Endostatin基因真核表达载体的构建及活性鉴定

目的：构建endostatin基因的真核表达载体,并将其转染C6脑胶质瘤 细胞,探讨其体外抑制血管内皮细胞生长的活性。方法：利用PCR将大鼠血清蛋白分泌信号连接在endostatin基因的碳末端,构建成真核表达载体pcDNA3-Sendostatin,利用Lipofectamine法将其转染C6脑胶质瘤细胞,采用细胞增殖实验进行endostatin表达蛋白体外活性鉴定。结果：成功构建了endostatin基因真核表达载体,转染该载体的C6脑胶质瘤细胞可分泌表达抑制血管内皮细胞增生的endostatin蛋白。结论：endostatin是一种有效的血管生成抑制剂,可进一步用于在体肿瘤的抗血管生成治疗。     

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建

目的：构建人血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)基因的真核表达载体，以便进一步研究VEGF-C基因在淋巴管生成中的作用。方法：根据人VEGF-C的cDNA序列，设计合成一对5′端分别含有EcoR I和BamH I酶切位点的特异性引物，运用RT-PCR方法克隆人乳腺癌细胞MDA-MB-231中的VEGF-C cDNA(1．26Kb；回收PCR产物(1．28Kb），并将其连接至克隆载体pMDl8-T中；重组的pMDl8-T在大肠杆菌DH5α内扩增后，经质粒提取、EcoR I和BamH I酶切，筛选出阳性重组子，并进行基因测序鉴定；琼脂糖凝胶电泳回收含有VEGF-C cDNA全长的酶切片断(1．27Kb)，然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3．1(-)连接，重组质粒经EcoR I和BamH I酶切予以鉴定。结果：RT-PCR产物合有VEGF-C cDNA，基因测序显示重组的pMDl8-T中含有正确的人VEGF-C cDNA全长序列，重组的pcDNA3．1（-)中含有人VEGF-C cDNA全长序列。结论：成功构建了人类VEGF-C真核表达载体VEGF-C／pcDNA3．1（-)。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达的载体构建及鉴定

目的构建HBVX基因与pCDNA3．1相融合的高效真核表达载体，为进一步研究HBVX基因的功能奠定基础。方法设计并合成HBVX基因的引物，从HBVDNA阳性的血清中，PCR扩增得到HBVX基因全序列，将其连接到真核表达载体pCDNA3．1上后，酶切图谱分析．PCR检测和扩增产物序列分析等，鉴定所构建的真核表达载体。结果以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBVX基因大小相同，酶切也得到E1的基因片段，测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论成功构建了HBVX基因的真核表达载体．为下一步研究HBVX基因及其产物的功能尊定了某础。     

人全长PLCr 1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人全长PLCr1基因真核表达载体，以便进一步研究PLCr1的作用及其机制。方法自行设计一对带有日砌Ⅲ和Not Ⅰ酶切位点的引物，采用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增人全长PLCr1 cDNA(3878bp)，纯化后，经HindⅢ-NotⅠ酶切，插入真核表达载体pLNCX2中，构建重组质粒pLNCX2／PLCr1。通过PCR，限制性酶切分析及DNA直接测序对所构建的重组质粒进行鉴定。同时经瞬时转染后，利用RT-PCR及Western blotting转染后LoVo细胞中PLCr1的表达。结果RT-PCR产物经琼脂糖电泳分析所得片段大小与预期相符(3878bp)。重组质粒经日HindⅢ-NotⅠ酶切后，得到3878bp(PLCr1基因)及6100bp(载体pLNCX2)两个片段，同时重组质粒经HindⅢ-BglⅡ酶切后．得到约1300bp及约8500bp两个片段，与预期一致。DNA测序也证实了重组质粒的正确。经RT-PCR和Westem blot分析证实转染pLNCX2／PLCr1的LoVo细胞中PLCr1的表达均高于转染空质粒pLNCX2的LoVo细胞及未转染的LoVo细胞。结论成功构建了人全长PLCr1基因真核表达载体pLNCX2／PLCr1，为进一步研究PLCr1的作用奠定了基础。     

正反义人Tankyrase基因真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人Tankyrase正义和反义真核表达载体．方法：用EcoRⅠ从TT20质粒上切下约3．44kb的Tankyrase cDNA片段，然后连入pcDNA3．1／Zeo的EcoR Ⅰ酶切位点上，经BamH Ⅰ酶切鉴定出正义和反义表达载体．结果：经BamH Ⅰ酶切后，正义质粒形成5．0 3．4kb两条带，而反义重组质粒为8．2 0．2kb两条带，与理论计算值完全一致．结论：成功构建了人Tankyrase的正、反义真核表达载体。     

丙型肝炎病毒不同基因片段真核表达载体的构建与鉴定

引言丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染，迄今仍无特效疗法及预防性疫苗．１９９２年Ｔａｎｇ等［Ｎａｔｕｒｅ，１９９２；３５６：１５２］率先报道在体内经质粒表达的异体蛋白免疫小鼠，成功地诱导产生了针对这种抗原的抗体反应；１９９３年Ｕｌｍｅｒ等［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１...     

人hTRT正反义真核表达载体的构建及初步鉴定

目的 构建人端粒酶蛋白催化亚单位（ｈＴＲＴ）正、反义真核表达载体。方法 采用分子克隆技术将ｈＴＲＴ ｃＤＮＡ正向及反向克隆到真核表达载体ｐｃｌ－ｎｅｏ中。结果 Ｎｏｔ Ⅰ酶切后,正义重组基因为８．８ｋｂ一条带,反义重组基因为３．４ｋｂ和５．４ｋｂ二条带,与理论计算相符。结论 成功构建了ｈＴＲＴ正反义真核表达载体。     

单羧酸转运泵基因反义真核表达载体的构建

目的 构建单羧酸转运泵基因反义逆转录病毒真核表达载体。方法 应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增带有双酶切位点的单羧酸转运泵目的基因片段,与带有相同酶切位点的ｐＬＸＳＮ逆转录病毒真核表达载体粘末端进行反向基因插入连接,构建具有反义表达的逆转录病毒载体。结果 构建载体进行双酶切电泳分析及插入片段基因序列分析。证明反义载体构建成功。结论 应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增插入ＤＮＡ片段,简单、灵活、快捷。双酶切定向连接构建     

突变低氧诱导因子1α基因真核表达载体的构建和表达

目的构建人低氧诱导因子-1α（HIF-1α）真核表达载体pcDNA3．1^＋-HIF-1α的两种突变体pcDNA3．1^＋-HIF-1α-564A1a和pcDNA3.1^＋-HIF-1α-564A1a-803Ala，并检测它们在人肺微血管内皮细胞（HMVECs）中的表达。方法用定点突变的方法将pcDNA3．1^＋-HIF-1α的HIF-1α第564位脯氨酸（Pro）密码子CCC突变为丙氨酸（Ala）密码子GCC，构建成单个突变HIF-1α真核表达载体pcDNA3．1^＋-HIF-1α-564Ala。在第一次突变的基础上，仍然用定点突变的方法将pcDNA3．1^＋-HIF-1α-564Ala的HIF-1α-564Ala第803位天冬酰胺（Asn）密码子ATT突变为丙氨酸（Ala）密码子GCT，构建成双个点突变HIF-1α真核表达载体pcDNA3．1^＋-HIF-1α-564Ala-803Ala。将3种HIF-1α表达载体用脂质体法分别转入HMVECs．以RT-PCR、免疫荧光法和Western blotting法分别对转染细胞进行表达分析。结果测序证实，定点突变成功，构建成重组真核表达载体pcDNA3．1^＋-HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1^＋-HIF-1α-564Ala-803Ala；3种载体均能表达相应的蛋白和mRNA。但转化突变HIF-1α表达载体的细胞蛋白量比空白细胞和转化无突变HIF-1α载体的细胞显著增加。结论成功构建能够在HMVECs中表达的单个和双个点突变的HIF-1α基因的真核表达载体。     

SLC真核表达载体的构建及蛋白质表达的鉴定

目的：构建SLC真核表达载体，并实现其真核表达。方法：通过使用限制性内切酶酶切载体中的SLC片段，再与经过相同酶切的真核表达载体pcDNA3．1进行连接，电穿孔法转染Hela细胞后，培养上清经阴离子交换层析纯化后，进行SDS—PAGE及Westernblot鉴定。结果：表达出蛋白质经westernblot法鉴定为特异性蛋白质。结论：成功获得SLC真核表达载体。     

小鼠内皮抑素基因真核表达载体的构建和表达

目的 构建小鼠内皮抑素（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）ｃＤＮＡ的真核表达载体并将其在体外培养的脑胶质瘤细胞内表达。方法 将带有分泌信号的小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建ＣＭＶ启动子控制的载体ｐｃＤＮＡ－ｓＥｎｄｏ,并将上述载体转染体外培养的脑胶质瘤细胞（ＳＨＧ４４）,采用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定其表达,应艇牛微血管内皮细胞抑制实验检测其活性,结果 成功地构建了真核表达     

RI基因真核表达载体的构建及其对人脐静脉内皮细胞的影响

目的构建融合表达载体pcDNA3.1-RI,并检测核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因与血管生成素(angiogenin,ANG)的关系及对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖及迁移能力的影响。方法用RT-PCR方法扩增RI基因,酶切后将其插入pcDNA3.1,构建融合表达载体pcDNA3.1-RI,在脂质体介导下转染HUVECs,RT-PCR检测RI、ANG基因的mRNA表达水平;Western blot检测RI、ANG、MMP-2、MMP-9的表达水平;CO-IP法检测ANG和RI的相互作用,MTT法检测细胞的增殖活力,流式细胞仪检测细胞周期分布。结果真核表达质粒构建成功;转染pcDNA3.1-RI组细胞RI基因的mRNA及蛋白的表达较2个对照组(转染pcDNA3.1空载体组和未转染质粒组)均呈显著性增加(P<0.05),而ANG基因的mRNA及蛋白的表达均降低(P<0.05),MMP-2、MMP-9蛋白表达水平亦降低(P<0.05);CO-IP法检测到ANG和RI在细胞内能结合;转染pcDNA3.1-RI质粒到HUVECs细胞后细胞的增殖活力明显降低(P<0.05),G0～G1期比例明显增加,S期减少。结论成功构建的真核表达质粒能显著增加RI基因及其蛋白水平的表达,RI可以直接在转录水平上降低ANG的表达,在细胞内与ANG结合,从而影响内皮细胞的增殖、迁移能力。     

构建单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因真核表达载体

从单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV－Ⅱ）Sav株感染的Hep-2细胞培养液和细胞裂解液中提取HSV－Ⅱ基因组DNSA，以此为模板，用PCR方法获取胸苷激酶（TK）基因，将获取的DNA片段克隆入真核表达载体pcDNA3中，筛选阳性克隆测序，结果表明：本研究获取的HSV－Ⅱ－TK基因全部编码区为1128bp，编码376个氨基酸，结果表明：本研究扩增出HSV－ⅡTK基因的全部编码区序列，并成功构建真核表达载体pcDNA3／TK.     

c-myc基因mRNA核酶真核表达载体的构建和鉴定

0　引言　冠状动脉腔内球囊成形术 (PTCA)被公认为是治疗冠心病最有效的非手术方法 ,然而 PTCA术后 6 mo球囊扩张动脉段再狭窄的发生率达 30 %以上 ,其中血管平滑肌细胞的增殖、向内膜下迁移是再狭窄的主要病理改变之一 [1 ] .研究表明 ,c- myc基因属于速发 -早期基因 ,编码产物为核内DNA结合蛋白 ,在核内的信息传递过程中起重要作用 ,可促进与细胞增殖有关的基因开放 ,产生细胞增殖效应 ,是血管平滑肌细胞增殖、迁移的触发和调控因素 ,在再狭窄的发生过程中起重要作用 [2 ,3] .我们在计算机辅助下设计了特异性切割c- myc基因 m RNA的…     

MAGE-E1a荧光真核表达载体的构建

目的：构建MAGE-Ela与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体，为研究肿瘤疫苗中树突状细胞的作用奠定基础．方法：应用基因重组技术，将反转录PCR得到的MAGE-Ela基因克隆入荧光真核表达载体pEGFP-N3中，用含卡那霉素LB培养基平板筛选转化菌，阳性重组子经SalⅠ和KpnⅠ双酶切分析、PCR鉴定．结果：MAGE-Ela基因成功地亚克隆至真核表达载体pEGFP-N3中，获得MAGE-E1a／pEGEP-N3重组质粒．结论：MAGE-E1a基因克隆入pEGFP-N3质粒，成功构建MAGE-E1a／pEGFP-N3荧光真核表达载体，解决了MAGE-E1a基因转染的定位问题，为研究肿瘤疫苗奠定了基础。     

人组织激肽释放酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定人组织激肽释放酶基(h-TKK)基因真核表达质粒。方法 设计含pnI和BamH Ⅰ酶切住点的人组织激肤释放酶基因引物，采用PCR法从原核pBluescripe Ⅱ KSKK( )中扩增KKcDNA片段，亚克隆至padtrack-CMV真核表达裁体，转化感受态大肠杆菌DHl0B，酶切鉴定阳性重组子，并进行序列测定。结果经 PCR能扩增出738bp的片段，与预期片段大小相符，构建的重组体经酶切鉴定能切出插入片段，测序结果与预期序列完全一致。结论 成功构建了人组织激肽释放酶基因真核表达重组体pAdtrack-CMV KK。     

bFGF荧光真核表达载体构建及表达

目的 构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的荧光真核表达载体，以便进一步转染成骨细胞，研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法 应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP-C3，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况。结果 ①酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性。②荧光显微镜下观察GFP的表达情况，观察到部分经转染的细胞发出绿色荧光；免疫组化检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结论 成功地构建了bFGF荧光真核表达载体pEGFP-C3-bFGF，并在3T3细胞中表达了bFGF。     

IL-18-PE38融合基因真核表达载体的构建及其在软骨细胞中的表达

目的 构建含有白细胞介素-18(IL-18)及毒素融合基因的真核表达载体，并研究其在软骨细胞中的表达情况。方法通过分子克隆技术．将IL-18-PE38融合基因插入真核表达载体PsecTag2B中，构建真核表达载体PsecTag2B-IL-18-PE38，经EcoR Ⅰ单酶切及PCR鉴定。脂质体法将其转入原代软骨细胞，通过荧光免疫细胞化学法鉴定其瞬时表达。结果 经EfoR Ⅰ单酶切及PCR鉴定证实IL-18-PE38融合基因成功克隆入真核表达载体PsecTag2B中。荧光免疫细胞化学法荧光显微镜照片证实此重组基因可在软骨细胞膜及细胞浆中表达。结论 证实了IL-18-PE38融合基因可在软骨细胞中表达，为进一步研究其对类风湿关节炎的治疗奠定了基础。     

反义VEGF165真核表达载体的构建和表达

目的 进行抗血管生成治疗人脑胶质瘤实验,构建和鉴定携带人反义VEGF165基因的真核表达载体。方法 将VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3,构建CMV启动子控制的真核表达载体pcDNA-AVEGF165,用酶切鉴定结果;应用该载体转染人脑胶质瘤细胞SHG44,G418筛选阳性克隆;Western blot和免疫组化检测转染前、后瘤细胞的VEGF表达。检测转染前、后瘤细胞的生物学性状。结果 获得反向构建的pcDNA-AVECF165真核表达载体,VEGF165反义RNA阻断了SHG44细胞的VEGF表达,该细胞生物学性状不受外源基因的表达影响。结论 成功构建的反义VEGF165真核表达载体,为人脑胶质瘤的反义基因治疗提供了必要的条件。