基于转录组测序的牛蒡木质素类物质生物合成途径及关键酶基因分析

目的获得牛蒡Arctiumlappa根功能基因数据库,分析其木质素类化合物生物合成途径及关键酶基因。方法以牛蒡根为研究对象,利用华大基因BGISEQ-500测序平台进行转录组测序,通过从头组装获得Unigene,利用各种已有的核酸和蛋白质数据库对Unigene进行注释和分类,利用KEGG代谢途径分析木质素生物合成途径及其关键酶基因,利用三维同源建模分析苯丙氨酸解氨酶(AlPAL)的结构特点。结果通过转录组测序共获得54 215个Unigene,其中42 003个Unigene被任一数据库注释,1 668个Unigene被注释到54个转录因子家族中;KEGG途径分析鉴定了423个Unigene参与了木质素的生物合成。AlPAL空间结构模型显示其为同型四聚体,每个单体由3个结构域组成,包括4-甲基-咪唑-5-酮(MIO)结构域、核心结构域和屏蔽结构域,其中MIO结构域包含保守的三肽ASG,构成AlPAL酶的催化活性中心。结论对牛蒡根转录组进行分析,为牛蒡功能基因鉴定、次生代谢途径解析及其调控机制研究奠定了实验基础。     

盾叶薯蓣转录组分析及其皂苷元生物合成关键酶基因的挖掘

目的分析比较盾叶薯蓣根茎与叶片的转录组,挖掘与盾叶薯蓣中皂苷元生物合成途径相关的关键酶基因。方法利用Illumina Hi Seq2000高通量测序技术对盾叶薯蓣根茎与叶片进行转录组测序,对测序结果进行注释分析;并结合根茎与叶片中皂苷元的含量测定结果,挖掘与盾叶薯蓣中皂苷元生物合成途径相关的关键酶基因;最后利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术对部分候选基因的表达模式进行分析。结果共获得了81 660个Unigene,有64.33%在NT、NR、Swiss-Prot、KOG、GO、KEGG数据库中得到注释;根据其表达量与代谢通路分析筛选出29种共227个可能参与盾叶薯蓣中皂苷元生物合成途径的催化酶基因,部分催化酶基因的表达模式与皂苷元含量具有一定相关性;并发现5个盾叶薯蓣内生菌基因。结论研究初步获得了盾叶薯蓣中参与皂苷元生物合成的候选关键酶基因,部分候选酶基因可能参与盾叶薯蓣中皂苷类成分的后修饰过程,并发现盾叶薯蓣根茎中内生菌可能参与其皂苷元的生物合成,为进一步阐明盾叶薯蓣中皂苷元生物合成的分子机制奠定基础。     

不同年份桔梗转录组学分析及桔梗皂苷生物合成关键基因挖掘

桔梗是食药两用大宗中药材品种之一.为探究不同年份桔梗的基因表达差异和主要活性物质桔梗皂苷生物合成过程中关键基因的表达规律,该研究利用Illumina Hiseq 4000测序平台对同一产地一年生、二年生、三年生桔梗进行转录组测序与生物信息学分析.对测序数据进行过滤、组装和拼接后,共获得59 654条unigene,其中...     

金荞麦水提物通过调控RIG-Ⅰ信号通路与细胞自噬抑制甲型流感病毒H1N1的复制

目的:探讨金荞麦水提物体外抗甲型流感病毒H1N1的效果及其作用机制。方法:考察金荞麦水提物抗H1N1感染犬肾(Madin-Darby canine kidney, MDCK)细胞的活性及作用方式;转录组测序(RNA-sequencing, RNA-seq)分析金荞麦水提物处理后感染细胞的基因差异表达,筛选与抗病毒相关的信号通路;蛋白质印迹法(Western blot, WB)检测LC3 Ⅱ的表达水平,荧光显微镜观察自噬流,分析金荞麦水提物对感染细胞自噬水平的影响。结果:金荞麦水提物具有良好的抑制细胞内H1N1复制的活性,细胞对MDCK 1.25 mg/mL抑制率为51.02%,5 mg/mL抑制率为98.22%。与模型对照组比较,金荞麦水提物处理感染细胞后,引起2 682个基因差异表达。KEGG通路富集分析表明,差异表达基因富集在RIG-Ⅰ和细胞自噬信号通路。金荞麦水提物1.25、2.5、5 mg/mL处理的感染细胞中,LC3 Ⅱ蛋白表达及LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值显著低于模型对照组(P<0.01),且出现自噬溶酶体。结论:金荞麦水提物具有显著体外抗H1N1的活性,其作用机制与对宿主细胞RIG-Ⅰ信号通路的调控,以及抑制感染诱导的细胞自噬相关。     

基于转录组测序的青天葵差异表达基因分析

目的在青天葵球茎和叶片两个组织的转录组测序数据的基础上,进行差异表达基因(differential expressed gene,DEG)的筛选和分析。方法采用Reads Per Kb per reads(RPKM)方法计算青天葵转录组测序获得的单基因(unigene)在球茎和叶片中表达量,根据球茎和叶片之间RPKM的log2倍数绝对值大于1且错误发现率小于0.01筛选DEG,将DEG归类至Nr、GO、KEGG等公共数据库获取其功能释义;并基于功能注释,挖掘参与青天葵激素合成和信号传导过程的DEG。结果筛选出符合条件的DEG共62 605条,包括了31 488条表达上调DEG和31 117条表达下调DEG。分别有51 652条和14 215条DEG在GO和KEGG数据库中获得注释,涵盖GO数据库的42个功能亚类和KEGG数据库的280条代谢途径。在挖掘到的16个与青天葵激素合成和信号传导过程的DEG中,7个为上调表达基因,9个为下调表达基因。结论通过转录组测序数据较全面地提供了青天葵球茎和叶片基因的差异表达情况,为青天葵的功能基因的克隆和功能分析等提供研究基础和理论依据。     

茉莉酸甲酯诱导下远志幼苗转录组分析及三萜类生物合成途径关键酶基因挖掘

目的获得远志Polygala tenuifolia响应茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)处理的转录组学信息,挖掘远志三萜类化合物骨架生物合成的关键酶基因。方法以生长30 d的远志组培苗为材料,分别用无菌水(CK)、50μmol/L MeJA、100μmol/LMeJA处理24h,采用Illunima Hiseq^TM2000 150PE进行转录组测序,使用Trinity软件完成Unigene的denovo拼接,基于BLAST实现Unigene的分类、功能注释、代谢通路分析、蛋白功能注释、差异基因分析和筛选等。结果最终获得52.19 Gb数据,通过de novo拼接注释得到Unigene 54 426条,平均长度为1 604 bp,注释成功率100%。通过对MeJA处理前后基因进行差异分析,共筛选出差异基因3 390个,其中有1 287个上调,2 103个下调,且以100μmol/L MeJA处理的差异基因总数及上调数最高。KEGG富集分析表明,差异基因主要富集于苯丙烷类生物合成、半胱氨酸与蛋氨酸代谢、淀粉蔗糖代谢、光合生物的固碳作用、萜类骨架生...     

基于高通量测序的当归抽薹相关基因分析

目的：筛选与当归抽薹相关的基因并探讨其分子机制。方法：取抽薹和未抽薹当归植株,剪取倒数第三片功能叶中部小叶片,利用BGISEQ-500测序平台对当归叶片基因进行高通量测序,再通过非冗余蛋白（NR）、核酸序列（NT）、Swiss-Prot、InterPro、京都基因与基因组百科全书（KEGG）、真核生物蛋白相邻类的聚簇（KOG）、基因本体（GO）数据库进行功能基因注释。结果：抽薹当归与未抽薹当归共有936个差异表达基因（DEGs）,在公共数据库比对得到867个DEGs,其中505个基因有明确功能,这些功能基因中有182个上调基因。在DEGs中筛选与当归抽薹相关的基因。其中调节细胞生长的基因有CDC48C、CSLA2、CYCA1-1、AUG8、CER26、 At1g65390、 BTAF1;调节开花的基因有TPS1、 ALA6、 AP2、 SOCI;调节叶片光合作用的基因主要有CAB37、CAP10A。结论：细胞形态建成相关的基因在抽薹当归叶的生长发育过程中发挥了重要作用。抽薹和未抽薹当归差异表达基因的研究丰富了当归基因资源,为进一步开展分子生物学及分子育种研究提供了基础数据。     

利用转录组分析款冬萜类化合物生物合成关键酶基因及表达特征

目的挖掘与款冬萜类化合物生物合成途径相关的关键酶基因。方法利用Illumina HiSeq2500测序平台对野生款冬花蕾和叶进行转录组测序,使用Trinity软件de novo从头组装,并通过基因功能注释、差异表达基因分析等生物信息学方法进行分析,挖掘款冬中萜类化合物生物合成途径相关的酶基因。结果转录组测序获得39 912 371条高质量reads(SRA号:SRR9113366,SRR9113367),组装获得91 118条Unigene,55 830条Unigene在NR、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG等数据库得到注释。鉴定出参与款冬萜类化合物生物合成相关酶基因的129个Unigene,包括91个参与三萜骨架生物合成酶基因,32个萜类合成酶基因,6个细胞色素P450基因,其中差异表达基因25个,涉及上游MVA途径的4个差异基因在花蕾中表达量高于叶,MEP途径的5个差异基因在叶中表达高于花蕾,另外还有10个基因在叶中高表达,9个基因在花蕾中高表达。根据差异基因HMGR、TPS、AS、CYP450基因在花蕾中高表达,推测可能与花蕾中萜类物质含量高有关。结论从款冬转录组数据库中初步获得了可能参与萜类化合物生物合成途径的候选关键酶基因,为进一步阐明款冬萜类化合物生物合成的分子机制奠定基础。     

金荞麦黄酮醇合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 克隆金荞麦黄酮醇合酶(FdFLS)基因的编码序列,并对该基因进行序列分析、原核表达及其活性研究.方法 采用同源克隆技术获得FdFLS基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;构建FdFLS原核表达载体pET-30b(+)-FdFLS,在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,并测定目标蛋白的酶学活性.结果 FdFLS基因开放阅读框(ORF)全长1008 bp,编码334个氨基酸;FdFLS基因在大肠杆菌中可表达出相对分子量约4×104的蛋白,并具有将二氢槲皮素和二氢山柰酚转化为槲皮素和山柰酚的催化活性.结论 首次克隆到FdFLS基因,并实现该基因在大肠杆菌中有活性的表达.     

金荞麦MYB转录因子基因FdMYBP1的克隆及分子特征分析

目的:对金荞麦MYB转录因子基因FdMYBP1进行克隆和序列特征分析.方法:采用RACE结合cDNA文库筛选的方法,从金荞麦cDNA文库中克隆MYBP1基因(FdMYBP1);生物信息学分析,Southern杂交.结果:克隆到1个MYBP1转录因子基因(FdMYBP1),通过Southern杂交分析,推测FdMYBP1基因是1～2个拷贝基因;FdMYBP1基因编码1个长256个氨基酸的蛋白质,在N端存在1个保守结构域,属于MYB转录因子家族.结论:首次从金荞麦中克隆到转录因子基因FdMYBP1,它具有MYB同源基因的典型特征,可能在金荞麦类黄酮代谢途径中起作用.     

积雪草皂苷生物合成基因筛选与表达量分析

目的：筛选积雪草皂苷生物合成相关的关键酶基因,并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术进行验证。方法：采用HPLC对积雪草不同部位进行皂苷含量测定;利用转录组学、KEGG富集分析等手段挖掘积雪草皂苷生物合成关键酶基因;采用qRT-PCR技术验证挖掘出的关键酶基因在不同组织中的表达模式,并使用皮尔逊(Pearson)法分析关键酶与皂苷类成分的相关性。结果：在根、茎、叶、叶柄、果实这5个不同组织中,叶的积雪草皂苷含量最高;挖掘遴选出积雪草皂苷生物合成相关的关键酶基因4个,分别为氧化鲨烯环化酶(CaOSC1、CaOSC2)、鲨烯环化酶(CaSE)、鲨烯合酶(CaSS);这4个关键酶基因均在叶中表达量最高。结论：积雪草不同组织的皂苷含量与4个关键酶基因表达量关系紧密,该结果为今后探究积雪草皂苷生物合成与积累的调控机制积累了必要的研究基础。     

地黄根部响应涝胁迫关键基因的鉴定

目的:本研究利用RNA-seq技术,对涝胁迫下的地黄根部差异表达基因进行了鉴定,为揭示地黄特异响应涝胁迫的分子机制奠定基础。方法:以温"85-5"怀地黄品种为供试材料,采用人工模拟涝胁迫的方法处理地黄植株,利用升级版数字基因表达谱技术分别对对照及处理样品进行测序,测序结果与转录组文库比对获得表达基因,利用RPKM方法计算基因的表达量,以FDR0.005和|log2 ratio|≥1为标准,筛选差异表达基因,并对差异表达基因进行GO和KEGG注释和富集分析。结果:涝害胁迫处理后共筛选到7249差异表达基因,上调表达2505个(约35%),下调表达4744个(约65%)。结论:KEGGPathway显著性富集分析发现基础代谢、次生代谢、植物激素信号转导途径、淀粉和蔗糖代谢途基因包含的比例较多。功能分析发现,涝害条件下参与乙醇发酵、乙烯合成等途径的基因被显著上调,钙信号途径的基因异常,同时发现许多转录因子呈现差异表达,如WRKY、GRAS和NAC这些与胁迫相关的基因发生上调表达,而调控正常生长的转录因子如BHLH、MYC、BYB、MADS-box等则是以下调表达为主,由此证实涝害胁迫严重影响植物的正常生长发育。     

不同生长年限巴戟天蒽醌类含量差异比较及转录组学挖掘蒽醌类生物合成相关基因

目的 研究不同生长年限巴戟天Morinda officinalis根部蒽醌类化合物的含量差异及生物合成相关基因。方法 采用HPLC测定1年生和6年生巴戟天根中蒽醌类化合物成分,并进行比较转录组分析,采用qRT-PCR验证基因表达结果。结果 HPLC检测结果显示在6年生根中蒽醌类物质显著增加,通过比较转录组分析,从1年生和6年生巴戟天的根中筛选到8 619条差异表达基因,KEGG分析表明差异基因主要富集在各种次生代谢物的生物合成、苯丙素生物合成、泛醌和其他萜类醌生物合成等通路中。此外,共鉴定到13条蒽醌生物合成途径相关的差异表达Unigenes,其中ICS、SK、CS、DHNA-CoA synthase均在6年生根中上调表达,而DXS、DXR、DAHPS、IDH均下调表达,DHQD/SDH既有上调表达的又有下调表达的Unigenes。进一步选择6个候选基因进行qRT-PCR验证,验证结果与转录组数据一致。结论 为鉴别参与巴戟天蒽醌生物合成的相关基因提供参考,为后期进一步深入研究蒽醌类生物合成的累积规律分子机制提供基础数据。     

金荞麦黄酮对2型糖尿病小鼠糖脂代谢及氧化应激的影响

目的:研究金荞麦黄酮对2型糖尿病(T2DM)小鼠糖脂代谢及体内氧化应激作用。方法:昆明种小鼠喂食高脂饲料结合一次性腹腔注射40 mg/kg的链脲佐菌素建立糖尿病小鼠模型。将成模小鼠随机分为模型对照组、二甲双胍组(75 mg/kg)、金荞麦黄酮组(50、100、200mg/kg),另设正常对照组。观察给药期间各组小鼠体重和空腹血糖(FBG)变化。给药6周进行糖耐量实验,计算糖耐量曲线下面积(area under the curve,AUC);然后小鼠眼球取血,检测血清中胰岛素水平(FINS)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px),并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛素敏感指数(ISI)。结果:与正常对照组比较,模型对照组小鼠体重减轻,FBG、FINS、糖耐量、TG、TC、LDL-C、MDA、HOMA-IR升高,HDL-C、SOD、CAT、GSH-Px、ISI下降。与模型对照组比较,金荞麦黄酮在50~200mg/kg剂量范围内可不同程度回调上述指标,且金荞麦黄酮(100、200mg/kg)剂量组作用效果更为显著。结论:金荞麦黄酮在50~200mg/kg剂量范围内对T2DM小鼠有降血糖作用,其作用机制与调节血脂代谢和抗氧化作用有关。     

金荞麦苯丙氨酸解氨酶基因FdPAL 的克隆及原核表达

目的:克隆金荞麦苯丙氨酸解氨酶(FdPAL)基因DNA和全长cDNA序列,对该基因进行序列分析,原核表达及其活性相关研究.方法:采用同源克隆和RT-PCR技术扩增苯丙氨酸解氨酶基因的DNA序列和全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析;构建PAL原核表达载体pET30b(+)-FdPAL,在大肠杆菌Escherich coli BL21( DE3)中进行诱导表达,使用分光光度计法定量测定其酶活,使用薄层色谱法鉴定其催化活性.结果:金养麦PAL基因DNA序列全长2 583 bp,由2个外显子,1个内含子构成(命名为FdPAL,GenBank登录号为HM628904);cDNA序列包含1个2 169 bp的开放阅读框(ORF),编码722个氨基酸,理论相对标准分子质量78.31 kDa,等电点5.94.SDS-PAGE分析表明,诱导后的新生蛋白质相对标准分子质量为75.37 kDa;诱导4h后,表达产物的苯丙氨酸解氨酶比活力最高,达到4 386 nmol·g-1·min-;薄层色谱结果表明,诱导表达产物具有催化苯丙氨酸转化为肉桂酸的活性.结论:首次从金荞麦中克隆到PAL基因,该基因具有植物PAL同源基因的典型特征;重组的金荞麦PAL基因表达载体[pET30b(+)-FdPAL]能有效地在大肠杆菌Ecoli BL21 (DE3)中表达,并形成具有一定催化功能的酶.     

岗梅转录组及其乌索烷型三萜皂苷生物合成相关酶基因的发掘

目的：发掘与岗梅乌索烷型三萜皂苷生物合成相关的酶基因。方法：利用Illumina 测序平台对岗梅根进行转录组测序,通过基因注释、同源分析、系统发生分析等生物信息学手段,发掘可能参与合成的单基因簇（Unigenes）。结果：在岗梅根转录组中发现了272 条与萜类生物合成相关的Unigenes。这其中包括72 条可能参与萜类生物合成上游途径的Unigenes,以及26 条可能与三萜合成途径下游母核合成、氧化和糖基化相关的Unigenes。对其中部分Unigenes 进行系统发生分析,进一步揭示了这些Unigenes 与同源基因间的进化关系。利用酵母表达系统,鉴定了两个香树酯醇合酶IaAS1 和IaAS2,其中IaAS1 为少数以α-香树脂醇为主要产物的香树酯醇合酶之一。结论：本文从岗梅根转录组数据库中发掘到一系列可能与岗 梅乌索烷型三萜皂苷生物合成相关的酶基因。对这些基因的进一步研究,有助于从分子水平揭示岗梅中乌索烷型三萜皂苷的生物合成途径。     

基于转录组测序揭示光质对刺五加实生苗基因表达的调控作用

目的 对刺五加Acanthopanax senticosus实生苗进行转录组测序,分析其响应不同光质调控的分子机制。方法 以生长60 d的刺五加实生苗为材料,设置不同光质处理组（LED-1、LED-2）和对照组[高压钠灯（high pressure sodium,HPS）],应用Illumina HiSeq^TM对其叶片进行转录组测序,对测序后的结果进行基因功能注释、差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）筛选和共表达网络分析。结果 转录组测序共获得126 252条Unigene。其中92 681条被注释,3个处理组中筛选出DEGs 7664个。基因本体（gene ontology,GO）富集结果表明,DEGs在代谢过程、刺激响应、细胞结构、催化活性等功能中得到显著富集。京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）途径富集分析表明,DEGs显著富集在植物激素传导、糖代谢、苯丙烷类生物合成、类黄酮生物合成。适度光质胁迫可以促进刺五加实生苗中苯丙素类化合物生物合成途径关键酶基因的表达,是促进刺五加有效成分累积的基础。结论 通过高通量转录组测序,揭示了不同光质对刺五加实生苗基因表达的调控特征,可为深入研究刺五加药效成分的生物合成机制及栽培中的光环境设置提供科学依据。     

基于转录组测序揭示适度干旱胁迫对丹参基因表达的调控

目的对丹参进行转录组测序,分析丹参不同组织响应适度干旱胁迫的分子机制。方法以栽培4个月的丹参为材料,设置适度干旱胁迫组(土壤相对含水量55%～60%)和对照组(土壤相对含水量75%～80%),应用IlluminaHi Seq2000分别对根和叶进行转录组测序,对测序后的结果进行基因功能注释、差异表达基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)筛选和共表达网络分析等。结果转录组测序共获得58085条Unigene。其中28846条被注释,根和叶中的DEGs分别有1853、1457个。GO富集结果表明,丹参根和叶中的DEGs在GO功能部位中的分布基本一致,均在代谢过程、刺激响应、细胞结构、催化活性等功能中得到显著富集。KEGG途径富集分析表明,根中DEGs显著富集在DNA复制、植物激素信号转导、植物-病原菌相互作用、胡萝卜素合成等途径,叶中DEGs则主要富集在氨基酸、生物碱、苯丙烷类生物合成等途径。适度干旱胁迫能促进丹参叶中苯丙烷类、根中萜类化合物生物合成途径关键酶基因的表达,是促进丹参有效成分累积的基础。AP2/ERF、b HLH、b ZIP、WRKY、MYB类转录因子在根和叶中差异表达均较显著,基因共表达网络分析预测了在适度干旱胁迫下可能参与调控萜类基因表达的转录因子。结论通过高通量转录组测序,揭示了适度干旱胁迫对丹参不同组织基因表达的调控特征,可为深入研究丹参药效成分的生物合成机制和在栽培中的合理灌溉提供科学依据。     

基于代谢组学和转录组学的不同生长年限下银杏萜类生物合成关键基因表达分析

目的 以不同发育阶段不同树龄的银杏叶（银杏幼树叶,多年生银杏树叶）为对象,分析次生代谢物变化规律,测定黄酮及萜内酯含量,分析萜类生物合成的通路和关键基因表达,为提高银杏萜内酯产量提供分子生药学数据。方法 采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术,并进行高通量转录组学测序（RNA-seq）,从差异表达基因中寻找次生代谢物生物合成的关联酶基因。结果 代谢数据表明,不同树龄,不同发育阶段的银杏叶次生代谢物明显不同,黄酮类成分,老树叶片与幼树叶4～7月含量均呈下降趋势;同发育阶段,幼树叶含量高于老树叶片含量;萜内酯类成分,老树叶片4～7月含量略微呈上升趋势,幼树叶略微呈缓降趋势;同发育阶段,幼树叶含量高于老树叶片含量。转录组分析出萌发期,老树叶片与幼树叶片生长状态相似,5～7月老树叶与幼树叶基因表达发生较大变化。筛选出49条与萜类合成有关的候选基因,分析后发现甲羟戊酸途径（mevalonatepathway,MVA）中老树叶表达高于幼树叶;甲基赤藻糖醇磷酸途径（methylerythritol4-phosphate pathway,MEP）中幼树叶表达高于老树叶。结论 幼树叶比老树叶药用活性成...