两例狂犬病病理检查及病毒分离鉴定

狂犬病是由狂犬病毒引起的人兽共患的自然疫源性传染病,病死率极高。我区1958年以前,尚无病例报告,1959年同心县临床报告一例,但未见转归报告,相距25年后,于1985年10月至1986年1月在灵武和盐池县相继发生2例人间狂犬病,为了确诊,除临床诊断外,我们还将病死者的脑组织作了病理检查和病毒分离鉴定,现将结果报告如下。发病经过及临床表现例1:简××,男,28岁,灵武县新华桥乡农民。1985年9月8日发现于7月初从盐池县青山乡买回的狗萎靡不振,用脚踢狗时被咬伤右下肢数处,伤口未作特殊处理而自愈。10月31日自觉右下肢麻木疼痛,继而狂躁、恐水、流涎、小肌群抽搐,且逐渐加重,医治无效,于11月6日死亡。     

犬瘟热病毒的分离鉴定和抗体的检查

从死亡率较高的病犬群中，处死一只发病早期的幼犬，从白细胞中分离出一株病毒，用已知的犬瘟热病毒(CDV)阳性血清作IEA和IFA检查均为阳性结果。3种抗原片用IEA检查了7只病犬的血浆，结果鉴定为CDV。其中5只阳性，均为流行后期的标本，2只阴性，1只为发病早期标本，1只为后期标本。由此表明此改疾病流行的病原为CDV病毒。     

北京市1株人狂犬病病毒分离鉴定及其分子特征

目的研究北京市一株人狂犬病病毒的N、G基因的分子特征,比较与全国流行株以及疫苗株之间的差异。方法以直接免疫荧光技术检测病人脑组织,昆明乳鼠颅内接种法分离病毒株。以RT-PCR方法扩增病毒的核蛋白及糖蛋白基因,克隆测序后进行遗传学分析。结果直接免疫荧光检测到病人脑组织中的病毒颗粒,用乳鼠颅内接种法分离到了毒株。命名为Beijing（H）株。遗传分析表明Beijing（H）株与目前我国的主要流行株N基因和G基因的核苷酸序列同源性分别是97．6％～99．1％和97．5％～99．7％。推导的氨基酸序列同源性分别是97．6％-99．2％和97．7％-99.8％。结论Beijing（H）株为基因1型狂犬病毒,属于我国目前的流行株,其与目前国内所使用的疫苗株存在一定的差异。     

全人源抗狂犬病病毒糖蛋白抗体的制备及鉴定

目的:利用重组狂犬病病毒糖蛋白(RVG)免疫人源IgM转基因小鼠,制备全人源抗重组RVG蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行初步鉴定?方法:以重组RVG蛋白作为抗原免疫人源IgM转基因小鼠,采用杂交瘤技术制备筛选全人源抗重组RVG蛋白杂交瘤细胞株,双抗体夹心ELISA实验鉴定单抗的人源性及抗体类型,并对其特异性及与灭活狂犬病病毒CVS-11株的结合能力进行鉴定?结果:建立了5株稳定分泌抗重组RVG的全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为5D1?6H11?9A3?15D6?19E6,均为人源IgM免疫球蛋白,5株单抗均能特异性识别重组RVG蛋白,其中3株能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合?结论:筛选制备了特异性全人源抗重组RVG蛋白的单克隆抗体,能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合,为进一步研制用于狂犬病防治的抗体药物奠定了基础?     

手足口病的病毒分离和鉴定

1983～1984两年从长春市发生的手足口病患儿的血及疱疹中分离出病毒,经鉴定均为柯萨基A组16型病毒。患儿恢复期的血清对柯萨奇A_(16)型病毒的中和抗体均比急性期高4倍以上。     

海口市蚊媒分布及乙脑病毒分离鉴定

目的 调查海口市吸血蚊媒分布及蚊虫携带乙脑病毒的情况.方法 于2015年7月至2016年6月采用帐诱法捕捉蚊虫,用细胞培养法分离病毒,磁珠法提取病毒RNA、RT-LAMP扩增,并进行分子生物学鉴定.结果 于海口市捕捉蚊虫共561只,其中库蚊528只,占94.12%,伊蚊33只,占5.88%;库蚊研磨液接种于BHK21产生典型的细胞病变,RT-LAMP扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,蚊媒体内乙脑病毒阳性.结论 海口市存在携带乙脑病毒的吸血蚊媒.     

狂犬病病毒糖蛋白在大肠埃希菌中的表达及鉴定

目的 表达狂犬病病毒糖蛋白(GP),用于狂犬病疫苗免疫抗体评估和狂犬病病毒糖蛋白功能的研究. 方法 采用分析软件,分析其可能的抗原表位,利用PCR方法 扩增狂犬病病毒SRV9疫苗株G蛋白抗原位点区域基因,PCR产物经EcoRI和SalI双酶切后,插入大肠埃希菌表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-6P-1/G87a和pGEX-6P-1/G100a.将重组质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞中,在IPTG诱导下表达目的 蛋白,进行SDS-PAGE分析.表达蛋白进行电洗脱纯化和Western blot鉴定分析.结果 成功构建了pGEX-6P-1/G87a和pGEX-6P-1/G100a表达质粒,序列分析表明,插入片段大小分别为1314 bp和1275 bp.SDS-PAGE分析结果 证明,在大肠埃希菌系统中成功表达了狂犬病病毒部分糖蛋白,表达的融合蛋白含有GST标签,大小分别约为74×103和73×103.Western blot鉴定结果 表明,表达产物有抗原特异性并能与狂犬病病毒抗血清反应.结论 利用大肠埃希菌表达系统成功表达了狂犬病病毒部分糖蛋白,表达产物有良好的反应原性.     

犬细小病毒的分离与鉴定

应用猫肾F-81系传代细胞,采用同步接毒的方法及无牛血清细胞培养法,从临床患出血性肠炎犬粪中分离到一株病毒。通过对第6代细胞培养病毒液进行电镜形态观察、病毒理化特性试验、核酸型测定、幼犬人工感染试验、血凝及血凝抑制试验,以及用标准抗CPV免疫血清进行病毒中和试验及免疫电镜观察等系统鉴定,证明该病毒株为犬细小病毒。在病毒的分离培养过程中,比较了细胞培养维持液中牛血清成份对病毒增殖的影响,发现含2％胎牛血清的细胞维持液对犬细小病毒的生长有抑制作用。采用无牛血清的细胞培养维持液,则有利于犬细小病毒的增殖。建议采用无牛血清细胞维持流培养犬细小病毒,以利提高犬细小病毒的产率。     

2009年重庆地区手足口病病毒分离鉴定

目的:对2009年2～4月重庆地区流行的手足口病(Hand-food-and-mouth disease,HFMD)病原进行分离鉴定,以调查本地区HFMD流行病原学情况.方法:采集47例手足口患儿脑脊液、疱疹液、粪便、咽拭子、肛拭子共100份标本,分别接种于人横纹肌肉瘤细胞(Human rhabdomyosarcoma,RD)中进行病毒分离培养,对出现细胞病变(Cytopathic effect,CPE)的细胞上清,分别用肠道病毒通用引物、EV71属特异性引物和柯萨奇A16属特异性引物进行RT-PCR检测,并对PCR产物进行回收克隆测序鉴定,以确定本次疫情中肠道病毒(Enteroviruses,EV)的病原,将测序结果用生物学软件Bioedit同国际代表BrCr株进行序列比对及同源性相关分析,以鉴定此毒株遗传变异情况.结果:在处理后的100份HFMD患儿临床标本的细胞培养中,有7份观察到明显的细胞病变,通过RT-PCR检测有7份呈肠道通用引物阳性,EV71特异性引物检测有3份呈阳性结果,而CAl6特异性引物检测结果均为阴性,这3份EV71阳性临床标本来自2例门诊患儿和1例临床诊断疑似病例患儿,其PCR产物测序结果也证实为EV71病毒.结论:重庆地区2～4月发生的HFMD疫情主要是由EV71型引起的.     

狂犬病及其病毒

目的：分析狂犬病病毒的结构及狂犬病发病特点和危害性，提出预防对策。方法：狂犬病现况分析研究法。结果：狂犬病是由狂犬病毒所致，对人类危害极大。对带病毒犬咬伤者，除应急做伤口处理，还须在72h内注射抗狂犬病毒疫苗，接种越早，预防效果愈好。结论：人狂犬恙病迄今为止尚无特效疗法。但是，应用基因工程研制的无毒口服疫苗可望成为人畜共患狂犬病新的换代产品，使狂犬病早日消灭。     

感冒病人病毒的分离和鉴定

感冒是引起慢性支气管炎复发的重要原因。感冒病原的种类颇多,但主要是病毒。因此,找出引起感冒的主要病毒种类,对感冒、慢性支气管炎的防治有着重大意义。 1972.3～1973.2,我们曾对92例成年感冒病人进行病毒分离,并作了初步鉴定。现将病毒分离和鉴定情况汇报于后。     

小鼠SRS腹水瘤病毒分离及其鉴定

用分子筛凝胶(Sepharose 2B)柱层析法,分别从小鼠SRS腹水上清液和瘤细胞中分离提取了SRS腹水瘤病毒(SRSV)。经电子显微镜观察表明,腹水上清液中的SRSV属于C型,瘤细胞中的SRSV主要属于A型。利用病毒内源性反应,对分离提取的SRSV进行了分析鉴定。首先用非离子去垢剂对病毒进行破壳处理,反应需要四种脱氧核苷三磷酸作底物,二价阳离子(Mg~(2 ),Mn~(2 ))作为酶的激活剂,而Ca~(2 )却无作用。一价阳离子有一定促进作用。核糖核酸酶(RNase)对反应有明显的抑制作用,而脱氧核糖核酸酶(DNase)则无抑制作用;低浓度放线菌素D对反应无明显抑制作用,高浓度则有部分抑制作用。实验结果证明从腹水上清液和瘤细胞中所分离提取的SRSV属RNA肿瘤病毒。     

树枝状角膜炎的病毒分离与鉴定

微生物学教研室病毒学科研小组与附二院眼科合作,从临床上确诊为树枝状角膜炎病人的眼分泌液中分离出病毒3株,其中2株在细胞培养上观察其细胞病变特征、包涵体性状和理化因素抵抗力试验(对酸和乙醚均敏感)。对5-碘脱氧尿嘧啶核甙(疱疹净)敏感,接种成年小白鼠脑内能引起典型症状,     

全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备与鉴定

目的:利用人源IgM转基因小鼠制备全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体,并对其进行初步鉴定?方法:以灭活的狂犬病病毒CTN株作为抗原免疫人IgM转基因小鼠?采用杂交瘤技术结合酶联免疫吸附试验(ELISA)高通量交叉筛选技术(HTS)制备全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体?通过双抗体夹心ELISA鉴定单抗的人源性和抗体型,间接ELISA?斑点杂交(Dot Blot)实验及Western blot检测单抗的特异性,BiaCore X-100测定单抗结合抗原的亲和力?结果:建立了2株稳定分泌抗狂犬病病毒人源性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为9E3和9F2?双抗体夹心ELISA结果显示2株单抗均为人源性免疫球蛋白IgM型?间接ELISA?斑点杂交实验结果表明2株单抗均能特异性识别灭活的狂犬病病毒CTN株?Western blot结果显示2株单抗均能与狂犬病病毒糖蛋白特异性结合?2株单抗与狂犬病病毒CTN株抗原结合的亲和力分别为 2.62 × 10-10 mol/L?4.06 × 10-11 mol/L?结论:筛选制备了2株特异性?高亲和力的全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体?本研究为进一步筛选人源抗狂犬病病毒免疫预防性中和抗体及其免疫治疗的应用奠定了基础?     

重庆地区2009年手足口病病原分离鉴定及病毒基因组特征

目的 对2009年重庆市手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)患儿粪便标本的病原进行分离鉴定及全基因组序列测定,并同相关毒株序列进行同源性比对和进化分析,以了解新分离病毒基因组序列特征及可能的传播来源.方法 将47例手足口病患儿临床标本接种人横纹肌肉瘤细胞(human rhabdomyosarcoma,RD)进行分离培养,采用EV、EV71、Cox A16特异性引物对出现细胞病变的细胞上清进行PCR鉴定,同时电镜观察病毒颗粒形态,将鉴定的病毒基因组分为4个片段进行RT-PCR扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析,绘制进化树.结果 在47例HFMD患儿临床标本接种RD细胞培养中,有7份观察到明显的细胞病变,通过RT-PCR检测有3份呈EV特异性引物及EV71特异性引物阳性,而所有标本Cox A16特异性引物检测为阴性,EV71特异性引物的PCR产物测序结果证实为EV71病毒,同时用电镜观察形态病毒感染的RD细胞,为圆形无包膜病毒颗粒,证实所分离病毒为EV71.测序获得的3株EV71病毒基因组全长分别为7 409、7 406 nt和7 404 nt,其VP1氨基酸序列同源性达99%以上.Blast分析表明重庆毒株Chongqing-2-09-China(GQ994990.1)、Chongqing-3-09-China (GQ994991.1)均与安徽阜阳2008年分离的3株EV71毒株同源性较高,重庆毒株Chongqing1-09-China (GQ994989.1)与2005年台湾分离984 polyprotein、1235 polyprotein序列毒株同源性最高,进化分析表明属于C4基因亚型.结论 新分离的重庆EV71毒株基因组序列符合肠道病毒特征,与国内2008年安徽阜阳及台湾2005年分离的EV71病毒可能具有相同来源.     

喀什0507JS32病毒的分离鉴定

2005年7～8月，在喀什地区采集蚊虫进行病毒分离，从当地居民家畜圈采集的一组库蚊分离到0507JS32病毒，该病毒对C6／36细胞致病变，而对Vero细胞不致病变。电镜观察显示，完整病毒颗粒呈球形，直径55nm，无包膜，衣壳表面壳粒结构明显。基因组核酸电泳显示基因组为12节段双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）。利用辽宁病毒（Liaoning virus，LNV）第12基因片段特异性引物对病毒RNA进行RT-PCR扩增，PCR产物进行序列测定，所得核酸序列进行BLAST比较，结果显示，与LNV病毒第12基因片段核酸序列同源性大于89％，证实该病毒为LNV病毒。     

麻痹型狂犬病1例报告(附病理检查分析)

病历摘要女,5岁,东莞县人,农民之女。因发热10天,双下肢无力3天,于1985年6月12日下午被某医院诊为混合型脊髓灰质炎转来本院。10天前无诱因出现畏寒、发热(高达40℃),伴咳嗽,无痰,无鼻塞流涕,无胸痛气促。曾在当地卫生院诊治,效果欠佳。出现噁心、呕吐多次,吐出未消化食物,自觉头晕,食欲下降。继用青霉素、氯霉素、激素、维生素及补液治疗,症状无缓解。近3天来双下肢无力,不能站立及起坐,轻触四肢即感疼痛,亦不愿别人抱或背。起病以来未解大便,尿量较少。既往史:一个月前被一小狗咬伤左手背,局部有少许流血,未作消毒处理,被咬后在腹部皮下注射一周据称为狂犬疫苗针剂。流行病学史:当地年前有狂犬病病人。已多次服食“小儿麻痹”预防糖丸。有污水接触史。4月已注射乙脑预防针。已患麻疹及水痘。体格检查:体温39.5℃,脉搏120次,呼吸22次,     

狂犬病病毒研究近况

狂犬病病毒(Rabies virus)为弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒属(Lyssavirus)的典型种。在1881年由巴斯德(Pasteur)的同事Emile Roux首次分离;对于病毒的显微镜特点及其在脑组织连续传代的培养也已由Pasteur及其同事于1882年进行了研究。早期的研究进展缓慢。由于免疫学和病毒学、细胞培养技术和血清学的研究不断进     

狂犬病发病机理与病理

狂犬病毒对神经组织有强大的亲合力。通过对感染固定狂犬病毒的动物进行神经切断术和神经节段实验的观察,证实了狂犬病毒循神经运动。当病毒进入神经时,绞状肌的肌梭和运动终板会因此受累,病毒一旦进入神经轴突,就做向心运转,在受     

全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定

目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性?方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库?以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性?结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0 × 107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv?经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体?经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg?结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础?