猪滑膜源性MSCs体外多向分化潜能的研究

目的 体外分离培养猪滑膜源性MSCs(synovium-derived MSCs,SMSCs),探讨其在体外多向分化潜能.方法 2月龄长枫杂交猪3头,雌雄不限,体重8～10kg.取猪膝关节滑膜组织分离SMSCs并行原代及传代培养,待第3代SMSCs长满培养皿后,吸去基础培养液,分别加入特定培养液进行成软骨、成骨、成脂诱导分化,作为实验组;以基础培养液培养作为对照组.成软骨诱导21 d后行甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色和实时荧光定量PCR检测;成骨诱导10 d后行ALP染色检测,21 d后行茜素红染色检测;成脂诱导21 d后行油红O染色检测.结果 SMSCs培养24 h后细胞形态细长或呈多角形;48 h后细胞数量增多;72 h后可见大量纺锤形细胞,其间散在分布少许小圆形细胞.实验组成软骨诱导21 d后甲苯胺蓝染色早阳性,细胞外有蛋白多糖(Aggrecan)形成;免疫组织化学染色示特异软骨基质ColⅡ表达;实时荧光定量PCR检测示Col Ⅱ A1、Aggrecan、SOX9 mRNA表达量与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).成骨诱导10 d后ALP染色阳性,21d后茜素红染色阳性,有钙结节形成.成脂诱导21 d后油红O染色示细胞内有脂滴形成.对照组除ALP染色观察呈弱阳性外,余染色均呈阴性.结论 猪膝关节滑膜组织可分离获取SMSCs,其在体外具有向成软骨、成骨、成脂多向分化潜能,有望成为组织工程种子细胞来源.     

膝骨关节炎滑膜间充质干细胞多向分化及免疫抑制能力

目的观察骨关节炎(OA)患者膝关节滑膜来源的间充质干细胞(SMSCs)多向分化能力以及免疫抑制能力。方法无菌环境下通过关节镜取出中山大学孙逸仙纪念医院10例OA患者膝关节滑膜组织,分离培养出SMSCs,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,通过成骨、成软骨和成脂肪诱导分化培养基对SMSCs诱导分化,于诱导第21天分别行茜素红、甲苯胺蓝和油红O染色。将SMSCs和CD3、CD28抗体刺激后的人外周血单核细胞(PBMC)进行共培养,通过流式细胞术对PBMC的增殖率进行检测,组间比较通过方差分析总体差异后再通过Bonferroni法进行组间两两比较。结果OA患者SMSCs第3天开始进入对数增长期,第7天细胞增殖进入平台期。SMSCs经过成骨、成软骨和成脂肪诱导分化后,茜素红、甲苯胺蓝和油红O染色均为阳性。SMSCs和CD3、CD28抗体刺激后的PBMC进行共培养5 d后,阴性对照组PBMC增殖率为(3.8±0.4)%,几乎不增殖,阳性对照组PBMC增殖率为(80.9±8.1)%,实验组PBMC的增殖率为(52.3±5.1)%,实验组与阳性对照组的差异具有统计学意义(t=8.97,P0.01)。结论 OA患者SMSCs同样具有多向分化能力和免疫抑制能力,可作为组织工程理想的种子细胞来源。     

CD105+滑膜间充质干细胞成软骨能力

目的 分选CD105+滑膜间充质干细胞(SMSCs),观察其增殖和向软骨细胞分化的能力.方法 酶消化滑膜组织分离SMSCs,流式细胞仪分选CD105+ SMSCs;第3、7天采用WST-1测定SMSCs的增殖能力;软骨诱导21 d进行免疫组织化学染色,检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原.结果 酶消化获取的SMSCs为星形或梭形,分选后SMSCs形态无明显变化.免疫荧光显示分选组CD105+细胞较未分选组明显增多.WST-1增殖检测提示两组细胞吸光度值3 d(0.376±0.012、0.329±0.012)、7 d(0.581±0.009、0.524±0.007)比较差异有统计学意义(P＜0.05).成软骨诱导培养21 d后,分选组甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原染色均较未分选组多且深,说明CD105+ SMSCs合成更多软骨细胞外基质.结论 CD105+ SMSCs具有较强的增殖和成软骨能力,CD105+ SMSCs可成为软骨组织工程良好的种子细胞.     

脂肪基质干细胞培养及其定向分化为成骨细胞、软骨细胞特性的研究

目的研究脂肪基质干细胞（adipose—derived stem cells，ADSCs）分离培养的方法，探讨大鼠ADSCs在体外向成骨细胞、软骨细胞分化的能力。方法从成年SD大鼠腹股沟处无菌获取脂肪组织，胶原酶消化分离，培养出ADSCs。基础培养基传至第二代时改换诱导培养基，分别诱导向成骨、软骨细胞分化，培养2～4周，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Vonkossa染色鉴定向成骨细胞分化能力；阿新蓝染色鉴定向软骨细胞分化能力。RT—PCR检测成骨细胞、软骨细胞标志基因。结果大鼠脂肪能够分离培养出生长旺盛的ADSCs；向成骨细胞诱导，ALP、Vonkossa染色阳性，RT—PCR检测有ALP、Osteocalcin及Osteopontin表达；向软骨细胞诱导，阿新蓝染色阳性，RT—PCR检测有Ⅱ型胶原、X型胶原和Aggreean表达。结论大鼠脂肪组织可以分离培养出ADSCs，生物学特性与骨髓基质干细胞（mesenchymal stemcells，MSCs）相似，能够向成骨细胞、软骨细胞分化，有希望成为组织工程理想的种子细胞来源。     

滑膜间充质干细胞体内外成骨特性的实验研究

目的探讨大鼠滑膜间充质干细胞(synovium-derived mesenchymal stem cells,SMSCs)生物学特性及诱导成骨的可行性,评估SMSCs复合羟基磷灰石/壳聚糖/聚乳酸(hydroxylapatite/chitosan/poly L-latic acid,HA/CS/PLLA)支架材料在体内异位成骨能力。方法采用酶消化法和贴壁法分离培养SMSCs,并利用流式细胞仪检测细胞表型,SMSCs成脂及成骨诱导后分别行油红O染色、ALP染色和茜素红染色鉴定。取第3代SMSCs,成骨诱导1、7、14、21、28 d后,采用实时荧光定量PCR检测骨钙素(osteocalcin,OCN)、Ⅰ型胶原、ALP以及Runx-2m RNA表达情况;成骨诱导后1、3、5、7、9、11 d,采用ELISA法检测ALP活性;成骨诱导后7、14、21、28 d,采用茜素红S法检测钙盐沉积;以正常培养SMSCs作为对照组。体内实验:取SD大鼠24只,随机分为实验组和对照组(n=12);取第3代SMSCs接种于HA/CS/PLLA支架材料,体外复合培养72 h后植入实验组大鼠右下肢肌袋,对照组大鼠植入单纯HA/CS/PLLA支架材料;术后4、8周通过X线片及组织学观察分析SMSCs体内成骨情况。结果提纯后SMSCs CD147、CD90、CD105、CD44表达超过95%,而CD117、CD34、CD14、CD45表达低于10%;油红O染色可见红色脂滴形成,茜素红染色可见红色钙化灶,ALP染色可见细胞质呈咖啡样深染。实时荧光定量PCR检测示,SMSCs成骨诱导7 d,Ⅰ型胶原、ALP、Runx-2 m RNA表达显著增加,诱导14 d OCN m RNA表达显著增加。成骨诱导后5、7、9、11 d ALP活性明显高于对照组,7 d时达峰值(P0.05)。成骨诱导14 d,钙含量显著增加,且随诱导时间延长钙含量逐渐增加(P0.05),且均高于对照组(P0.05)。体内实验术后4、8周影像学和组织学观测结果显示,两组均可见新生骨形成,但实验组成骨量明显多于对照组(P0.05)。结论 SMSCs在体内、体外均可诱导成骨,可成为骨组织工程的种子细胞。     

胰岛素样生长因子-1基因转染脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的研究

目的 观察胰岛素样生长因子(IGF)-1基因转染的脂肪间充质干细胞(ADSCs)向软骨细胞分化的效果.方法 原代培养兔ADSCs,免疫荧光法检测细胞表面抗原CD44、CIM9;脂质体介导人IGF-1基因转染兔ADSCs联合低浓度血清培养基向软骨细胞分化诱导,RT-PCR及Western blot方法检测IGF-1的表达,MMT法绘制细胞增殖曲线、甲苯胺蓝染色软骨结节、免疫组织化学检测Ⅱ型胶原的表达.结果 脂肪间充质干细胞CD44、CD109表达阳性,基因转染后细胞IGF-1表达阳性,细胞增殖速度增快,出现软骨结节,Ⅱ型胶原表达增高.结论 从脂肪组织中能够分离出增殖旺盛的ADSCs,IGF-1在ADSCs内获得稳定表达,细胞增殖能力增强,促进其向软骨细胞分化.     

Adipose tissue is an ideal stem cell source for tissue reconstruction of bone，cartilage，and soft tissue defects

目的 验证人脂肪基质细胞是否具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化的能力,从而为骨、软骨、软组织再建寻找一种理想的干细胞来源.方法 分别用成骨向分化培养基（DMEM＋10?S＋地塞米松＋维生素C＋β-甘油磷酸）、软骨向分化培养基（DMEM＋1?S＋胰岛素＋维生素C＋转化生长因子β1）及脂肪向分化培养基（DMEM＋10?S＋地塞米松＋胰岛素＋吲哚美辛＋异丁基甲基黄嘌呤）诱导人脂肪基质细胞向成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞分化.用von Kossa和碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞分化,而软骨细胞分化和脂肪细胞分化分别用Alcian blue染色和油红O染色显示.成骨细胞、软骨细胞以及脂肪细胞特异相关或标志基因的表达用RT-PCR检测.结果 体外实验表明,人脂肪基质细胞在定向分化诱导剂的作用下可分别向成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞分化.结论 人脂肪基质细胞中包含有多向分化能力的干细胞,可用于今后骨、软骨、软组织的组织工程再建.     

犬骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

目的 体外诱导犬骨髓基质干细胞(BMSCs)定向分化为软骨细胞，探讨体外诱导成软骨的方法和条件。方法 自犬肋骨取骨髓2～3ml，体外行原代和传代培养扩增，顺序加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)，以培养瓶内较高细胞浓度培养，诱导BMSCs分化为软骨细胞。甲苯胺蓝、阿新蓝染色检测软骨基质的分泌，免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。结果 诱导的软骨样细胞甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性；Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性。结论 应用bFGF和TGF-β1体外可以诱导犬BMSCs分化为软骨细胞，诱导的软骨细胞可作为软骨组织工程较理想的种子细胞。     

人小涎腺成纤维样单克隆细胞的成骨分化

目的：探索人小涎腺成纤维样单克隆细胞的体外培养、扩增方法,鉴定其性质,研究向成骨细胞分化的潜能。方法：组织块贴壁法原代培养人小涎腺细胞,收集成纤维样细胞,用96孔板稀释铺板法克隆培养,免疫荧光和RT-PCR检测细胞表型,并进行成骨诱导分化,通过骨钙素、一型胶原免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶、茜素红钙结节染色鉴定成骨分化。结果：成功的在体外扩增培养出人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫荧光证实细胞表达CD13、CD29、CD106和CD44,RT-PCR显示CK18、α-SMA、vimentin、CD106、nestin基因表达与人骨髓间充质干细胞相似。成骨诱导8天后,碱性磷酸酶表达阳性率100%,19天后骨钙素和一型胶原大量表达,并形成钙结节。结论：所建立的分离培养体系能够获得大量人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫表型类似于间充质干细胞。在成骨诱导培养条件下具有良好的向成骨细胞分化的潜能。     

兔成骨细胞和脂肪细胞横向分化的研究

目的 探讨兔成骨细胞和脂肪细胞两者横向分化的能力和方法.方法 选取3个月龄新西兰大白兔,获取、分离培养脂肪细胞,天花板贴壁法使其去分化,去分化脂肪细胞进行成骨诱导3周后行茜素红、碱性磷酸酶(ALP)和Ⅰ型胶原酶免疫组织化学染色.另选取出生7d内的乳兔,取颅骨骨块利用酶消-组织块培养法培养成骨细胞并传代培养,对其进行成脂诱导3周后行油红O染色、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ) mRNA的表达.结果 提取的成熟脂肪细胞去分化后为长梭形成纤维细胞状;成骨诱导后,Ⅰ型胶原免疫组织化学染色显示实验组细胞内表达出Ⅰ型胶原,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);各组细胞第3天、第7天、第14天不同时段的ALP活性实验组较对照组高(P＜0.05),分别为0.165±0.007、0.253±0.005、0.345±0.007和0.067±0.004、0.076±0.006、0.082±0.003,且随着培养时间的延长实验组ALP活性逐渐增强(组内比较P＜0.05);提取的乳兔颅骨成骨细胞呈短梭形,成脂诱导3周后油红O染色阳性,PPARγmRNA表达阳性,对照组为阴性,实验组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成熟脂肪细胞可以通过体外培养实现去分化,脂肪细胞和成骨细胞在一定条件下可以相互转化.     

人滑膜间充质干细胞的分离培养与鉴定

背景：软骨一旦损伤将很难自我修复,组织工程学修复损伤软骨是目前的研究热点。组织工程学中找到合适的“种子细胞”至关重要。滑膜间充质干细胞（SMSCs）因较其他来源的间充质干细胞成软骨能力、增殖能力更强,且细胞容易获取、对机体损伤小等优点,越来越受到研究者的青睐。 目的：探讨人SMSCs体外分离、培养的方法与步骤,探索对SMSCs进行鉴定的最新方法。 方法：关节镜下获取11例行关节镜手术患者的滑膜组织,按照Pei等[6]的方法分离培养滑膜干细胞;从细胞形态学观察、细胞生长曲线分析、CCK-8测定增殖活力、流式细胞仪检测细胞周期和细胞表面抗原、对SMSCs进行成脂/成骨/成软骨诱导、免疫细胞荧光染色以及RT-PCR检测成脂/成骨/成软骨相关基因的表达等方面对SMSCs进行鉴定。 结果与结论：按照Pei等的方法可以成功地从人滑膜组织中分离出干细胞,分离出的干细胞具有间充质干细胞特异性表型和多向分化潜能。     

Monolayer cultures of normal human bone cells contain multiple subpopulations of alkaline phosphatase positive cells

Summary Cytochemical staining of normal human bone cells in monolayer cultures for alkaline phosphatase (ALP) indicated that the cultures contained mixed-cell populations. Time course evaluations of the cytochemical staining revealed, in addition to the ALP-negative cell population, at least two subpopulations of ALP-positive human bone cells with different levels of ALP. A cytochemical method has been developed which separates the ALP-positive cells into high and intermediate ALP subpopulations. In this method, human bone cells were stained for ALP using an azo-dye method and incubating at 4°C for 10 and 30 minutes, respectively. We defined the cell population that stained positively for ALP at 10 minutes as strong ALP-positive cells, and both strong and intermediate cells were stained at 30 minutes. The intermediate cells were determined from the difference between the values at the two time points. The intra- and interassay variations of the assay, with the same investigator in blinded investigations, were both less than 10% and the interobserver variation was approximately 25%. Analysis of the distribution of ALP levels in cells with a laser densitometer confirmed the presence of at least three cell subpopulations. 1,25(OH)₂D₃ treatment increased the proportions of both ALP-positive cell populations, whereas TGF-beta treatment increased only the intermediate ALP-positive cell population. On the contrary, fluoride increased the proportion of the strong ALP cells, and IGF-1 had no effect on the proportions of either ALP-positive subpopulation. When the ALP-specific activity was compared with the percentage of each ALP-positive subpopulations for the cells treated with effectors, the ALP-specific activity correlated with the total ALP-positive and with the strong ALP-positive populations but not with the intermediate ALP-positive subpopulation. In summary, this study represents the first evidence that normal human bone cells in monolayer cultures contained at least two subpopulations of ALP-positive cells, and that bone cell effectors could have differential effects on each cell population.     

Isolation and characterization of connective tissue progenitor cells derived from human fracture‐induced hemarthrosis in vitro

In our search for alternative sources of connective tissue progenitor cells that can be obtained with minimal invasion, we studied human intraarticular fracture‐induced hemarthrosis of the knee and attempted to isolate connective tissue progenitors from the hemarthrosis. Hemarthrosis was aspirated from the knee joints of 13 patients suffering from intraarticular osteochondral fractures of the knee. Mononuclear cells were isolated from the aspirated hemarthrosis by density gradient separation, and cultured. We were able to obtain fibroblastic adherent cells from the mononuclear cell fractions. Flow cytometry analysis after in vitro expansion on tissue culture plastic revealed that the fibroblastic cells were positive for CD29, CD44, CD105, and CD166, and negative for CD14, CD34, CD45, and CD133. These cells could differentiate in vitro into osteogenic, chondrogenic, and adipogenic cells in the presence of lineage‐specific induction factors. These results demonstrate that human intraarticular fracture‐induced knee hemarthrosis contains connective tissue progenitor cells with morphologic features, immunophenotypic markers, and differentiation potential that are similar to bone marrow stromal cells. This suggests that hemarthrosis, which is easy to harvest without unnecessary invasion to the patient, has possible future clinical applications such as in tissue‐engineered therapies for severe osteochondral defects, posttraumatic osteoarthritis, and delayed fracture unions or nonunions. © 2007 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 26:190–199, 2008     

脐血间充质干细胞的分离培养鉴定及诱导分化研究

目的：分离培养人脐血间充质干细胞（human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,hUCB-MSC）,体外观察其生长特性,并在特定条件下诱导分化,探讨其成脂成骨分化能力.方法：采用沉降法和密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,倒置显微镜下观察其形态及生长情况;流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞表面标志物;用茜素红染色和油红0染色分别鉴定其成骨成脂分化能力.结果：纯化的hUCB-MSC贴壁生长,呈均一梭形,具有较强的增值能力,流式细胞仪分析P3代hUCB-MSC稳定表达间充质干细胞表面抗原标志CD73,CD105和CD90等,不表达造血标志CD34和CD45;成骨诱导后3周后细胞茜素红染色阳性;成脂诱导3周后细胞油红0染色阳性.结论：本实验分离的hUCB-MSC具有较强的增殖能力,表达间充质干细胞的表面标记,具有成骨成脂分化潜能.     

人羊水来源c-kit~+间充质干细胞的生物学特征和心肌诱导分化

目的探讨人羊水来源c-kit~+间充质干细胞(c-kit~+human amniotic fluid-derived mesenchymal stemcells,c-kit~+HAFMSCs)的生物学特征及心肌诱导分化能力。方法通过产前诊断或自愿引产获取50份孕中期羊水标本,经流式细胞仪分选c-kit~+HAFMSCs,MTT法观察细胞增殖情况,并通过流式细胞仪、细胞免疫化学染色观察行细胞表型鉴定。在体外经成骨及成脂诱导分化,于诱导培养后21 d采用yon Kossa染色观察钙沉积颗粒,油红O染色观察脂滴形成情况。实时荧光定量PCR检测细胞经5氮-2’脱氧胞苷心肌诱导前后,NKx2.5、Tbx5、GATA-4、α-MHC 4种心肌特异性基因表达情况。结果经流式细胞仪分选,人孕中期羊水中c-kit~+HAFMSCs含量约为贴壁细胞的3.07%±1.03%;体外增殖迅速,表达MSCs表面标志CD29、CD44、CD73、CD90、CD105,不表达造血干细胞表面标志CD34、CD45;农达人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-ABC,不表达HLA-DR。细胞免疫化学染色示CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、Oct-4染色呈阳性,CD34、CD45染色呈阴性。MTT检测示第5、10、15代c-kit~+HAFMSCs具有相似的生长曲线。成骨和成脂诱导培养后21 d,细胞内有钙盐沉积和脂滴形成。实时荧光定量PCR检测示,心肌诱导后14 d,NKx2.5、Tbx5、GATA-4、α-MHC 4种心肌特异性基因表达均较诱导前明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论通过流式细胞仪分选的c-kit~+HAFMSCs在体外可以诱导分化为心肌样细胞,可能成为心肌再生性治疗的种子细胞。     

Evaluation of ghrelin as a distinguishing marker for human articular cartilage-derived chondrocytes and chondroprogenitors

Purpose of the studyCell-based therapeutics for articular cartilage repair primarily employed bone marrow-derived mesenchymal stem cells and chondrocytes. Research to overcome their limitation of formation of a functionally poor fibro-hyaline type of repair tissue led to the discovery of chondroprogenitors (CPCs), cartilage resident stem cells. These cells isolated by adhesion assay using fibronectin (FAA-CPs) and migration of progenitors from explants (MCPs) display higher chondrogenic and lower terminal differentiation potential. During in-vitro culture, chondrocytes tend to de-differentiate and acquire characteristics similar to stem cells, thus making it challenging to distinguish them from other cell groups. Ghrelin, a cytoplasmic growth hormone secretagogue, has been proposed to play a vital role in chondrogenesis, with reports of its higher expression in chondrocytes than BM-MSCs. The aim of this study was to compare the mRNA expression of Ghrelin between BM-MSCs, chondrocytes, FAA-CPs and MCP and the possibility of it serving as a distinguishing marker.MethodsThe four populations isolated from three human osteoarthritic knee joints were characterised by CD marker expression for positive (CD 90, CD73 and CD105) and negative (HLA-DR, CD34 and CD45) MSC markers and trilineage differentiation (adipogenic, osteogenic and chondrogenic) and subjected to qRT-PCR to assess Ghrelin's gene expression.ResultsThis study showed that all groups exhibited similar expression of CD markers and multilineage potential. Though chondrocytes showed greater expression of Ghrelin, it was not statistically significant to classify it as a distinguishing marker between these cell populations.ConclusionGhrelin does not serve to differentiate the subpopulations in terms of their mRNA expression. Further evaluation using their associated enzymes and receptors could provide valuable information to uncover their potential as unequivocal biomarkers.     

人真皮微淋巴管内皮细胞的分离培养和鉴定

目的建立人真皮来源淋巴管内皮细胞(LECs)分离和培养的方法。方法采用中性蛋白酶及胶原酶消化方法结合免疫磁珠从真皮组织分选CD34-/CD31 细胞。免疫细胞化学、免疫荧光及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测LECs特异标志的表达,噻唑蓝(MTT)比色试验测定多种与内皮细胞增殖相关的细胞因子和低氧条件对其增殖的影响。结果CD34-/CD31 细胞在单层细胞培养时形成内皮细胞典型的铺路石样外观,而在胶原凝胶三维培养时形成管状结构。CD34-/CD31 细胞表达淋巴管内皮细胞特异性标志,包括LYVE-1,VEGFR-3和Prox-1。RT- PCR显示Proxl和VEGFR-3 mRNA在CD34-/CD31 细胞中特异性表达。特异作用于淋巴管内皮细胞的VEGF-C对LECs的促增殖作用明显(P<0.01)。低氧条件和Ang2在体外未显示对LECs有促进增殖的作用。结论应用中性蛋白酶及胶原酶消化方法结合免疫磁珠分选可以成功分离获取人真皮LECs。     

体外利用慢病毒介导BMP-2基因诱导兔滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化

目的使用慢病毒介导兔BMP-2基因转染兔滑膜间充质于细胞（SMSCs）,检测其安全性,并在体外定向诱导至软骨细胞。方法通过构建包含BMP-2基因的慢病毒载体,转染SMSCs后行安全性分析;各项检测和MicroRNA分析判断转染后的SMSCs是否进入软骨细胞分化谱系。结果贴块法获得的SMSCs在经分离纯化后,表现出间充质干细胞应有的结构和表面标志物,具有多向分化潜能。增殖动力学、核型分析、致瘤型分析等证实被慢病毒转染的SMSCs安全。Westernblot、免疫荧光等证实且能稳定表达BMP-2蛋白。14d后,免疫组化、MicroRNA检测等证实在不需外加外源性BMP-2的体外环境下SMSCs可自发向软骨细胞分化。结论经重组慢病毒载体感染的兔SMSCs足够安全,能稳定表达BMP-2,体外能自发向软骨细胞分化。     

Kartogenin与TGF-β3/BMP-2/DEX对兔滑膜间充质干细胞增殖及成软骨分化的对比研究

目的：比较Kartogenin（KGN）与转化生长因子β3（TGF?β3）/骨形态发生蛋白2（BMP?2）/地塞米松（DEX）对兔滑膜间充质干细胞（synovial?derived mesenchymal stem cells, SMSCs）增殖及成软骨分化的作用。方法于6~10月龄新西兰大白兔膝关节处滑膜中分离培养SMSCs,并进行鉴定。设置KGN组（采用KGN干预）、T/B/D组（TGF?β3/BMP?2/DEX联合干预）及空白对照组,采用PELLET系统培养法分别培养各组细胞。通过比较各组细胞的增殖速度、软骨微球的直径和重量、Ⅱ型胶原（Col?Ⅱ）表达情况、成软骨分化相关标志基因表达及蛋白质合成量等指标来评价KGN对SMSCs增殖及成软骨能力的影响。结果成功从兔膝关节滑膜分离出SMSCs;KGN组的SMSCs增殖能力弱于T/B/D组,但KGN组软骨微球直径最大,重量最重,Ⅱ型胶原合成量最多,且均显著高于其他组;PCR及Western Blot结果表明KGN组成软骨分化相关基因的表达最强,蛋白质合成量最多。结论 KGN不能明显增强SMSCs的增殖能力,但对SMSCs的成软骨分化能力强于TGF?β3/BMP?2/DEX,将来可能应用于修复软骨损伤。