何首乌实时荧光定量PCR内参基因筛选

为筛选适宜何首乌Polygonum multiflorum不同组织基因表达分析的内参基因,从何首乌转录组数据中选取Actin,GAP-DH,SAND,PP2A,TIP41常用的5个候选内参基因,设计特异性引物.通过实时荧光定量PCR,利用geNorm,NormFinder,BestKesper,Delta CT以及Re...     

黄草乌实时荧光定量PCR内参基因的筛选

筛选合适的内参基因是应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析基因表达的前提.为黄草乌Aconitum vilmori-nianum中基因表达分析研究提供可靠的内参基因,基于黄草乌转录组数据,筛选出19个候选内参基因(ACT1、ACTT2、ACT3、aTUB1、aTUB2、bTUB、18S rRNA、UBQ、eI...     

沙氏鹿茸草实时荧光定量PCR内参基因筛选

沙氏鹿茸草是玄参科鹿茸草属半寄生植物,主要分布在我国江西,福建,广东等地,是中药"炎宁颗粒"的重要原料之一。目前关于沙氏鹿茸草的研究报道主要集中在种质资源,化学成分,药理药效等方面,在分子生物学及功能基因组方面的研究基础还很薄弱,目前尚无沙氏鹿茸草相关内参基因的研究报道。为了筛选沙氏鹿茸草中稳定表达的内参基因,保证基因表达结果的可靠性,该研究以沙氏鹿茸草为材料,采用实时荧光定量PCR技术对来自沙氏鹿茸草转录组数据的6个内参基因(UBQ,GAPDH,AP-2,ACT,TUB,CYP)在不同土壤含水量及接种丛枝菌根Rhizophagus irregularis条件下的表达水平进行检测,并结合GeNorm, NormFinder和Bestkeeper软件综合评价6个内参基因的稳定性。结果表明,6个内参基因在不同处理下的表达稳定性具有明显差异,其中TUB,GAPDH的分析结果接近且表达最稳定,而ACT的表达最不稳定。研究结果为今后沙氏鹿茸草寄生和品质形成过程中的基因表达分析提供参考。     

栽培远志qRT-PCR内参基因筛选与P450s基因的时空表达分析

目的 筛选适用于不同生长年限和不同部位的栽培远志实时荧光定量PCR分析（quantitative real time PCR,qRT-PCR）的稳定内参基因,为远志体内各个基因表达分析提供合适内参基因。并对4个细胞色素P450单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase,P450s）基因在上述远志样品中的差异表达进行分析,明确4个P450s基因在栽培远志中的时空表达分布。方法 通过qRT-PCR获取Tubulin 1、Tubulin 2、Elongation 1、Elongation 2、Actin 1、Actin 2、GAPDH和cdc-42 8个候选内参基因在上述远志样品中的熔解曲线与C_t值;利用软件geNorm和NormFinder对候选内参基因的表达稳定性进行评价;通过qRT-PCR分析4个P450s基因CYP709B2、CYP71AP39、CYP88A85、CYP714E38在上述远志样品中的相对表达情况。结果 geNorm分析结果表明,在远志（1~3年生）根、茎、叶、花中稳定表达的为Tubulin 2与Elongation 1;NormFinder结果显示,Elongation 1是最稳定的内参。CYP709B2、CYP71AP39基因在远志茎、叶（1~3年生）中的mRNA表达量最高,在根与花中的表达量则较少。而CYP88A85、CYP714E38基因则在远志根（1~3年生）中的mRNA表达水平较高。结论 Elongation 1适合作为栽培远志体内基因表达分析的内参基因。栽培远志中的P450s基因在远志根、茎、叶、花中的表达趋势不一致。     

艾Artemisia argyi实时荧光定量PCR内参基因筛选

艾叶是中国传统中药,在药用和灸用产品的市场需求日益增加,具有重要的药用价值和经济价值.筛选稳定可靠的qRT-PCR内参基因是开展艾的基因表达差异分析研究的必要前提.该研究从艾的转录组数据中选取Aain、18s、EF-1α、GAPDH、SAND、PAL、TUA、TUB8个常用的内参基因作为候选基因,利用实时荧光定量技术(...     

绞股蓝实时荧光定量PCR内参基因筛选和验证北大核心

目的:筛选适宜绞股蓝不同组织表达分析的内参基因,掌握绞股蓝皂苷生物合成关键酶基因GpFPS在绞股蓝不同组织中的表达特性。方法:基于绞股蓝转录组数据,以10个内参基因作为候选基因,采用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder分析绞股蓝不同组织中10个候选内参基因的稳定性。利用实时荧光定量PCR技术,筛选出符合要求的内参基因,并实测基因GpFPS在绞股蓝不同组织中的表达情况。结果:候选内参基因在绞股蓝不同组织中的表达稳定性由高到低排序为PP2A、CYP、eIF4α、Actin、EF1α、TIP、18S、GAPDH、UBQ10、TUB6。GpFPS基因表达量在不同组织中由高到低分别是:嫩叶、老叶、花、卷须、成熟果、茎或根、幼果。结论:适合于绞股蓝不同组织基因表达分析的内参基因是PP2A和CYP,通过验证分析,该内参基因的可靠性强,为进一步研究绞股蓝皂苷生物合成相关基因的功能积累了必备的实验基础。     

川赤芍实时荧光定量PCR内参基因的筛选与验证

川赤芍与芍药共同作为《中国药典》著名药材赤芍的基原植物,具有重要的药用价值,且在花卉市场的潜力巨大。筛选稳定可靠的内参基因是开展川赤芍分子研究的必要前提。该研究从川赤芍的转录组数据中选取Actin和GAPDH 2个内参基因作为候选基因,利用实时荧光定量技术(qRT-PCR)检测2个候选基因在川赤芍的不同组织(韧皮部、木质部、茎、叶、叶柄、子房)和不同生长时期(萌动期、开花期、休眠期)的表达水平,然后利用geNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCT和RefFinder综合分析2个内参基因表达的稳定性,结果表明Actin和GAPDH在川赤芍不同组织和不同生长时期中的表达模式均稳定。该研究进一步检测川赤芍转录组数据中8个基因(Pv-TPS01、Pv-TPS02、Pv-CYP01、Pv-CYP02、Pv-CYP03、Pv-BAHD01、Pv-UGT01、Pv-UGT02)在不同组织中的表达水平,结果表明,以Actin和GAPDH分别作为内参基因,8个基因在川赤芍不同组织部位的表达趋势均一致,验证了Actin和GAPDH作为川赤芍内参基因的可靠性。综上,该研究发现Actin和...     

罗汉果实时荧光定量PCR内参基因的选择

罗汉果为药食两用的传统中药,研究从罗汉果转录组中选取了Actin,18SrRNA,ubiquilin,ef1-α,ef1-β,Tubulin作为候选基因,通过实时荧光定量PCR,利用geNorm,NormFinder,BestKeeper,Delta CT,RefFinder软件和方法对6个候选参考基因在不同罗汉果样品中的表达稳定性进行分析,首次筛选出了不同时期的有籽和无籽罗汉果果实中较理想的内参基因,结果发现18SrRNA在所有罗汉果样品中表达最稳定,是样品基因分析适合的内参基因,对采用qRT-PCR方法分析罗汉果基因表达中内参基因的选择具有指导作用,也为罗汉果生物合成途径基因及其他不同条件下基因差异表达研究提供参考,确保罗汉果基因表达分析结果的可靠性.     

狭叶柴胡内参基因筛选及皂苷合成关键酶基因组织表达分析

目的筛选适宜狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium组织表达分析的内参基因,分析柴胡皂苷合成关键酶基因的组织表达模式。方法选取Actin、α-tubulin、β-tubulin、Cyclophilin、EF-1α5个常用的内参基因作为候选,分别使用Delta CT、Best Keeper、Norm Finder、ge Norm软件对各候选内参基因的稳定性进行评价,并对候选内参基因的稳定性进行验证,利用实时荧光定量PCR技术,以筛选得到的内参基因分析狭叶柴胡根、茎、叶、果中柴胡皂苷合成关键酶基因HMGR、IPPI、FPS、SS、β-AS基因的组织表达模式。结果候选内参基因平均表达稳定性由高到低排序为β-tubulinCyclophilinActinEF-1αα-tubulin,β-tubulin是狭叶柴胡基因组织表达分析的适宜内参基因。HMGR基因表达量由高到低为根茎/果叶,IPPI基因表达量由高到低为根茎果叶,FPS基因表达量由高到低为叶根茎果,SS基因表达量由高到低为叶果根茎,β-AS基因表达量高低为叶根果茎,其中HMGR与IPPI及FPS与β-AS基因的表达显著呈正相关(P0.05)。结论筛选得到了狭叶柴胡不同组织基因表达分析的最适内参基因为β-tubulin,为狭叶柴胡基因组织表达分析奠定方法学基础。柴胡皂苷合成关键酶基因有不同的组织表达模式,可能参与调控狭叶柴胡不同组织中柴胡皂苷合成与积累的流向。     

穿心莲茉莉酸甲酯及非生物胁迫下Real-time PCR内参基因的筛选

目的 筛选合适的穿心莲茉莉酸甲酯（MeJA）和非生物胁迫下实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测的内参基因。方法 利用高温、干旱、紫外和MeJA处理的穿心莲转录组数据,挑选到7个候选内参基因肌动蛋白1（ACT1）,肌动蛋白2（ACT2）,转录延伸因子（EF-1α）,甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）,微管蛋白（TUB）,多聚泛素酶（UBQ）和18S核糖体RNA（18S）,并以上述处理后的穿心莲叶片为实验材料,进行Real-time PCR验证。利用geNorm,NormFinder 和BestKeeper 3种内参稳定性评估软件进行分析,再利用Refinder软件进行综合分析。结果 3种软件基于不同指标进行稳定性评估,结果并不相同,综合分析得出候选内参基因在高温胁迫下表达稳定性顺序依次为UBQ>18S>EF-1α>ACT2>ACT1>GAPDH>TUB;干旱胁迫下表达稳定性顺序依次为ACT1>UBQ>EF-1α>18S>ACT2>GAPDH>TUB;UV胁迫下表达稳定性顺序依次为EF-1α>TUB>ACT2>UBQ>18S>GAPDH>ACT1;MeJA胁迫下表达稳定性顺序依次为ACT1>EF-1α>UBQ>ACT2>18S>TUB>GAPDH。其中18S基因表达丰度较高,不适合作为内参基因。结合转录组数据对4种胁迫中穿心莲内酯合成相关基因酶羟甲基戊二酰-辅酶A合成酶（HMGS）的相对表达水平验证,发现合适内参基因的Real-time PCR结果更可靠。结论 穿心莲高温、干旱、紫外和MeJA胁迫时,UBQ,ACT1和UBQ,EF-1α和TUB,ACT1和EF-1α分别为最适内参基因组合,为后期开展穿心莲高温、干旱、紫外和MeJA处理中基因的功能调控和表达研究提供了参考。     

基于实时荧光定量PCR分析的北柴胡内参基因的筛选及验证

目的筛选出在北柴胡不同生长时期及不同器官中表达均稳定的内参基因并进行验证。方法利用实时荧光定量PCR获得18个候选内参基因所有Ct值,通过3种不同算法(Bestkeeper、Norm Finder、Ge Norm)的软件对内参基因稳定性进行分析,采用皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient)分析3个软件给出的稳定性排名结果。结果所有候选内参基因的Ct值相对宽泛,ADF1b、ADF5、ADF7、e IF2b和ACT2为最为合适的内参基因,而e IF6被认为稳定性最差的内参基因。3个软件计算结果均呈现显著性相关。结论采用实时荧光定量PCR结合3种不同算法进行北柴胡内参基因的筛选及验证是可行的。在北柴胡柴胡分子遗传研究中,发掘到的内参基因对目的基因进行均一化处理有助于提高目的基因表达分析的精确性及可信度。     

肉桂和大叶清化桂内参基因的筛选和验证

目的:筛选适用于肉桂和大叶清化桂不同部位进行实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分析的稳定内参基因,为肉桂和大叶清化桂皮枝叶3个不同部位的基因表达分析提供稳定的内参基因.方法:以肉桂和大叶清化桂两种植物的皮、枝、叶等6个不同组织器官为实验材料,使用Real-time PCR技术对甘油醛-3-磷酸脱氢...     

基于实时荧光定量PCR对镉处理下黄花蒿内参基因稳定性的分析

研究选取黄花蒿的Actin,18S rRNA,PAL,GAPDH,CPR作为候选内参基因,设计特异性引物,通过实时荧光定量PCR,利用geNorm,NormFinder,BestKeeper,Delta CT以及RefFinder软件和方法对5种内参基因在不同浓度镉处理下黄花蒿叶片中的表达稳定性进行分析,为黄花蒿基因差异表达研究提供可靠的内参基因,确保黄花蒿基因表达分析结果的可靠性。结果表明在不同浓度镉处理下,黄花蒿叶片中候选内参基因的表达稳定性存在差异,综合分析得出候选内参基因表达稳定性顺序依次为Actin >18S rRNA >PAL >GAPDH >CPR。因此,在黄花蒿基因差异表达分析中,可以考虑选取Actin,18S rRNA,PAL作为内参基因,采用多内参校正结果。此外,研究还发现同浓度镉处理下黄花蒿叶片中的候选内参基因表达稳定性也存有差异,这说明即使在同一处理条件下也有必要进行内参基因的筛选。总之,该研究首次提供了在不同浓度镉处理下黄花蒿叶片中比较理想的内参基因,也为其他条件下黄花蒿的基因表达分析提供了参考。     

巴戟天实时荧光定量PCR内参基因的选择

目的选择合适的内参基因,用于巴戟天不同组织和不同处理的叶中目标基因表达量的分析检测。方法以巴戟天不同组织和不同处理的叶为材料,根据巴戟天转录组数据,选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)、微管蛋白α(tubulinalpha,TUA)和肌动蛋白(Actin)基因等10个内参基因作为候选基因。利用实时荧光定量技术,并结合geNorm、NormFinder和BestKeeper等软件分析内参基因的表达稳定性,从而筛选出巴戟天不同组织和不同处理叶中表达稳定的内参基因。选择合适的内参基因对巴戟天的1-脱氧木酮糖-5磷酸合成酶(DXS)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)基因在不同组织和不同处理的叶中相对表达量进行分析。结果内参基因GAPDH和泛素(UBQ)在巴戟天不同组织中表达最稳定,GAPDH+UBQ的双内参组合能够更加准确地分析目的基因在巴戟天不同组织的相对表达量,而在不同处理的叶中GAPDH和Actin表达稳定性最好,选择GAPDH+Actin的双内参组合可以确保目的基因相对分析表达结果的可靠性。在巴戟天不同组织中,DXS目的基因的相对表达量为根<茎<叶,DXR的相对表达量为茎<根<叶。在巴戟天不同处理的叶中,DXS和DXR基因的相对表达量相对于未处理的叶(CK)都有所提高。结论筛选得到的稳定内参基因为后续巴戟天相关基因表达研究奠定基础,使用2个稳定内参的组合对目的基因进行均一化处理有利于提高目的基因表达分析的准确性。     

青天葵实时荧光定量PCR内参基因的选择

目的 筛选合适的内参基因用于青天葵实时荧光定量PCR分析的校正.方法 以毛唇芋兰3个组织(叶片、叶柄和球茎)为材料,利用实时荧光定量PCR技术探讨18S rRNA、actin、ubiquitin、EF-lα和β-tubulin 5个常用内参基因在毛唇芋兰不同组织中表达差异.利用GeNorm和NormFinder软件比较各内参基因的Ct值,以分析他们在青天葵3个组织的表达稳定性.结果 5个内参基因的表达稳定性各异,GeNorm软件分析结果表明,稳定性β-tubulin=EF-lα＞ubiquitin＞actin＞ 18S rRNA;NormFinder软件结果显示β-tubulin稳定性最好,EF-1α次之,18S rRNA则最差.两个不同软件分析结果一致.结论 β-tubulin可作为毛唇芋兰不同组织中基因表达差异分析的校正内参基因.     

红花种子不同发育时期内参基因表达稳定性分析

目的通过qRT-PCR分析对比红花开花后不同发育时期的种子中内参基因的表达稳定性,筛选出红花种子成熟过程中最稳定的内参基因。方法应用实时荧光定量PCR技术,分析6个传统内参基因ACT、EF1α、GAPDH、UBI、TUA、TUB在红花种子不同发育时期的mRNA表达差异情况;利用GeNorm和Normfinder软件评价上述内参基因在红花开花后不同发育阶段的种子中的表达稳定性。结果荧光定量及GeNorm软件分析结果显示,6种内参基因的表达性各异,但表达最为稳定的内参基因是EF1α,表达最稳定的内参组合是EF1α和TUB。为了数据的真实可靠又选用了Normfinder软件分析,结果显示UBI基因表达不太稳定,EF1α、ACT、TUB、TUA和GAPDH内参的表达稳定性都小于0.15,相对比较稳定。结论为红花开花后不同发育时期种子的荧光定量PCR分析提供了详尽的内参基因参考。     

盐胁迫蜜环菌Real-time PCR内参microRNA的筛选

目的:在利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)进行microRNA(miRNA)表达分析的过程中,选择合适的内参miRNA对数据标准化起到重要作用。方法:该文挑选了13个蜜环菌候选miRNA对其前体进行生物信息分析,PMRD预测其前体相似序列,并用RNAfold对候选miRNA前体及其相似序列进行二级结构预测。利用Real-time PCR检测在受盐胁迫前后两种基因型蜜环菌(基因型A,基因型B)miRNA的表达量,并结合geNorm,NormFinder,BestKeeper软件分析其表达稳定性,筛选合适的内参。结果:对候选miRNA的9条前体进行二级结构预测以及特征分析,证明预测的miRNA属于miR家族具有典型的茎-环结构且成熟的miRNA位于其前体的5'或是3'端;geNorm分析表明,基因型A蜜环菌可选择Novel-4*,Novel-9作为内参组合,基因型B可选择Novel-9,Novel-16作为内参组合;NormFinder分析结果显示,Novel-9在基因型A蜜环菌和基因型B蜜环菌中都有较好的稳定性;BestKeeper分析显示Novel-12*在基因型A蜜环菌中稳定性较好,Novel-2*在基因型B蜜环菌中稳定性较好。结论:稳定性最优的内参miRNA为Novel-9,为进一步开展蜜环菌miRNA调控机制研究奠定了基础。     

人参β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立

目的建立人参β-actin基因实时荧光定量PCR的方法。方法根据GenBank上其他高等植物β-actin基因保守区域设计一对特异性引物,将从人参中PCR扩增得到的β-actin基因克隆到pMD20-T载体上构建重组质粒,经1/10梯度稀释后用于制定标准曲线,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。结果该方法检测β-actin基因的最低拷贝数为43拷贝/μL,在较广的范围内(43~4.3×107拷贝/μL)有良好的线性关系(R2=0.995 3);熔解曲线分析显示扩增产物为特异性单峰,其Tm值为(84.51±0.01)℃;5个不同浓度对照品组内试验变异系数为0.58%~2.79%,组间试验变异系数为2.61%~4.41%。结论该方法具有快速、灵敏、特异、高通量及重复性强等优点,为β-actin基因作为内参基因进行人参功能基因表达的定量分析提供了方法学基础。     

显齿蛇葡萄实时荧光定量PCR内参基因的筛选与验证

目的筛选适用于显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)的内参基因。方法设计简并引物,采用RT-PCR从显齿蛇葡萄中克隆6个候选内参基因片段,包括肌动蛋白基因(Actin)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、18 S核糖体rRNA基因(18 S-rRNA)、α-微管蛋白基因(α-Tubulin)、β-微管蛋白基因(β-Tubulin)和多聚泛素酶基因(UBQ)。应用qRT-PCR技术检测这6个候选内参基因在显齿蛇葡萄不同组织器官中(茎尖、嫩叶、成熟叶、老叶、茎和根)的表达情况。借助Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种统计学软件综合评价6个内参基因的表达稳定性。通过苯丙氨酸解氨酶基因(Ag PAL)的表达分析对筛选出的内参基因进行稳定性验证。结果 18 S-rRNA、GAPDH和Actin的表达稳定性较好,适合作为显齿蛇葡萄不同组织基因表达研究的内参基因,以这3个基因为内参基因分析Ag PAL基因的相对表达量,结果发现它们在各组织器官中的表达变化趋势基本一致。结论确定显齿蛇葡萄qRT-PCR分析的合适内参基因,为后续相关基因表达研究奠定基础。     

老鸦瓣实时定量PCR内参基因的筛选和验证

药用植物老鸦瓣供需矛盾日益凸显,但分子生物学方面研究基础还较薄弱。为开展老鸦瓣相关功能基因表达量的分析检测,需要选择适宜的内参基因以提高实验结果准确性。从老鸦瓣转录组数据中筛选出8个候选内参基因(ACT,TUA,CYP,GAPDH,UBQ,UBI,EF1α,UBC),利用实时荧光定量技术检测候选内参基因在老鸦瓣鳞茎、叶、花以及芽茎不同发育阶段中的表达水平。应用GeNorm,NormFinder和BestKeeper软件以及RefFinder网站综合评估内参基因稳定性。结果表明8个候选内参基因中UBC的Ct变化范围最小,表达水平最稳定,适合作为内参基因;GeNorm和NormFinder软件分析结果显示UBC和UBI的稳定性相对较好;BestKeeper评估CYP和UBC表达较稳定;RefFinder网站综合排序稳定性最好的基因为UBC和UBI,而ACT在所有软件评估中稳定性最差。分别以稳定性最好的UBC,UBI和最差的ACT为内参基因检测老鸦瓣GBSS基因的表达,GBSS基因在UBC和UBI校正下表达模式相同,以ACT为内参时表达趋势有较大差异,进一步验证了筛选结果的可靠性,表明UBC和UBI均适合作为老鸦瓣不同器官和芽茎不同发育时期基因表达研究的内参基因。该研究筛选得到的稳定内参基因UBC和UBI为后续开展老鸦瓣中关键基因表达分析研究奠定了基础。