织中的表达稳定性进行分析,为何首乌基因差异表达研究提供可靠的内参基因,以确保分析结果的可靠性。结果表明,各候选内参基因在何首乌不同组织中表达水平和稳定性有较大差异,其中对各候选内参基因的表达水平(Ct)的分布分析显示,以Actin和GAPDH基因在各组织中表达水平相对较高,而SAND,PP2A,TIP41表达水平较低;通过不同方法对各候选内参基因稳定性进行分析,geNorm分析结果以PP2A,GAPDH表达最为稳定,SAND表达稳定性最差,NormFinder和Delta CT法均以PP2A稳定性最高,SAND稳定性最低,而BestKeeper分析以Actin最稳定。通过RefFinder对候选基因稳定性进行综合评价分析得出以PP2A基因稳定性最高,其后依次为GAPDH,Actin,TIP41,SAND,以SAND基因稳定性最差。因此,PP2A基因为何首乌不同组织基因表达分析比较理想的内参基因。     

黄草乌实时荧光定量PCR内参基因的筛选

筛选合适的内参基因是应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析基因表达的前提。为黄草乌Aconitum vilmori-nianum中基因表达分析研究提供可靠的内参基因,基于黄草乌转录组数据,筛选出19个候选内参基因(ACT1、ACT2、ACT3、aTUB1、aTUB2、bTUB、18S rRNA、UBQ、eIF2、eIF3、eIF4、eIF5、CYP、GAPDH1、GAPDH2、PP2A1、PP2A2、ACP、EF1α),用qRT-PCR技术检测各候选内参基因在黄草乌根、茎、叶和花4个器官中的表达情况,Ct值分析结果表明,18S rRNA在各器官中表达丰度过高,GAPDH2的波动范围较大,二者均不宜作为黄草乌的内参基因。对其他候选基因的表达稳定性进行分析,geNorm和NormFinder分析结果基本一致,稳定性排名前三的内参基因均为PP2A1、EF1α和CYP,BestKeeper分析结果表明,稳定性排名前三的内参基因为EF1α、ACT3和PP2A1。不同软件分析得出的候选内参基因表达稳定性排名存在差异,因此,采用几何平均值法综合分析黄草乌各候选内参基因的表达稳定性,结果表明,PP2A1、EF1α和ACT3的稳定性最佳。基于geNorm、NormFin-der、BestKeeper和几何平均值法综合分析结果,PP2A1和EF1α在黄草乌不同器官中的表达最稳定,是黄草乌不同器官基因表达分析的最佳内参基因。     

绞股蓝实时荧光定量PCR内参基因筛选和验证北大核心

目的:筛选适宜绞股蓝不同组织表达分析的内参基因,掌握绞股蓝皂苷生物合成关键酶基因GpFPS在绞股蓝不同组织中的表达特性。方法:基于绞股蓝转录组数据,以10个内参基因作为候选基因,采用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder分析绞股蓝不同组织中10个候选内参基因的稳定性。利用实时荧光定量PCR技术,筛选出符合要求的内参基因,并实测基因GpFPS在绞股蓝不同组织中的表达情况。结果:候选内参基因在绞股蓝不同组织中的表达稳定性由高到低排序为PP2A、CYP、eIF4α、Actin、EF1α、TIP、18S、GAPDH、UBQ10、TUB6。GpFPS基因表达量在不同组织中由高到低分别是:嫩叶、老叶、花、卷须、成熟果、茎或根、幼果。结论:适合于绞股蓝不同组织基因表达分析的内参基因是PP2A和CYP,通过验证分析,该内参基因的可靠性强,为进一步研究绞股蓝皂苷生物合成相关基因的功能积累了必备的实验基础。     

红花种子不同发育时期内参基因表达稳定性分析

目的通过qRT-PCR分析对比红花开花后不同发育时期的种子中内参基因的表达稳定性,筛选出红花种子成熟过程中最稳定的内参基因。方法应用实时荧光定量PCR技术,分析6个传统内参基因ACT、EF1α、GAPDH、UBI、TUA、TUB在红花种子不同发育时期的mRNA表达差异情况;利用GeNorm和Normfinder软件评价上述内参基因在红花开花后不同发育阶段的种子中的表达稳定性。结果荧光定量及GeNorm软件分析结果显示,6种内参基因的表达性各异,但表达最为稳定的内参基因是EF1α,表达最稳定的内参组合是EF1α和TUB。为了数据的真实可靠又选用了Normfinder软件分析,结果显示UBI基因表达不太稳定,EF1α、ACT、TUB、TUA和GAPDH内参的表达稳定性都小于0.15,相对比较稳定。结论为红花开花后不同发育时期种子的荧光定量PCR分析提供了详尽的内参基因参考。     

草果种子休眠解除过程中qRT-PCR内参基因筛选

草果种子具有显著的休眠现象,筛选种子休眠解除过程中稳定表达的内参基因,对于后续开展相关基因的功能研究来说至关重要。该研究以不同休眠解除阶段的草果种胚为实验材料,选取10个常用的基因(GAPDH、40S、actin、tubulin、EIF4A-9、EIF2α、UBC、UBCE2、60S、UBQ)作为候选内参基因,进行实时荧光定量PCR分析。采用BestKeeper、geNorm、Normfinder和Delta CT 4种方法对候选内参基因的表达稳定性进行分析,最后通过在线分析工具RefFinder对其表达稳定性进行综合排序。结果表明10个候选内参基因在不同休眠解除阶段的草果种胚样品中的表达水平具有较大差异,其中GAPDH和40S的Ct较小,其表达丰度较高。geNorm分析以40S和UBCE2表达最为稳定;NormFinder分析以EIF2a表达最为稳定,UBC表达稳定性最低;BestKeeper分析结果显示UBCE2的表达最为稳定,actin稳定性最差;Delta CT分析以40S表达最为稳定。RefFinder综合分析显示UBCE2表达稳定性最高。因此,UBCE2可作为草果种子不同休眠解除阶段qRT-PCR分析的理想内参基因。该研究结果可为后续开展草果种子休眠解除过程中相关基因的表达分析奠定基础。     

青天葵实时荧光定量PCR内参基因的选择

目的 筛选合适的内参基因用于青天葵实时荧光定量PCR分析的校正.方法 以毛唇芋兰3个组织(叶片、叶柄和球茎)为材料,利用实时荧光定量PCR技术探讨18S rRNA、actin、ubiquitin、EF-lα和β-tubulin 5个常用内参基因在毛唇芋兰不同组织中表达差异.利用GeNorm和NormFinder软件比较各内参基因的Ct值,以分析他们在青天葵3个组织的表达稳定性.结果 5个内参基因的表达稳定性各异,GeNorm软件分析结果表明,稳定性β-tubulin=EF-lα＞ubiquitin＞actin＞ 18S rRNA;NormFinder软件结果显示β-tubulin稳定性最好,EF-1α次之,18S rRNA则最差.两个不同软件分析结果一致.结论 β-tubulin可作为毛唇芋兰不同组织中基因表达差异分析的校正内参基因.     

罗汉果实时荧光定量PCR内参基因的选择

罗汉果为药食两用的传统中药,研究从罗汉果转录组中选取了Actin,18SrRNA,ubiquilin,ef1-α,ef1-β,Tubulin作为候选基因,通过实时荧光定量PCR,利用geNorm,NormFinder,BestKeeper,Delta CT,RefFinder软件和方法对6个候选参考基因在不同罗汉果样品中的表达稳定性进行分析,首次筛选出了不同时期的有籽和无籽罗汉果果实中较理想的内参基因,结果发现18SrRNA在所有罗汉果样品中表达最稳定,是样品基因分析适合的内参基因,对采用qRT-PCR方法分析罗汉果基因表达中内参基因的选择具有指导作用,也为罗汉果生物合成途径基因及其他不同条件下基因差异表达研究提供参考,确保罗汉果基因表达分析结果的可靠性.     

沙氏鹿茸草实时荧光定量PCR内参基因筛选

沙氏鹿茸草是玄参科鹿茸草属半寄生植物,主要分布在我国江西,福建,广东等地,是中药"炎宁颗粒"的重要原料之一。目前关于沙氏鹿茸草的研究报道主要集中在种质资源,化学成分,药理药效等方面,在分子生物学及功能基因组方面的研究基础还很薄弱,目前尚无沙氏鹿茸草相关内参基因的研究报道。为了筛选沙氏鹿茸草中稳定表达的内参基因,保证基因表达结果的可靠性,该研究以沙氏鹿茸草为材料,采用实时荧光定量PCR技术对来自沙氏鹿茸草转录组数据的6个内参基因(UBQ,GAPDH,AP-2,ACT,TUB,CYP)在不同土壤含水量及接种丛枝菌根Rhizophagus irregularis条件下的表达水平进行检测,并结合GeNorm, NormFinder和Bestkeeper软件综合评价6个内参基因的稳定性。结果表明,6个内参基因在不同处理下的表达稳定性具有明显差异,其中TUB,GAPDH的分析结果接近且表达最稳定,而ACT的表达最不稳定。研究结果为今后沙氏鹿茸草寄生和品质形成过程中的基因表达分析提供参考。     

基于实时荧光定量PCR对镉处理下黄花蒿内参基因稳定性的分析

研究选取黄花蒿的Actin,18S rRNA,PAL,GAPDH,CPR作为候选内参基因,设计特异性引物,通过实时荧光定量PCR,利用geNorm,NormFinder,BestKeeper,Delta CT以及RefFinder软件和方法对5种内参基因在不同浓度镉处理下黄花蒿叶片中的表达稳定性进行分析,为黄花蒿基因差异表达研究提供可靠的内参基因,确保黄花蒿基因表达分析结果的可靠性。结果表明在不同浓度镉处理下,黄花蒿叶片中候选内参基因的表达稳定性存在差异,综合分析得出候选内参基因表达稳定性顺序依次为Actin >18S rRNA >PAL >GAPDH >CPR。因此,在黄花蒿基因差异表达分析中,可以考虑选取Actin,18S rRNA,PAL作为内参基因,采用多内参校正结果。此外,研究还发现同浓度镉处理下黄花蒿叶片中的候选内参基因表达稳定性也存有差异,这说明即使在同一处理条件下也有必要进行内参基因的筛选。总之,该研究首次提供了在不同浓度镉处理下黄花蒿叶片中比较理想的内参基因,也为其他条件下黄花蒿的基因表达分析提供了参考。     

川续断Actin、Tubulin和GAPDH基因的克隆及表达稳定性分析

目的 从川续断Dipsacus asper中克隆并筛选出稳定的内参基因用于实时荧光PCR（qRT-PCR）的分析校正,为今后川续断功能基因的表达分析及调控机制研究提供基础。方法 从川续断转录组数据库中筛选并克隆肌动蛋白（Actin）、微管蛋白（Tubulin）、GAPDH基因家族内参基因的核心片段,以不同产地、不同组织部位和不同发育时期的川续断植株为材料,通过qRT-PCR获得各基因的表达信息,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT、RefFinder共5个内参评价软件分析各基因的表达稳定性,综合评价并筛选出最佳的川续断内参基因。结果 克隆获得10个候选内参基因核心片段,分别属于Actin、Tubulin、GAPDH 3大基因家族,各家族基因序列间同源性较高;稳定性综合分析结果显示,DaACT103在不同产地及不同组织部位的表达稳定性较强且表达量相对较高,DaTUB5在不同发育时期的表达稳定性较强且表达量相对较低。结论 DaACT103和DaTUB5均可作为川续断的内参基因,其中,DaACT103适用于作为具有较高表达丰度基因的内参基因;DaTUB5适用于作为表达丰度较低基因的内参基因。     

基于实时荧光定量PCR分析的北柴胡内参基因的筛选及验证

目的筛选出在北柴胡不同生长时期及不同器官中表达均稳定的内参基因并进行验证。方法利用实时荧光定量PCR获得18个候选内参基因所有Ct值,通过3种不同算法(Bestkeeper、Norm Finder、Ge Norm)的软件对内参基因稳定性进行分析,采用皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient)分析3个软件给出的稳定性排名结果。结果所有候选内参基因的Ct值相对宽泛,ADF1b、ADF5、ADF7、e IF2b和ACT2为最为合适的内参基因,而e IF6被认为稳定性最差的内参基因。3个软件计算结果均呈现显著性相关。结论采用实时荧光定量PCR结合3种不同算法进行北柴胡内参基因的筛选及验证是可行的。在北柴胡柴胡分子遗传研究中,发掘到的内参基因对目的基因进行均一化处理有助于提高目的基因表达分析的精确性及可信度。     

栽培远志qRT-PCR内参基因筛选与P450s基因的时空表达分析

目的 筛选适用于不同生长年限和不同部位的栽培远志实时荧光定量PCR分析（quantitative real time PCR,qRT-PCR）的稳定内参基因,为远志体内各个基因表达分析提供合适内参基因。并对4个细胞色素P450单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase,P450s）基因在上述远志样品中的差异表达进行分析,明确4个P450s基因在栽培远志中的时空表达分布。方法 通过qRT-PCR获取Tubulin 1、Tubulin 2、Elongation 1、Elongation 2、Actin 1、Actin 2、GAPDH和cdc-42 8个候选内参基因在上述远志样品中的熔解曲线与C_t值;利用软件geNorm和NormFinder对候选内参基因的表达稳定性进行评价;通过qRT-PCR分析4个P450s基因CYP709B2、CYP71AP39、CYP88A85、CYP714E38在上述远志样品中的相对表达情况。结果 geNorm分析结果表明,在远志（1~3年生）根、茎、叶、花中稳定表达的为Tubulin 2与Elongation 1;NormFinder结果显示,Elongation 1是最稳定的内参。CYP709B2、CYP71AP39基因在远志茎、叶（1~3年生）中的mRNA表达量最高,在根与花中的表达量则较少。而CYP88A85、CYP714E38基因则在远志根（1~3年生）中的mRNA表达水平较高。结论 Elongation 1适合作为栽培远志体内基因表达分析的内参基因。栽培远志中的P450s基因在远志根、茎、叶、花中的表达趋势不一致。     

巴戟天实时荧光定量PCR内参基因的选择

目的选择合适的内参基因,用于巴戟天不同组织和不同处理的叶中目标基因表达量的分析检测。方法以巴戟天不同组织和不同处理的叶为材料,根据巴戟天转录组数据,选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)、微管蛋白α(tubulinalpha,TUA)和肌动蛋白(Actin)基因等10个内参基因作为候选基因。利用实时荧光定量技术,并结合geNorm、NormFinder和BestKeeper等软件分析内参基因的表达稳定性,从而筛选出巴戟天不同组织和不同处理叶中表达稳定的内参基因。选择合适的内参基因对巴戟天的1-脱氧木酮糖-5磷酸合成酶(DXS)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)基因在不同组织和不同处理的叶中相对表达量进行分析。结果内参基因GAPDH和泛素(UBQ)在巴戟天不同组织中表达最稳定,GAPDH+UBQ的双内参组合能够更加准确地分析目的基因在巴戟天不同组织的相对表达量,而在不同处理的叶中GAPDH和Actin表达稳定性最好,选择GAPDH+Actin的双内参组合可以确保目的基因相对分析表达结果的可靠性。在巴戟天不同组织中,DXS目的基因的相对表达量为根<茎<叶,DXR的相对表达量为茎<根<叶。在巴戟天不同处理的叶中,DXS和DXR基因的相对表达量相对于未处理的叶(CK)都有所提高。结论筛选得到的稳定内参基因为后续巴戟天相关基因表达研究奠定基础,使用2个稳定内参的组合对目的基因进行均一化处理有利于提高目的基因表达分析的准确性。     

刺五加肌动蛋白基因的克隆和表达稳定性分析

目的 克隆刺五加Eleutherococcus senticosus的肌动蛋白(actin,ACT)基因并使其成为可用的内参基因.方法 运用RT-PCR法克隆ACT基因的部分序列,并以其为内参基因进行半定量PCR和real-time PCR分析.结果 克隆了长度为1 031bp的刺五加ACT基因,推测其编码343个氨基酸,与光皮桦Betula luminifera、陆地棉Gossypium hirsutum、茶树Camellia sinensis的ACT氨基酸序列同源性分别为99.42％、98.83％、98.54％.刺五加ACT基因在不同器官和不同生长发育时期的表达量基本恒定,以其为内参基因的半定量PCR和real-time PCR均具有良好的扩增效果和重现性.结论 首次分离并报道了刺五加ACT的cDNA克隆,证实该序列可以作为基因表达分析的内参基因,建立了其real-time PCR反应体系.