载体介导的RNA i技术对HL-60细胞端粒酶逆转录酶基因表达和细胞增殖的影响

目的探讨由载体介导的靶向端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA i技术对人类髓系白血病HL-60细胞hTERT基因表达和细胞增殖的影响。方法用表达针对hTERT基因siRNA的质粒载体转染HL-60细胞,以转染后24、72、120 h细胞组作为3个实验组,以空质粒组、转染试剂组及空白对照组作为3个对照组,RT-PCR法检测HL-60细胞hTERT基因mRNA的表达,MTT法检测HL-60细胞增殖活性。结果转染后24、72、120 h组HL-60细胞hTERT基因mRNA相对表达水平分别为0.31±0.08、0.28±0.05、0.32±0.06,质粒组、转染试剂组、空白对照组分别为0.55±0.13、0.49±0.08、0.58±0.19,3个实验组HL-60细胞hTERT mRNA表达水平低于3个对照组,差异有显著性(P<0.05),3个实验组组间比较差异无显著性(P>0.05),3个对照组间表达水平比较差异无显著性(P>0.05);24、72、120 h实验组细胞增殖活性抑制率分别为(23.7±4.0)%、(35.1±5.9)%、(29.6±3.8)%,质粒组分别为(3.7±0.8)%、(2.1±0.5)%、(2.7±0.9)%,转染试剂组分别为(4.0±1.8)%、(2.6±1.3)%、(2.2±1.1)%,空白对照组均为0,3个实验组HL-60细胞增殖活性抑制率明显高于各对照组,差异有显著性(P<0.05),3个实验组及组间比较差异无显著性(P>0.05),3个对照组组间比较差异无显著性(P>0.05)。结论载体介导的靶向hTERT基因的RNA i技术能在体外抑制HL-60细胞hTERT基因的表达,细胞增殖活性受抑制。     

Prohibitin基因转染对肾小管上皮细胞表型转化的影响

目的探讨转染外源性Prohibitin(PHB)基因对体外培养的肾小管上皮细胞株(NRK-52E)表型转化的影响。方法将构建的pcDNA3.1(+)-PHB1、pcDNA3.1(+)-PHB2质粒转染体外培养的NRK-52E细胞作为转染组,以空载体转染NRK-52E细胞为阴性对照组,以正常NRK-52E细胞为空白对照组,分别应用实时荧光定量PCR和Western blot检测转染24 h、48 h、72 h各组NRK-52E细胞PHB1、PHB2及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA及蛋白表达。结果 1.转染24 h、48 h、72 h时转染组NRK-52E细胞的PHB1、PHB2 mRNA及其蛋白表达均较阴性对照组和空白对照组增高(Pa<0.05),且48 h表达量最高,而阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义。2.转染24 h、48 h、72 h时转染组NRK-52E细胞α-SMA mRNA和蛋白表达均较阴性对照组和空白对照组降低(Pa<0.05),48 h表达量最低,阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义。3.转染组48 h NRK-52E细胞PHB1、PHB2蛋白表达量与α-SMA蛋白表达量均呈负相关(r=-0.942、-0.869,Pa<0.05)。结论转染外源性PHB基因可以抑制体外培养的NRK-52E细胞的表型转化。     

mir-34a模拟物转染人脑胶质瘤细胞U87对Dll1基因表达的影响

目的 观察mir-34a对人脑胶质瘤细胞U87中Dll1基因和蛋白表达水平的影响,探讨Dll1是否为mir-34a的靶基因.方法 将人脑胶质瘤U87细胞分为mir-34a模拟物组、阴性对照组、脂质体组和空白对照组,根据人源mir-34a序列,设计并合成其双链模拟物(mir-34a mimics).将mir-34a mimics以脂质体Lipofectamine 2000包裹,并转染至人脑胶质瘤细胞U87中,转染后48 h采用实时荧光定量PCR方法检测细胞内Dll1基因mRNA表达水平,Western blot技术检测细胞内Dll1蛋白表达水平.实验数据采用单因素方差分析和t检验进行统计学分析.结果 转染后48 h模拟物组、阴性对照组、脂质体组和空白对照组细胞内Dll1基因 mRNA 相对表达水平分别为1.26±0.09、1.29±0.03、1.10±0.12和1.39±0.08;转染后48 h模拟物组、阴性对照组、脂质体组和空白对照组细胞内Dll1蛋白相对表达水平分别为0.011 34±0.041 90、0.628 09±0.035 00、0.913 28±0.036 20和0.868 60±0.039 00.模拟物组Dll1蛋白表达水平均明显低于阴性对照组、脂质体组和空白对照组(Pa＜0.05);而模拟物组Dll1的mRNA表达水平与其他3组比较差异均无统计学意义(Pa＞0.05).结论 人脑胶质瘤细胞U87中,mir-34a可通过下调Dll1蛋白而非基因表达水平发挥该靶基因转录后翻译水平的负性调控作用.     

miRNA338调节人神经母细胞瘤细胞中CXCR4表达的研究

目的 微小RNA( microRNA,miRNA)是一类非编码小分子RNA组成的家族,能够通过降解靶mRNA或抑制其翻译过程参与调节基因表达.本研究旨在探索上调miR338水平后人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中CXCR4表达变化,进而了解miR338调节神经母细胞瘤侵袭与转移的分子机制.方法 将人工合成的成熟miR338前体(pre-mir-338)转染入SH-SY5Y细胞,而后利用实时荧光定量RT-PCR检测转染前后各组细胞miR338的表达水平.应用半定量RT-PCR及Western蛋白印迹法分别从mRNA水平、蛋白水平检测各实验组CXCR4的表达变化.结果 实时荧光定量PCR法检测对照组及各实验组细胞miR338基因含量,发现转染了pre-mir-338的10 nM,30 nM,50 nM,100 nM组miR338含量分别为空白对照组的1.32倍,1.62倍,1.90倍及1.86倍,差异具有统计学意义(P＜0.05),成功将pre-mir-338转染入细胞达到miR338过表达的目的；转染组(10 nM组、30 nM组、50nM组)CXCR4基因mRNA相对光密度值分别为0.75±0.06,0.58±0.08,0.24±0).05,依次降低,均明显低于空白对照组1.11±0.08,空载对照组1.04±0.08(P＜0.05).转染组CX-CR4蛋白0).24±0.06较未转染组0.56±0.08降低(P＜0.05).结论 miR338能够通过下调神经母细胞瘤细胞CXCR4 miRNA及蛋白的表达参与调节肿瘤的侵袭与转移,人工合成的pre-mir-338有望通过替代方式为神经母细胞瘤的治疗提供新的途径.     

丹参酮ⅡA对HL-60细胞人端粒酶反转录酶表达的影响

目的 研究丹参酮ⅡA(TanⅡA)对HL-60细胞的人端粒酶反转录酶(hTERT)表达的影响,探讨TanⅡ诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制.方法 用RPMI 1640培养HL-60细胞,培养24 h后分为3组[TanⅡA组、全反式维A酸(ATRA)组、对照组],分别加入500 μg·L-1TanⅡA、500 μg·L-1ATRA和0.1 mL·L-1二甲基亚砜治疗5d.加药前和加药后每天分别收集细胞,采用锥虫蓝染色后计数活细胞,流式细胞仪(FCM)检测HL-60细胞凋亡率,半定量RT-PCR法测定HL-60细胞hTERT相对表达水平.结果 与对照组比较,药物治疗2d后,TanⅡA组和ATRA组HL-60细胞的生长均明显受到抑制(Pa＜0.05),TanⅡA组和ATRA组的抑制作用比较差异无统计学意义(p＞0.05).TanⅡA组和ATRA组在药物治疗2d后细胞凋亡率分别为32.11％,23.31％,均明显高于对照组(6.08％)(Pa＜0.05),且细胞凋亡率逐日上升,而对照组细胞凋亡率无明显变化.药物处理1d后,TanⅡA组和ATRA组的HL-60细胞hTERT相对表达水平均明显低于对照组(Pa＜0.05),且表达水平逐日下降,而对照组表达水平无明显变化.结论 丹参酮ⅡA抑制HL-60细胞生长、诱导细胞凋亡可能与下调hTERT基因表达水平有关.     

EV71对人恶性胶质瘤细胞株U251抗瘤作用初步研究

目的 探讨EV71对人恶性胶质瘤细胞株U251的生长、凋亡和人端粒酶反转录酶(hTE RT)表达的影响.方法 采用RPMI 1640培养U251细胞,培养24 h后随机分为实验组和对照组,实验组按感染复数值为1加入EV71,并共培养72 h,对照组不加EV71.加入EV71后0h、24 h、48 h和72 h用倒置显微镜观察U251细胞形态和生长情况,流式细胞仪测定U251凋亡率,半定量RT-PCR检测hTERT的相对表达水平.结果 倒置显微镜观察发现,与对照组比较,实验组加入EV71后24 h,U251细胞生长明显受到抑制,48 h和72 h时U251细胞明显皱缩、变小、形态不规则,而对照组细胞则大小均匀.流式细胞仪检测发现,实验组加入EV71后24h、48 h和72 h,U251细胞的凋亡率均明显高于对照组[24 h:(12.55±2.38)％比(1.42±0.21)％,48 h:(65.60±8.48)％比(1.42±0.17)％,72 h:(87.52±3.05)％比(1.41±0.16)％,P均=0.000],且细胞凋亡率逐日升高,对照组细胞凋亡率无明显变化.实验组加入EV71后24h、48 h和72 h,U251细胞的hTERT相对表达水平均明显低于对照组[24 h:(0.58±0.05)比(0.89±0.05),48 h:(0.23±0.04)比(0.89 ±+0.03),72 h:(0.10±0.03)比(0.90±0.06),P均=0.000],且表达水平逐日下降,对照组表达水平无明显变化.结论 EV71能有效抑制U251细胞的生长,诱导细胞凋亡,具有潜在的抗瘤作用,其作用机制可能部分与下调U251细胞的hTERT表达有关.     

MEG3启动子甲基化在先天性巨结肠发病机制中的作用

目的探讨母系表达基因3(MEG3)启动子甲基化对p53/p21信号通路的调控及其在先天性巨结肠(HSCR)发病机制中的作用。方法检测30例HSCR患儿有神经节细胞段、无神经节细胞段p53 mRNA、蛋白表达和MEG3基因启动子甲基化情况。应用MEG3过表达和沉默质粒转染人神经母细胞瘤SK-N-BE(2)细胞株,建立MEG3过表达(MEG3-OE)组、MEG3抑制(MEG3-KD)组及空白对照(NC)组,使用氮杂胞苷(5-aza-CdR)调控各组后检测细胞株的增殖、凋亡情况及其p21 mRNA和蛋白的表达情况。结果①无神经节细胞段与有神经节细胞段肠管组织p53 mRNA的相对表达量分别为10.56±0.37和2.24±0.3,p53蛋白的相对表达量分别为1 058.5±106.9和583.6±87.6,MEG3启动子甲基化率分别为(58.3±4.5)%和(33.3±1.3)%,两组比较,差异均有统计学意义(t=95.67,P<0.05;t=18.82,P<0.05;χ2=6.25,P<0.05)。②加入氮杂胞苷共培养72 h时:MEG3-OE组较MEG3-KD组、NC组...     

短发夹RNA缄默survivin基因对Jurkat细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨survivin短发夹RNA (shRNA)表达质粒对白血病细胞株体外生长和凋亡的影响.方法 酶切法构建干扰survivin基因表达的重组质粒和阴性对照质粒,电击转染质粒入Jurkat细胞.实验分为未转染组、无功能shRNA组(阴性对照组)及重组质粒组.分别采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组织细胞化学染色法检测各组细胞中survivin mRNA、蛋白的表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定各组细胞的生长抑制率,流式细胞仪计数(FCM)测定各组细胞凋亡率.结果 DNA测序证实survivin短发夹RNA表达质粒和阴性对照质粒构建成功.重组质粒组与未转染组及无功能shRNA组比较,RT-PCR结果显示转染后重组质粒转染组survivin基因表达相对于未转染组及阴性对照组显著下降(Pа0.05);免疫组织细胞化学染色结果显示重组质粒转染组survivin蛋白表达相对于未转染组及阴性对照组显著下降;MTT显示重组质粒生长抑制率为(24.65±1.10)%,而未处理组为(2.04±0.16)%,阴性质粒组为(2.17±0.15)%;FCM结果示未转染组细胞凋亡率为(2.13±0.42)%,阴性质粒组凋亡率为(2.55±0.95)%,重组质粒转染组细胞凋亡率为(11.48±1.11)%.shRNA重组质粒介导的RNA干扰抑制survivin表达,抑制Jurkat细胞生长和促进其凋亡(P<0.05).结论 靶向为survivin基因的RNA干扰技术可为儿童白血病治疗提供新的手段.     

γ泌肽酶抑制剂对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Notch信号通路的影响

目的 探讨γ泌肽酶抑制剂在肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)与肺成纤维细胞(LF)共培养胎鼠模型中对Notch信号分子表达的影响.方法 应用Millipore插入式培养皿和Costar 6孔板构建AEC Ⅱ/LF共培养胎鼠模型.应用免疫组织化学法分别检测其细胞表面标志物表面活性蛋白C(SP-C)鉴定AEC Ⅱ、LF.锥虫蓝拒染实验检测AECⅡ、LF活力后将γ泌肽酶抑制剂加入最低必需培养基(MEM)(终质量浓度为0.2 g/L)作为实验组,未加入者为对照组.应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)在基因和蛋白水平检测二组在培养24、48、72、96 h AECⅡNotch受体、转录调节因子DNA结合蛋白(CBF-1)及转录因子分裂增强子(HES-1)表达.采用SPSS 11.5软件进行组间t检验和组内单因素方差分析.结果 原代培养AECⅡ纯度(94.7 ±1.9)%,细胞活力为(96.2 ±2.5)%;LF纯度(97.2±1.4)%,细胞活力为(98.5 ±2.6)%.实验组CBF-1 mRNA及CBF-1蛋白在24、48、72、96 h与对照组比较均无显著变化(Pa＞0.05),实验组Notchl mRNA在24、48、96 h,Notch3 mRNA在48、72、96 h较对照组均显著降低(Pa＜0.05),HES-1 mRNA及蛋白在各时间点均显著降低(Pa＜0.05,0.01).结论 γ泌肽酶抑制剂可部分阻断胎鼠AEC Ⅱ发育中的Notch信号通路传导,其机制可能通过非CBF-1依赖途径.     

bcl-2及fas基因表达的变化对细胞色素C诱导HL-60细胞凋亡的影响

目的观察bcl-2、fas基因表达的变化对细胞色素C诱导急性早幼粒白血病细胞株(HL-60细胞)凋亡的影响,探讨细胞色素C诱导HL-60细胞凋亡的机制。方法将体外培养的HL-60细胞分成六组,细胞色素C终浓度分别为0(对照组)、9.375mg/L、18.75mg/L、37.5mg/L、75mg/L、150mg/L,用流式细胞仪检测细胞色素C对HL-60细胞的凋亡效应,用RT-PCR、westernblotting检测以凋亡为主的HL-60细胞中bcl-2、fas的表达水平。结果流式细胞仪检测表明细胞色素C终浓度分别为0、9.38mg/L、18.75mg/L、37.50mg/L时HL-60细胞是以凋亡效应为主,bcl-2基因的mRNA和蛋白的表达随着细胞色素C浓度的增高而降低,fas基因的mRNA和蛋白的表达随着细胞色素C浓度的增高而增高,当细胞色素C浓度为75mg/L、150mg/L时HL-60细胞是以坏死效应为主。结论细胞色素C能够下调bcl-2 mRNA及其蛋白的表达,上调fas mRNA及其蛋白的表达,从而可以诱导HL-60细胞的凋亡。     

肿瘤坏死因子α、X-连锁凋亡抑制蛋白在特发性胎儿生长受限中的表达

目的 探讨特发性胎儿生长受限(IFGR)患儿母血和脐血TNF-α及胎盘组织中X-连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的表达及其意义.方法 选取郑州大学第三附属医院2010年7月-2011年7月行剖宫产分娩的IFGR孕妇34例作为实验组,同期因社会因素行剖宫产分娩的健康足月孕妇30例作为健康对照组.采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定2组母血、脐血TNF-α水平,免疫组织化学法检测2组胎盘组织中XIAP的表达.结果 1.实验组母血、脐血TNF-α水平[(90.12±6.43)μ·L-1,(98.73±7.29)μg·L-1]均明显高于健康对照组[(72.97±8.51)μg·L-1,(80.87±6.92)μg.L-1],差异均有统计学意义(Pa＜0.05).2.实验组XIAP在胎盘合体滋养细胞中的表达(114.56±5.17)明显低于健康对照组(144.40±7.31),差异有统计学意义(P＜0.05).3.实验组母血、脐血中TNF-α与胎盘组织中XIAP均呈负相关(Pa＜0.05);健康对照组母血、脐血中TNF-α与胎盘组织中XIAP均无相关性(Pa＞0.05).4.实验组母血、脐血中TNF-α与新生儿体质量均呈负相关(Pa＜0.05),健康对照组母血、脐血中TNF-α与新生儿体质量均无相关性(Pa＞0.05).5.实验组新生儿并发症显著高于健康对照组(P＜0.05).结论 母血、脐血中TNF-α升高及胎盘组织中XIAP表达降低,可能通过促进胎盘滋养细胞过度凋亡参与IFGR的发病,并影响新生儿预后.     

短链RNA抑制神经母细胞瘤MYCN基因表达诱发肿瘤细胞凋亡的研究

目的 探讨MYCN高扩增神经母细胞瘤肿瘤细胞中MYCN基因的表达改变对肿瘤细胞凋亡、增殖的影响.方法 采用RNA干扰抑制MYCN基因表达,荧光定量PCR法及Westernblot法检验基因表达受抑制情况;ELISA法检验肿瘤细胞凋亡情况,Western-blot法检验神经元特异性烯醇酶表达变化.结果 siRNA转染12 h、24 h MYCN mRNA表达,相对灰度值分别为0.53±0.10(对照组为1)、0.28±0.09(对照组为1.12±0.31),表达显著降低(P＜0.05);Western-blot结果显示转染12 h、24 h MYCN蛋白表达,相对灰度值分别为0.76±0.13,对照组为1.25±0.21、0.44±0.07,对照组为1.39±0.29,表达显著降低(P＜0.05);MYCN基因表达抑制后肿瘤细胞凋亡增加,抑制组DNA碎片值1.90±0.12,对照组1.13±0.09,P＜0.05;神经元特异性烯醇酶表达增高,抑制组相对灰度值为1.04±0.14,对照组相对灰度值为0.47±0.10,P＜0.05.结论 抑制MYCN基因的表达可以促进神经母细胞瘤细胞凋亡及分化.     

婆娑双树基因4干扰载体对儿童睾丸卵黄囊瘤的转染及干扰效果评价

目的 构建婆娑双树基因SALL4的特异性干扰载体并转染儿童睾丸卵黄囊瘤细胞,评价干扰效果,为研究SALL4基因功能提供实验工具.方法 针对不同干扰位点,设计4条特异性siRNA和1条阴性对照序列.构建SALL4干扰质粒载体pGPU6/GFP/Neo-SALL4 shRNA,分空白对照组(Blank组)、阴性对照组(NC组)、单加转染试剂组(MOCK组)、干扰组(SALL4-homo-483、SALL4-homo-1874、SALL4-homo-951、SALL4-homo-3110),分别转染体外培养的儿童睾丸卵黄囊瘤细胞,采用荧光定量PCR和Western bolt技术比较各组细胞SALL4基因mRNA及蛋白表达情况,筛选出最佳干扰序列.结果 荧光定量PCR结果显示,Blank组、NC组、MOCK组、干扰组(SALL4-homo-483、SALL4-homo-951、SALL4-homo-1874、SALL4-homo-3110) SALL4基因mRNA的表达水平分别为100％、(118.0±18.0)％、(128.0±15.0)％、(91.0±21.0)％、(25.0±8.0)％、(59.0±11.0)％、(49.0±13.0)％.SALL4-homo-951、SALL4-homo-3110相比Blank组、NC组、MOCK组mRNA表达下降,差异有统计学意义(F=3.63,P＜0.05).Western bolt的检测结果显示Blank组、NC组、MOCK组、干扰组(SALL4-homo-483、SALL4-homo-951、SALL4-homo-1874、SALL4-homo-3110)SALL4基因蛋白表达水平分别为1、1.1±0.1、1.3±0.3、1.7±0.4、0.2±0.1、0.9±0.2和0.4±0.1.相对Blank组、NC组、MOCK组,SALL4干扰组中SALL4-homo-951、SALL4-homo-3110均能降低蛋白表达,其中SALL4-homo-951降低最多,差异有统计学意义(F=7.96,P＜0.05).结论 SALL4-homo-951、SALL4-homo-3110均能有效干扰SALL4基因在儿童卵黄囊瘤中的表达,其中SALL4-homo-951干扰效果最佳,可用于下一步实验研究.     

传染性单核细胞增多症患儿免疫功能分析

目的探讨不同病期感染传染性单核细胞增多症(IM)患儿T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)及免疫球蛋白的变化。方法应用流式细胞术、免疫散射比浊法检测22例IM患儿急性期及恢复期血T淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8及B淋巴细胞CD19、NK细胞CD56的表达及IgG、IgA、IgM水平,并与25例健康儿童(健康对照组)作比较。结果 IM患儿急性期血CD3、CD4、CD8、CD19、CD56分别为(78.71±11.83)%、(18.36±6.06)%、(36.19±8.23)%、(8.15±6.41)%、(18.19±7.61)%,健康对照组分别为(60.03±10.22)%、(39.53±8.16)%、(21.55±5.96)%、(19.83±8.49)%、(16.19±6.13)%,急性期CD3、CD8与健康对照组比较均显著性升高(Pa<0.01),CD4、CD19与健康对照组比较均明显降低(Pa<0.01),CD56与健康对照组比较无明显差异(P>0.05)。IM患儿恢复期CD3、CD4、CD8、CD19、CD56分别为(64.29±10.67)%、(32.14±7.25)%、(25.47±6.07)%、(14.29±7.37)%、(16.75±6.74)%,与健康对照组比较差异均无统计学意义(Pa>0.05)。IM患儿急性期血IgG、IgA、IgM分别为(17.50±3.92)g·L-1、(1.55±0.36)g·L-1、(1.27±0.53)g·L-1,健康对照组分别为(7.91±2.82)g·L-1、(0.92±0.28)g·L-1、(1.09±0.33)g·L-1,IgG、IgA与健康对照组比较均明显偏高(P<0.01,0.05),IgM与健康对照组比较无明显差异(P>0.05);IM患儿恢复期血IgG、IgA、IgM分别为(11.30±3.07)g·L-1、(1.14±0.31)g·L-1、(1.20±0.35)g·L-1,IgG仍高于健康对照组(P<0.05),IgA、IgM与健康对照组比较差异均无统计学意义(Pa>0.05)。结论 IM患儿存在细胞免疫和体液免疫失调,检测IM患儿免疫功能水平有利于判断治疗效果,为临床应用免疫调节剂提供理论依据。     

苦参碱对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用机制

目的 探讨苦参碱对人神经母细胞瘤( NB) SH-SY5Y细胞的作用机制.方法 取对数生长期的细胞,分为对照组(含细胞、无苦参碱)及药物处理组(苦参碱质量浓度为2.0g·L-1,对细胞的作用时间分别为16 h、24 h、32 h)共4组,每组5个复孔.应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测NB SH-SY5Y细胞增殖抑制率;流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率;比色法检测Caspase-8的相对活性.采用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析.结果 MTT检测对照组及各时间点药物处理组增殖抑制率分别为(4.98±1.20)％、(11.01±0.85)％、(15.22±0.71)％和(22.31±1.45)％;FCM法检测对照组及各时间点药物处理组细胞的凋亡率分别为(5.23±1.19)％、(10.74±1.65)％、(14.00±0.98)％和(17.81±1.06)％;比色法测定各组Caspase-8的相对活性分别为(4.25±1.00)％、(10.69±1.10)％、(14.80±1.44)％和(19.80±0.97)％;以上检测各组间比较差异均有统计学意义(Pa＜0.05).结论 苦参碱可抑制人NB SH-SY5Y细胞增殖,并可通过上调Caspase-8的活性诱导NB SH-SY5Y细胞凋亡,其作用随时间的延长逐渐增强.     

肺泡Ⅱ型上皮细胞的生长状况及其转分化的鉴定

目的 观察肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)体外培养的生长状况及转分化过程.方法 通过差速贴壁法对原代培养的AECⅡ进行分离、纯化,并将AECⅡ随机分为第0天、第2天、第4天、第6天、第8天8个时间点.利用倒置显微镜观察细胞生长情况,记录细胞数目,绘制生长曲线;锥虫蓝染色观察细胞活力;流式细胞仪观察细胞生长周期和细胞凋亡情况;电子显微镜观察细胞超微结构;采用免疫荧光技术,共聚焦显微镜观察肺表面活性蛋白(SP-C)、水通道蛋白5(AQP5)的阳性表达.结果 倒置显微镜下第 0天、第2天、第4天、第6天及第8天细胞数分别为(4.02±0.99)×108L-1、(10.41±0.24)×108L-1、(27.90±1.91)×108L-1、(27.12±0.85)×108L-1及(26.29±1.59)×108L-1,第2天与第0天、第4天与第2天细胞数比较差异均有统计学意义(Pa<0.05).第2天、第4天、第6天及第8天的细胞活力分别为(97.00±0.71)%、(97.20±0.84)%、(95.00±0.71)%及(92.80±1.30)%,第6天与第4天、第8天与第6天比较差异有统计学意义(Pa<0.05).细胞周期:空气组细胞G1期、S期细胞所占比率分别在第6天、第4天最高,但各时间点与前一时间点比较差异均无统计学意义(Pa>0.05).细胞凋亡:空气组Annexin-V+/PI-亚群在第4天所占比例最高,与第2天及第6天比较差异均有统计学意义(Pa<0.05);Annexin-V+/PI+亚群细胞所占比例在第8天时最高,但与第6天比较差异无统计学意义(P>0.05),而第6天与第4天比较差异有统计学意义(P<0.05).细胞超微结构:第6天时可见介于AECⅡ和AECⅠ之间的中间状态细胞,此类细胞在细胞表面有微绒毛,但胞质内无板层小体或胞质内有板层小体但细胞表面无微绒毛.免疫荧光:第6天可见部分细胞胞质内有呈绿色荧光的SP-C阳性表达,荧光强度较第2天、第4天减弱,伴有胞膜点状分布的呈红色荧光的AQP5阳性表达,细胞表达强度不等,表达AQP5相对较弱的细胞表达SP-C的强度相对增强.结论 原代培养的AECⅡ在培养早期增殖能力最强,细胞增殖分化能力在培养晚期降低.体外培养的AECⅡ有向AECⅠ转分化的能力.     

B7同源体3经Toll样受体2依赖性机制增强肺炎链球菌脑膜炎小鼠的炎性反应和病理损伤

目的 探讨B7同源体3(B7 - H3)对肺炎链球菌(SP)脑膜炎大鼠的炎性反应和血脑屏障完整性的影响及其机制.方法 经小鼠侧脑室穿刺注入SP悬液,制备脑膜炎模型.野生型鼠分5组,分别为PBS组、SP组、SP+B7 -H3组、SP+同型单抗组、SP+B7 - H3阻断性单抗组.Toll样受体2基因剔除(TLR2-KO)鼠分3组:PBS组、SP组、SP+ B7 - H3蛋白组.术后6h、18h、30 h,麻醉其下眼眶采血法收集血清,取脑组织,制备脑组织匀浆.ELISA检测其血清TNF-α、IL-6、IL-1β和单核细胞趋化因子蛋白-1(MCP-1)水平以及脑组织匀浆中血清蛋白( Albumin)和IgG水平.结果 1.ELISA检测野生型鼠血清SP组、SP+ B7 - H3组注射18 h后TNF-α、IL-6和MCP-1的表达及30 h后TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1的表达均较PBS组显著升高(Pa＜0.05);SP+同型单抗组与SP组比较,各时间点各炎性因子的表达差异均无统计学意义(Pa＞0.05);SP +B7- H3组注射18h后MCP-1的表达及30 h后TNF-α和IL-6表达均显著高于SP组[(42.010±3.883) ng·L-1vs(29.620±3.830) ng· L-1;(37.550±3.232)ng· L-1vs (24.570±2.377) ng·L-1;(66.160±5.766) ng·L-1vs (48.630±4.418) ng·L-1,Pa＜0.05];SP+ B7 - H3阻断性单抗组注射30h后,TNF-α和IL-6的表达均显著低于SP组[(18.680±1.798) ng·L-1vs(24.570±2.377) ng·L-1;( 37.180±3.150) ng·L- 1vs (48.630±4.418) ng· L-1,Pa＜0.05].2.ELISA检测脑组织匀浆:SP组、SP+ B7 - H3组注射18h、30h后Albumin、IgG的表达较PBS组均显著升高(Pa＜0.05);SP+同型单抗组与SP组比较,各时间点Albumin、IgG的表达差异均无统计学意义(Pa＞0.05);SP+ B7 - H3组注射18 h、30 h后脑组织匀浆Albumin的表达及30 h后脑组织匀浆IgG的表达均显著高于SP组[(59.090±4.184) μg· g-1vs ( 35.450±4.256) μg·g-1;( 59.890±4.701)μg·g-1 vs (43.790±3.508) μg·g-1;(36.220±2.775)μg·g-1 vs(25.440±2.620)μg·g-1,Pa＜0.05].3.SP+ B7 - H3阻断性单抗组注射后18 h、30 h Albumin的表达及30 h IgG的表达显著低于SP组[(20.590±1.720) μg·g-1vs(35.450±4.256) μg·g-1;(28.650±3.063) μg· g-1vs(43.790±3.508)μg·g-1;(17.380±1.595) μg·g-1vs(25.440±2.620) μg·g-1,Pa＜0.05].3.TLR2-KO鼠血清和脑组织匀浆的ELISA检测显示:SP +B7-H3组较SP组各监测指标的表达在任何时间点的差异均无统计学意义(Pa＞0.05).结论 B7 - H3通过TLR2依赖性机制促进SP诱导的脑膜炎小鼠的炎性反应和血脑屏障的破坏.