SARS-COV 5′UTR在基因转录中的启动子活性(英文)

目的了解SARS-COV不同毒株5’UTR RNA的构成特点和差异及其空间结构;研究该序列在真核细胞中的启动子活性。方法用软件DNASTAR-MEGALIGN和BLAST分析SARS-COV5’UTR序列同源性、RNADRAW3.0预测二级结构;构建5’-UTR CDNA序列驱动的荧光素酶基因表达质粒PGL3-5’-UTR,转染HEPG2细胞,检测萤火虫荧光素酶的表达;构建一套缺失突变质粒,使其分别3’端残留三个、两个、一个和零个(完全缺失)茎环,检测报告基因的表达;采用5’-RACE,查找转录起始位点;将PGL3-5’UTR转染A549、HEPG2、VERO E6、HELA和ECV304,检测报告基因的表达差异。结果 SARS-COV 5’UTR全长为264NT,18株有缺失突变均位于5’端。101个SAJRS-COV 5’UTR序列中,共发现5个点突变位置;SARS-COV 5’UTRRNA可形成稳定的二级结构。STEM-LOOP-Ⅱ含多个茎环结构,形成复杂的假结;PGL3-5’-UTR有明显的萤火虫荧光素酶表达;当4个茎环都具备时,荧光索酶相对活性是SV40启动子的约43%;失去第一个茎环后,是SV40启动子的约45%;而失去前两个后,则不表达荧光素酶;转录起始位点在SARS-COV 5’UTR的第56位核苷酸;在五种不同细胞中,表达强度由高到低依次是:A549、HEPG2、ECV304、HELA和VERO E6。结论①SARS-COV 5’UTR序列保守,二级结构可形成4个茎环结构域;②SARSC-OV 5’UTR有启动子活性;③在二级结构中,与启动子活性有关的结构域在前两个茎环;④SARS-COV 5’UTR在调控基因转录时,第56位核苷酸及其下游的TRS具有重要作用;⑤多种组织或器官都可为SARS-COV 5’UTR发挥启动子功能提供辅助因子,而以肺源性细胞最为适合。     

小鼠Lrp5基因基本启动子分析

目的：研究小鼠Lrp5基因基本启动子。方法：PCR扩增小鼠Lrp5基因基本启动子序列，构建荧光素酶报告基因表达体系，以PRL—TK为内参照质粒，瞬时转染COS-7细胞，48h后收集细胞测定荧光素酶相对表达活性。结果：在小鼠Lrp5基因基本启动子区域，构建了三种荧光素酶报告基因表达体系pGL3—16(-16bp- 132bp)、pGL3—54(-54bp- 132bp)和pGL3—103(-103bp- 132bp)。pGL3—103表达载体的相对荧光素酶活性最高；pGL3—54的相对荧光素酶活性是pGL3—103表达载体的80％；而pGL3—16相对荧光素酶表达活性急剧下降，与阴性对照pGL3-basic的活性相近，无启动子活性。结论：-54bp--16bp区域内含有小鼠Lrp5基因转录所必需的基本启动子序列，其中三个SP1保守序列是小鼠Lrp5基因基本启动子所必需的。     

人类CPF基因转录启动区上游的基因多态性对基因转录的影响

目的：研究人类CPF基因启动子上游的SNP（-1907C→T）对CPF基因转录的影响。方法：PCR扩增人类CPF基因上游5′近端调控区（-2026-＋63bp）序列,构建荧光素酶报告基因表达体系,瞬间转染HepG2细胞,48h后收集细胞测定相对荧光素酶表达活性。结果：在人类CPF基因基本启动子区域,构建了三种荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic-1120＋63bp,pGL3-2026＋63bp（-1907C）和pGL3-2026＋63bp（-1907T）。相对荧光素酶活性的比较显示pGL3-2026＋63bp（-1907T）的相对荧光素酶表达活性下降了约28％。结论：CPF基因上游5′近端调控区中SNP（-1907C→T）导致CPF基因启动子的转录活性下降。     

人PCAN1基因启动子的克隆及其上游调控区域的鉴定

目的克隆人前列腺癌基因1（PCAN1）5′上游2.6?kb启动子片段,构建pGL3 p2.6?kb载体, 测定其启动子活性,初步鉴定该片段内的DNA调控区域。方法采用PCR法从人基因组DNA中扩增PCAN1基因5′上游2.6?kb启动子片段,并构建到荧光素酶报道基因载体pGL3 basic中,构成pGL3 p2.6?kb;瞬时转染前列腺癌细胞LNCaP,通过双荧光素酶活性检验测定PCAN1启动子活性。 使用Erase a system对pGL3 p2.6kb载体中2.6?kb片段进行一系列5′侧翼缺失,产生12个缺失体,分别瞬时转染LNCaP细胞,通过检测荧光素酶的活性观察缺失突变对PCAN1启动子活性的影响。结果克隆的PCAN1 2.6?kb启动子片段经测序鉴定正确无误; pGL3 p2.6?kb转染LNCaP细胞后,双荧光素酶活性测定结果显示2.6?kb片段具有明显的启动子活性;5′缺失突变分析显示,PCAN1基因上游-1?599?bp?至-1?541?bp、-347?bp至-84?bp的缺失,与2.6?kb?片段相比,启动子活性分别升高2.24倍和2.53倍,-1?541?bp?至-1?226?bp的缺失,与2.6?kb片段相比,启动子活性降低2.11倍。结论 克隆的人PCAN1基因5′上游2.6?kb片段具有较强的启动子活性,PCAN1基因上游2.6?kb区域内分别存在2个负调控区和1个正调控区。     

EOLA1基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.     

EOLAl基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.     

人Tim-3启动子的克隆及其真核报告质粒的构建

目的克隆人Tim-3基因5′端非编码区处具有启动子活性的片段，构建其真核报告质粒，为进一步研究Tim-3表达调控奠定基础。方法以人基因组DNA为模板，针对人Tim-3启动子5′端非编码区处包括翻译起始点ATG和转录起始点TSS在内的-898～+242片段，设计特异性引物，PCR扩增该片段，命名为Tim-3P2，经双酶切后克隆入pGL3-Basic载体SacⅠ、XhoⅠ位点，构建pGL3-Tim-3P2荧光素酶报告质粒，与内参照pRL-TK用脂质体法瞬时共转染COS-7、RAW264.7和B16细胞系，通过双荧光素酶活性检测确定其启动子活性。结果pGL3-Tim-3P2经PCR、双酶切及DNA测序分析鉴定正确无误；pGL3-Tim-3P2转染RAW264.7和B16细胞（两种细胞均可表达内源性Tim-3）24h和48h，双荧光素酶活性检测显示其启动子相对活性约为pGL3-Basic空载体的2倍；而pGL3-Tim-3P2转染不表达内源性Tim-3的COS-7细胞后检测不到荧光素酶活性。结论成功克隆并构建含有人Tim-3启动子的真核报告质粒，该载体具有特异性Tim-3启动子活性，为进一步研究Tim-3表达调控奠定了基础。     

大鼠GLUT3基因启动子区荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的:克隆大鼠葡萄糖转运体3(glucose transporter 3,GLUT3)基因启动子区,并构建其萤火虫荧光素酶报告基因载体。方法:在对大鼠GLUT3基因5′侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从大鼠基因组中扩增出GLUT3基因5′侧翼区-1037～155bp段长为1 292bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1),再用定向克隆的方法将这一启动子区片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-basic)中,构建出包含大鼠GLUT3基因启动子区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-GLUT3),电泳与测序鉴定,最后再将pGL 3-GLUT3与内参pRL-TK用脂质体转染的方法瞬时共转染PC12和原代培养的神经元中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定pGL 3-GLUT3的启动子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染pGL3-basic与内参pRL-TK。结果:构建出荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3。与转染空质粒pGL3-basic组相比,原代神经细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性升高(5.182 9±0.264 8 vs 2.893 1±0.775 4,P=0.008),在PC12细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性也升高(2.797 7±0.512 0 vs 1.179 8±0.312 5,P=0.010)。结论:成功克隆GLUT3基因启动子区,并构建出包含GLUT3基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体,并且在PC12和原代培养的神经元中pGL 3-GLUT3可以表现出启动子活性。这为后续大鼠GLUT3基因转录调控研究提供研究素材。     

小鼠STING基因启动子的克隆鉴定及功能初步分析

目的:克隆小鼠干扰素基因刺激因子(STING)基因启动子,并对其启动子活性和转录调控机制进行初步探讨?方法:利用PCR方法扩增小鼠STING基因5′上游1 005 bp(-927~+77)的片段,亚克隆至pGL3-basic质粒,然后通过步移缺失构建不同缺失片段的重组质粒?双荧光素酶报告活性分析检测重组质粒在NIH3T3中的活性,并利用生物信息学方法预测转录因子结合位点?结果:经酶切?测序鉴定,成功构建了小鼠STING启动子荧光素酶报告基因重组质粒?与pGL3-basic质粒相比,STING启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加(P < 0.05)?通过生物信息学软件预测小鼠STING启动子区域(-177~-48)可能含有GATA?IK2?MZF1?SP1/SP3?STAT等转录因子结合位点?结论:成功构建小鼠STING不同缺失片段的启动子荧光素酶报告基因重组质粒?通过活性比较,推测小鼠STING的核心启动子区位于-177~+77区域,其中可能含有多个潜在的转录因子结合序列?     

人SAMHD1基因核心启动子区域的初步鉴定和分析

目的 鉴定人不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1 (SAMHD1)基因的核心启动子区域,研究SAMHD1的转录调控机制.方法 从HepG2细胞中提取基因组DNA,PCR扩增SAMHD1基因翻译起始位点上游937、667、553、399 bp片段.将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体,双酶切鉴定后将DNA条带切胶回收,再连入pGL3-Basic载体中,双酶切及DNA测序鉴定.将包含有4个片段的荧光素酶表达载体与pRL-TK共转染HepG2细胞,荧光素酶报告基因活性检测并分析4个片段的启动子活性.5'RACE鉴定SAMHD1在HepG2细胞中的转录起始位点.结果 电泳结果显示已经从HepG细胞中提取出基因组DNA.PCR扩增后电泳结果显示已经扩增出937、667、553、399 bp片段.双酶切后电泳结果显示成功将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体.双酶切及DNA测序鉴定已成功构建荧光素酶表达载体pGL3-937、pGL3-667、pGL3-553和pGL3-399.荧光素酶报告基因活性检测显示SAMHD1核心启动子区域位于0～-399区域(ATG前一个碱基为-1).5'RACE结果显示SAMHD1在HepG2细胞中转录起始位点位于-101.结论 SAMHD1的核心启动子位于翻译起始位点上游-101～-399区域,为深入研究肝细胞中SAMHD1转录调控机制奠定了基础.     

IPO8基因启动子的克隆及转录活性分析

目的：克隆IPO8基因5'端非编码序列,探讨其转录活性。方法：应用cDNA 5'末端快速扩增(rapid amplication of cDNA ends,5'CE)方法定位IPO8基因转录起始点;在此基础上针对其5'端非编码区包括转录起始点在 内的–3302 ~ +134区域分段进行PCR扩增,将产物克隆入荧光素酶表达载体pGL3-Basic。经酶切鉴定后,将重组质粒与 内参质粒pRL-TK共转染人骨肉瘤细胞Saos-2,用双荧光素酶活性检测以确定其转录活性。结果：成功确定IPO8基因 转录起始位点,酶切结果证实IPO8基因5'端非编码区6条续减片段正确插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic。重组 质粒转染Saos-2细胞后检测到荧光素酶的高表达(P<0.05)。结论：成功构建具有转录活性的IPO8启动子片段,为进一 步研究IPO8表达调控机制奠定了基础。     

SARS-CoV 5'-UTR相应cDNA作启动子时转录起始位点研究

目的:分析具有启动子功能的SARS-CoV基因组5'-UTR cDNA在转录出mRNA时,转录起始的位点,从而分析序列功能.方法将SARS-CoV 5'-UTR驱动下报告基因的真核表达质粒pGL3-5'-UTR,转染HepG2细胞,然后提取总RNA,采用5'-RACE,扩增出相应序列,通过比照,查找转录其始的位点.结果通过逆转录和二轮PCR,得到一个约440bp的产物,经A-T克隆后测序,转录体起始位点在SARS-CoV 5'-UTR的第56位核苷酸,其下游是保守的保守的转录调控序列(TRS).结论 SARS-CoV 5'-UTR在调控基因转录时,第56位核苷酸及其下游的TRS具有重要作用.     

原癌基因USP22启动子的克隆及转录活性分析

 目的克隆原癌基因USP22部分启动子序列,探讨其转录活性。方法应用cDNA 5忆末端快速扩增（5'RACE）方法定位
USP22基因转录起始点;在此基础上针对其5'端非编码区处包括转录起始点在内的-2 828~+52片段进行PCR扩增,产物克隆
入荧光素酶表达载体pGL3-Basic。重组质粒与内参质粒pRL-TK共转染HepG2 与Hela 细胞,双荧光素酶活性检测确定其转录
活性。结果成功确定USP22基因转录起始位点,酶切及测序结果证实USP22基因5'端非编码区2 880 bp 序列正确插入到荧
光素酶报告基因载体pGL3-Basic。重组质粒pGL3-USP22 promoter 转染HepG2 细胞和Hela 细胞后,检测到荧光素酶的高表达
（ P<0.05）。结论成功构建具有转录活性的USP22启动子片段,为进一步研究USP22表达调控机制奠定基础。     

乙型肝炎病毒前S2蛋白激活人酰基蛋白硫酯酶1启动子

目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）前S2蛋白（preS2）对人酰基蛋白硫酯酶1（APT1）启动子的作用。方法生物信息学方法确定人APT1启动子序列。PCR扩增人APT1启动子和HBV preS2基因,分别插入pGL3和pcDNA3．1（－）质粒构建人APT1启动子荧光素酶报告基因质粒 pGL3‐APT1和 HBV preS2真核表达质粒 pcDNA3．1（－）‐preS2。将 pGL3‐APT1和pcDNA3．1（－）‐preS2共转染人肝癌细胞系 HepG2,然后通过检测细胞荧光素酶活性来评价 preS2对人APT1基因启动子的作用。数据用独立样本 t检验分析。结果测序结果证实pcDNA3．1（－）‐preS2与pGL3‐APT1与实验设计相符。pGL3‐APT1的荧光素酶活性是阳性对照质粒pGL3‐Control的荧光素酶活性的1．2倍（P＜0．01）。pcDNA3．1（－）‐preS2与pGL3‐APT1共转染HepG2细胞的荧光素酶活性为无preS2基因质粒pcDNA3．1（－）与pGL3‐APT1共转染 HepG2细胞荧光素酶活性的2．6倍（P＜0．01）。结论本研究克隆的人APT1启动子序列具有高启动子活性;HBV preS2可激活人APT1启动子。     

CLONING PROMOTER OF HUMAN SATBl GENE AND EFFECT OF ATRA AND CoCl_2 ON ITS ACTIVITY

Objective To explore the structure and activity of SATBI promoter in different cells, ATRA and CoCl2 effect on its activity. Methods Using luciferase system to assay the promoter activity of human SATB1 gene, three luciferase reporter vectors were constructed which driven by different regions of 5' untranslated sequence from human SATB1 gene, called pGL3-SP2946-luc, pGL3-SP1718-luc and pGL3-SP751-luc, and transfeted into Jurkat T,K562, U937 and Hela cells transiently using lipofectinamine, the expression activity was detected at different dosage of ATRA and CoCl2 treatment for different time course. Results The reporter gene expression from SATB1 promoter were high activity in U937 cell, moderate in Jurkat T cell, low activity in K562 cell and showed no obvious activity in Hela cell, the reporter gene expression from pGL3-SP751-luc kept on the higher lever in Jurkat T,K562 and U937 cells than the other two vectors. We also found that the repressive effect of CoCl2 on SATBI' s mRNA expression and the relative luciferase expression from pGL3-SP751~luc in U937 cell was down-regulated obviously by ATRA and CoCl2 in the concentration- and time-dependent manners. Conclusion SATB1 promoter drives gene expression with cell-specificity and its core promoter region maybe exist in the - 751 ~ - 9bp of 5' untranslated region of human SATBI gene. Combined with the experiment result we found before that SATB1 was down-regulated by ATRA in U937, the results imply that STAB1 maybe is down-regulated by ATRA and CoCl2 through its promoter in the differentiation of myeloid cell line-U937.     

hURAT1基因5’UTR区荧光素酶表达重组体的构建

目的构建人尿酸盐转运蛋白1(hURAT1)基因5’UTR区荧光素酶表达重组体。方法PCR扩增包含hURAT1基因启动子最小功能单位和5’UTR区域在内的DNA片段,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-basic,构建hURAT1 5’UTR区表达重组体。重组体经双酶切后测序进行鉴定。结果克隆获得的590 bp的DNA序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确。结论成功构建了含hURAT1基因5’UTR区的荧光素酶表达载体,可用于后续功能研究。     

人细胞表面黏附分子P选择素启动子报告基因的构建及鉴定

目的构建人细胞表面黏附分子P选择素（p-selectin）基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,检测其 转录活性,并应用于筛选药物对其转录活性的影响。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的p-selectin启动子序列并设 计两端引物,扩增人基因组DNA中的p-selectin启动子。用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和p-selectin启 动子后,将p-selectin基因启动子插入到pGL3-basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-pselectin-promoter。将其与内参 质粒pRL-SV40瞬时共转染293F细胞,检测双荧光素酶活性。对不同启动子片段长度的p选择素报告基因进行双荧光素酶的 检测。以炎症因子和药物分组刺激转染了报告基因质粒的293F细胞并检测双荧光素酶活性。结果成功构建p-selectin基因启 动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-pselectin-promoter/ pRL-SV40 组荧光素酶活性为0.8573±0.4703,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40 组的荧光素酶活性值0.03955±0.05894。 pGL3-1826 bp相比较于pGL3-1092 bp组和pGL3-3738 bp组具有最强的转录活性。炎症因子LPS和TNF-α和药物As2O3均具 有上调pGL3-pselectin-promoter转录活性的作用。结论pGL3-pselectin-promoter在293F细胞中能被转录激活,并验证了炎症 因子对其转录表达的作用,并为药物筛选与评价提供解决方案。     

转录因子MZF1对大鼠RGC32基因启动活性的影响及可能的结合部位

目的 :构建大鼠补体应答基因32(response gene to complement,RGC32)启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察人胚肾细胞(HEK293)过表达髓锌指基因1(myeloid zinc finger gene1,MZF1)对大鼠RGC32基因启动活性的影响。同时,筛选其可能的MZF1结合位点。方法:将RGC32基因启动子全长(-686~-1 nt)插入到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,获得RGC32基因启动子全长荧光素酶报告质粒(p GL3-RGC32-FL)后,再将p GL3-RGC32-FL与本课题组前期构建的大鼠野生型MZF1表达质粒(p IRES2-EGFP-MZF1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,以确定MZF1对RGC32基因的启动作用。另用生物信息学软件预测RGC32基因启动子上转录因子MZF1潜在的结合位点,并据此构建3个RGC32基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3)。将上述RGC32基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒与MZF1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,以筛选MZF1的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,大鼠RGC32基因启动子(全长和各截短)的荧光素酶报告质粒均构建成功。将p GL3-RGC32-FL和p IRES2-EGFPMZF1共转染HEK293细胞发现,RGC32基因启动子活性显著增加。而将p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3分别与p IRES2-EGFP-MZF1共转染HEK293细胞后显示,p GL3-RGC32-3的启动活性显著低于p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1和p GL3-RGC32-2。提示MZF1可能结合在RGC32基因启动子的-286~-86 nt区域。结论 :成功构建了大鼠RGC32基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,证实过表达MZF1可促进RGC32基因的启动,并初步筛查出转录因子MZF1在RGC32基因启动子上可能的结合区域。