RNAi的分子机制及其应用的研究进展

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是最近几年发现和发展起来的一门新兴的在转录水平上的基因阻断技术。它与反义RNA技术有很大不同，是一种双链RNA（Doublestranded RNA,dsRNA）分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程，也就是序列特异性的转录后基因沉默。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ftsZ基因高效反义肽核酸序列筛选#br# 及其体外抗菌活性观察

目的 筛选出能与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ftsZ基因紧密结合的反义肽核酸序列，评价其体外抗菌活性。方法 选用两种计算机软件(Mfold、RNA Structure 5.2)和斑点杂交筛选出最佳反义序列PNA，并连接穿膜肽(cell penetrating peptide, CCPs)形成肽-PNA(peptide-PNA, PPNA)，另设一条与最好序列有3个错配碱基的肽核酸序列作为对照，连接穿肽形成错配的肽肽 核酸(scrambled peptide-PNA, Scr PPNA)。将不同浓度的肽肽核酸处理MRSA后，间隔1h测定A600值同时做平板菌落计数，观测其 对细菌生长的抑制作用。结果 斑点杂交实验结果表明，计算机辅助软件设计的11条反义寡核苷酸序列中，有4条序列显示强弱 不同的杂交信号，第3号探针杂交信号最强，而1条正义序列没显示任何信号，PPNA在30和40μmol/L分别具有抑菌作用和杀菌 作用，并具有浓度依赖性，而Scr PPNA在高浓度时对细菌也无生长抑制作用，验证了肽核酸的特异性。结论 成功的筛选出一 条在体外对MRSA的生长有显著的影响的反义肽核酸序列，有望为抗MRSA感染患者提供新的治疗方案。     

体外导入IL-2R反义RNA表达质粒对小鼠脾细胞活化增殖的影响

目的　观察导入白细胞介素 2受体 (IL 2R)反义RNA真核表达质粒对体外培养的小鼠脾细胞活化增殖的影响及其机制的探讨。方法　用粘附辅助脂质体法把IL 2R反义RNA真核表达质粒转染脾细胞 ,用丝裂原刺激脾细胞活化增殖 ,MTT法检测细胞生长情况。狭线杂交法检测IL 2RmRNA的表达水平 ,流式细胞仪检测IL 2R的蛋白表达水平。结果　转染各重组质粒后 ,脾细胞的生长增殖受到明显抑制 ,且 pcAnti mIL 2Rαβ与 pciAnti mIL 2Rαβ组抑制率较 pcAnti mIL 2Rα及pcAnti mIL 2Rβ组的大 ,pcAnti mIL 2Rα组抑制率较pcAnti mIL 2Rβ的大。转染各重组质粒对NIH3T3细胞生长增殖无影响。转染各重组质粒后IL 2RmRNA及蛋白表达水平明显降低。结论　IL 2R反义RNA能有效抑制体外培养的小鼠脾细胞的生长 ,IL 2Rαβ融合基因反义RNA较α、β单基因反义RNA的抑制率高 ,IL 2Rα反义RNA较 β反义RNA抑制率高。初步推断 ,IL 2R反义RNA抑制细胞生长的作用是特异的 ,只针对功能性表达IL 2R的细胞。反义RNA封闭IL 2R的表达很可能是其抑制脾细胞活化增殖的直接原因     

携带反义MDR1基因的逆转录病毒载体的构建和表达

目的　建立逆转录病毒介导的反义多药耐药MDR1基因转移体系 ,探讨反义RNA封闭白血病耐药细胞中MDR1基因表达的能力。方法　逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)法从白血病耐药细胞株HL 6 0 /VCRmRNA中扩增出含有启始密码子ATG的 5 2 4bp的MDR1基因cDNA片段 ,反向插入逆转录病毒载体 pLXSN ,通过脂质体转和乒乓感染单、双噬型包装细胞GP +E86和GP +envAM 12 ,以双嗜型病毒上清感染白血病耐药细胞K5 6 2 /MDR ,半定量RT PCR和流式细胞术(FCM)分析MDR1基因转录和P 糖蛋白 (P gp)的表达。 结果　酶切、PCR和DNA测序证实反义MDR1基因重组逆转录病毒载体 pLASSN构建正确 ;双嗜型病毒生产细胞的滴度为 1 3× 10 5CFU/ml,巢式PCR和补救分析均未检测到辅助病毒存在 ;PCR和RT PCR分析证实病毒生产细胞和反义修饰的耐药细胞K5 6 2MDR/LASSN中均有反义MDR1基因整合和MDR1基因反义RNA的转录 ;FCM分析K5 6 2MDR/LASSN细胞中P gp表达强度和表达率比对照细胞均有明显下降。 结论　逆转录病毒介导的反义基因转移系统安全有效 ,可用于肿瘤耐药逆转的研究     

以腺病毒为载体表达猪α(1,3)半乳糖基转移酶反义RNA抑制Galα(1,3)Gal抗原表位的表达

目的:尝试以反义RNA的方法抑制Galα(1,3)Gal抗原表位(gal抗原)的表达.方法:以人腺病毒载体表达猪α(1,3)半乳糖基转移酶基因的反义RNA.流式细胞术比较H血型抗原和gal抗原的表达水平.结果:构建了表达反义RNA的重组腺病毒载体Ad5anti-sGT600和Ad5anti-sGT1100.反义RNA的表达使NIH3T3细胞表面的gal抗原表位下降约30％.另外,反义RNA与人分泌型α(1,2)岩藻糖基转移酶的共同作用可使gal抗原表位的水平进一步下降.结论:重组腺病毒Ad5anti-sGT600和Ad5anti-sGT1100可有效降低gal抗原表位的表达.     

RNA组合干扰技术及其在肿瘤基因治疗中的应用

RNA干扰(RNAi)为基因治疗提供了一个全新的思路。但单一的RNAi治疗只针对单个基因,因而最终无法治愈多基因变异引起的肿瘤。为了克服RNAi单基因治疗的不足,研究人员提出了RNA组合干扰(combinatorial RNA interference,coRNAi)的治疗策略。coRNAi通过联合应用针对单个或多个靶基因的RNAi诱发物以及其他RNA或蛋白沉默因子实现沉默靶基因、抑制肿瘤生长和促进肿瘤细胞凋亡。本文重点介绍了coRNAi的主要联合方式以及在肿瘤基因治疗中的研究进展。     

RNA干扰下调宫颈癌Hela细胞Survivin基因对Hela细胞增殖能力影响的研究

目的:通过RNA干扰技术下调宫颈癌Hela细胞Survivin基因表达,观察Hela细胞增殖能力的变化情况。方法:当细胞生长至70.0%左右覆盖率时进行脂质体转染,细胞分为空白组(Hela细胞未转染组)、阴性对照组(转染空质粒)、实验组[Survivin-siRNA(+)质粒转染Hela细胞]三组。采用脂质体介导的方法将特异针对Hela细胞Survivin基因的干扰RNA转染入细胞后不同时间观察细胞生长形态的变化,记录转染后第1天到第5天每天的生长情况并绘制生长曲线,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验记录24 h,48 h,72 h活细胞数量,总结分析细胞生长情况。结果:RNA干扰后出现细胞生长速度减慢,实验组与空白组比较,从第3天到第5天空白组细胞数明显高于实验组(第3天P<0.05,第4天、第5天P<0.01)。实验表明,干扰24 h后实验组活细胞数量与空白组、阴性对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05),48 h及72 h实验组活细胞数明显低于空白组与阴性对照组(P<0.01)。结论:Survivin基因沉默能够有效特异地抑制宫颈癌Hela细胞的体外恶性增殖能力,有利于细胞的凋亡,Survivin基因可以作为宫颈癌基因治疗的靶点。     

PC12细胞SLC6A4基因沉默稳转细胞系的建立及SLC6A4基因沉默对缺氧PC12细胞凋亡的影响

目的 构建SLC6A4基因RNA干扰（RNAi）-短发夹RNA（shRNA）慢病毒表达载体,建立慢病毒介导沉默SLC6A4基因的PC12细胞稳转细胞系,检测SLC6A4基因沉默对缺氧诱导的细胞凋亡的影响。方法 设计合成3条针对SLC6A4基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,在293T细胞中共转染进行慢病毒包装。转染大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞,荧光显微镜观察GFP荧光,筛选最佳shRNA干扰序列,应用嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。应用RT-PCR方法检测SLC6A4基因的表达,Western blot方法检测蛋白5-HTT的表达变化,流式细胞术检测沉默SLC6A4基因对缺氧诱导的PC12细胞凋亡的影响。结果 成功构建SLC6A4-shRNA慢病毒载体并转染PC12细胞,与正常对照组及干扰对照组比较,干扰组细胞内SLC6A4基因和蛋白表达明显降低（P<0.01）,证实慢病毒载体能够有效沉默SLC6A4基因,沉默SLC6A4基因可以逆转缺氧诱导的细胞凋亡。结论 通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默PC12细胞SLC6A4基因,沉默SLC6A4基因可以逆转缺氧诱导的细胞凋亡。     

Correction of frameshift mutations with tailed duplex DNAs

Tailed duplex (TD) DNAs, prepared by annealing an oligonucleotide to a several-hundred-base single-stranded (ss) DNA fragment, correct a base-substitution mutation with high efficiency. In the present study, the abilities of TD fragments to correct single-base insertion and deletion mutations were examined, using hygromycin-resistance and enhanced green fluorescent protein fusion (Hyg-EGFP) genes inactivated by +G and -C frameshift mutations. The 5'-TD and 3'-TD DNA fragments were co-transfected with plasmid DNA containing the inactivated Hyg-EGFP gene into CHO-K1 cells, and the gene correction efficiencies were determined by introducing the plasmid DNA recovered from the transfected cells into Escherichia coli cells. In contrast to their efficiencies for the substitution mutation, the gene correction abilities of the TD fragments were relatively low. The correction efficiencies by the TD fragments were apparently higher than that by a ss DNA fragment, one of the DNA fragments employed for gene correction. These results suggest that the TD fragments have the potential to correct frameshift mutations, although further improvement is required.     

惠东地区产ESBLs大肠埃希菌中TEM型β-内酰胺酶临床研究

目的探讨惠东地区产ESBLs大肠埃希菌中TEM型β-内酰胺酶分型、耐药性及基因突变类型。方法收集86例产ESBLs大肠埃希菌菌株,分析其基因类型;对产ESBLs大肠埃希菌TEM型进行耐药试验及基因突变类型的相关检测。结果 86例产ESBLs大肠埃希菌菌株中,TEM基因型49株(57.0%),SHV基因型16株(18.6%),CTX-M基因型21株(24.4%);TEM分型主要有TEM-1、TEM-2、TEM-105、TEM-116和TEM-128,其中TEM-1和TEM-2型例数最多,分别为18例和17例;TEM基因突变类型主要为缺失和碱基置换;产ESBLs大肠埃希菌菌株TEM型仅对亚胺培南/西司他丁和美罗培南敏感。结论探讨惠东地区产ESBLs大肠埃希菌基因突变分型及药敏试验对抗菌药物的选择具有重要的临床价值。     

枯草芽孢杆菌guaB基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

克隆枯草芽孢杆菌guaB基因,构建穿梭表达载体,使其在大肠杆菌中获得表达,为构建鸟苷高产工程菌奠定基础。从枯草芽孢杆菌JSIM-G-518基因组扩增出guaB基因,将其连接到pMD19-T上,得到重组质粒pMD-guaB,进行测序和Blast比对分析。该重组质粒经PstI、BamHI双酶切,获得guaB片段连接至pHP13载体上,构建穿梭表达载体pHP13-guaB,并采用双酶切电泳进行鉴定。将该载体转化入大肠杆菌BL21中,通过SDS-PAGE电泳检测guaB基因的表达效果。克隆的guaB基因长度为1 510 bp,与GenBank登录的枯草芽孢杆菌同源性为99%,编码500个氨基酸,确认为控制IMP脱氢酶的基因。穿梭载体pHP13-guaB经双酶切后产生1 510 bp和4.9 kb两个期望的目的条带。SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量的大小为52.9 k,与预期的IMP脱氢酶分子量一致,且该目的蛋白的表达效果比对照组更明显。论文成功实现了枯草芽孢杆菌guaB基因在大肠杆菌中的表达。     

人α1微球蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的构建人α1微球蛋白（α1-MG）基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达、纯化,为制备仅。一MG诊断试剂中原料抗体、标准品及质控品奠定基础。方法从人胚胎肝脏中提取总RNA,利用反转录聚合酶链反应技术扩增α1-MG基因。然后克隆至PQE30表达载体,转化大肠杆菌M15中进行表达,并经镍固定金属亲和层析进行纯化,蛋白质印迹进行免疫学鉴定。结果获得了与Genebank报道一致的仪。一MG基因片段,成功构建了成熟人α1-MG的原核表达载体PQE30-α1-MG,质粒转化大肠杆菌并经1mmol／L异丙基硫代半乳糖诱导5h后,可表达相对分子质量约25000的外源蛋白,表达的α1-MG大部分在包涵体中,并可经镍固定金属亲和层析纯化,纯化有效率95％以上,BCA法测定纯化的α1-MG蛋白含量为25mg／L。蛋白质印迹表明,该蛋白可与抗人仅．一MG天然抗体反应。结论通过基因工程方法可获得高效表达的重组α1-MG蛋白,该蛋白具备同天然仅。一MG相同的生物学特性,为下一步进行α1-MG相关研究及应用奠定基础。     

Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白 ROP16的基因克隆表达及生物信息学分析

目的：构建弓形虫Chinese 1基因型TgCtWh3（以后均简称Wh3）株棒状体蛋白（ rhoptry protein ,ROPs）16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至pMD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3 D结构。结果各组均PCR扩增出约2．1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以pET-28a和pEGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。     

安徽省产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌的耐药性及基因型分析

目的 了解2007年安徽地区产质粒介导AmpC酶的大肠埃希菌枪出率及产酶株基因型.方法 三维实验进行AmpC酶筛选;并行转移接合实验,PCR检测AmpC酶基因,琼脂稀释法进行药物敏感试验.结果 21株大肠埃希菌三维实验阳性,占所有临床分离菌株的5.9%(21/355),19株经PCR检测携带ampC基因,16株转移接合成功,经序列分析表明,9株CIT阳性结果,6株DHA阳性结果,3株EBC阳性结果;1株同时携带EBC及DHA基因.其中有1株EBC型新基因被枪出(序列号为FJ237369);药敏结果显示临床分离菌株及接合子对多种抗菌药物耐药,对头孢吡肟,亚胺培南,美罗培南相对较敏感.结论 安徽地区大肠埃希菌产质粒介导AmpC酶以CIT型和DHA型为主,同时存在变异型,临床可选用第四代头孢菌素类抗菌药物,碳青霉烯类抗菌药物抗感染治疗.     

浸麻芽孢杆菌环糊精葡糖基转移酶的克隆与表达

目的获取浸麻芽孢杆菌环糊精葡糖基转移酶基因并在大肠杆菌中表达。方法构建浸麻芽孢杆菌环糊精葡糖基转移酶表达质粒,转化大肠杆菌DH5α,筛选获得阳性重组菌株。经42℃诱导后,检测酶活性。结果浸麻芽孢杆菌环糊精葡糖基转移酶在大肠杆菌中成功表达,表达量达3 U/mL。结论浸麻芽孢杆菌环糊精葡糖基转移酶可以在大肠杆菌中高效表达。     

大肠杆菌过氧化DNA损伤及红景天酪醇对其抑制作用

本实验测定酪醇对经过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）共处理和后处理后的大肠杆菌ＰＱ６６及其ｏｘｙＲ基因缺失突变体ＯＧ４００的过氧化损伤的抑制作用，并比较了二甲亚砜（ＤＭＳＯ）的作用。结果显示，酪醇对ＰＱ６６和ＯＧ４００的过氧化损伤都有抑制作用，而且对ＯＧ４００的抑制作用明显高于ＰＱ６６。这说明酪醇的抑制作用与ｏｘｙＲ基因有关，但不存在必然的联系。此外酪醇在细菌细胞内外都有抑制作用。在细胞外抑制效果约为２６００倍浓度的ＤＭＳＯ。     

亚抑菌量多粘菌素B在大肠埃希氏菌和白色念珠菌混合感染小鼠中的作用

探讨亚抑菌量多粘菌素B对大肠埃希氏菌和白色念珠菌混合感染小鼠病情的影响。建立小鼠大肠埃希氏菌、白色念珠菌单独及混合感染模型，以亚抑菌量多粘菌素B拮抗内毒素活性，观察各组小鼠死亡率、血浆内毒素水平，肺组织中白色念珠菌菌落数及中性粒细胞杀菌能力。结果：大肠埃希氏菌和白色念珠菌混合感染组小鼠死亡率明显高于各自单独感染组（P＜0．05）；大肠埃希氏菌和白色念珠菌混合感染组24h后血浆内毒素水平明显高于大肠埃希氏菌单独感染组（P＜0．01）；大肠埃希氏菌和白色念珠菌混合感染组24h和48h后白色念珠菌菌落数明显高于白色念珠菌单独感染组（P＜0．01）；大肠埃希氏菌和白色念珠菌混合感染组小鼠中性粒细胞杀菌能力明显低于两者单独感染组（P＜0．01）；亚抑菌量多粘菌素B能明显降低混合感染组小鼠死亡率、血浆内毒素水平及肺组织中菌落数，并能增强混合感染组小鼠中性粒细胞杀菌功能（P＜0．05）。结论：亚抑菌量多粘菌量B可改善大肠埃希氏菌和白色念珠菌混合感染小鼠病情。     

四季青水煎液体外抗内毒素、抗菌和体内抗炎作用

目的 研究四季青水煎液的抗内毒素、抗菌和抗炎作用,揭示四季青清热解毒作用的药效学特点。方法 采用体外鲎试剂凝集实验方法检测其抗内毒素作用;采用琼脂二倍稀释法测定四季青水煎液以及与头孢噻肟、左氧氟沙星和庆大霉素联合使用时对25株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase, ESBLs)大肠埃希菌、非产ESBLs大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC);采用二甲苯致小鼠耳廓炎症肿胀法观察其抗炎作用。结果 四季青水煎液在生药浓度6.25~100mg/mL时具有抗内毒素作用;对受试菌株MSSA、MRSA的MIC范围均为8~33mg/mL,对产ESBLs大肠埃希菌及非产ESBLs大肠埃希菌的MIC范围均为33~>133mg/mL,对铜绿假单胞菌的MIC为33~133mg/mL;与头孢噻肟、左氧氟沙星和庆大霉素联合使用时抗菌活性有相加作用,分级抑菌浓度(fractional inhibitory concentration, FIC)指数范围为0.5相似文献